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    菊苣種子中五種生物活性成分檢測分析

    2023-10-30 03:06:32阿麗米熱買買提吾買爾江牙合甫陳李鑫阿里米熱阿不來提王曉杰阿卜杜薩塔爾斯馬依
    湖北畜牧獸醫(yī) 2023年6期
    關(guān)鍵詞:菊苣定容蒸餾水

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    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室,烏魯木齊 830052;2.鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司,鄭州 450000;3.哈密阿沙爾診所,新疆哈密 839000)

    菊苣(Cichorium intybusL.)為菊科(Asteraceae)菊苣屬多年生溫帶藥用植物,在新疆阿勒泰、烏魯木齊、塔城、哈巴河、福海、伊寧、哈密等地區(qū)分布較廣[1]。菊苣全草(根、莖、葉、種子)入藥,其活性成分具有調(diào)節(jié)血脂、保肝、治療黃疸等功效,可明顯改善高嘌呤飲食引起的肥胖、高尿酸血癥疾病[2,3]。此外莖、葉是可食用的藥食兩用資源。在日常生活中,菊苣根、葉、子常用來泡水服用,市場有較多的菊苣茶相關(guān)產(chǎn)品。

    菊苣全草植物含有酚酸類、萜類、糖類、黃酮類、苯丙素類、氨基酸、微量元素等多種化合物,已被廣泛研究、開發(fā)利用,具有較高的研究價值[4]。由于植物所生長的地理位置、環(huán)境、品種、種植方式等不同,植物所含的藥物活性成分、含量存在一定的差異。因此,本研究分析采自新疆哈密市菊苣種子中總多糖、總黃酮、總多酚、總皂苷、總生物堿的含量,為該地區(qū)菊苣種子生物活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菊苣種子由新疆哈密阿薩爾生物科技有限公司提供,經(jīng)哈密市伊州區(qū)花園鄉(xiāng)衛(wèi)生院卡哈爾·司馬義鑒定為菊苣種子。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 試劑 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁、沒食子酸、駱駝蓬堿、香草醛、硝酸鋁購自北京索萊寶科技有限公司;福林試劑購自北京酷來博科技有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、硫酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;溴化鉀購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。鹽酸、碳酸氫鈉、高氯酸、冰醋酸、甲醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣購自阿拉丁生物試劑有限公司。

    1.2.2 儀器 UV-5500 型紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,南通經(jīng)典玻璃儀器有限公司;恒溫水浴鍋,金壇市醫(yī)療儀器廠;WD-9415E 型超聲波清洗器,北京六一生物科技有限公司;其他相關(guān)儀器、耗材由新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室提供。

    1.3 方法

    1.3.1 菊苣種子水提物的處理 菊苣種子清洗后陰涼24 h,烘干粉碎,30 目篩網(wǎng)過濾,精準(zhǔn)稱取菊苣種子粉末100 g,按照菊苣種子∶滅菌蒸餾水1∶15 的比例加入蒸餾水,70 ℃冷凝回流2 h,經(jīng)真空抽濾,液體備用(冷藏),殘渣以1∶10 料液比70 ℃冷凝回流1.5 h,真空抽濾,合并上述濾液,濃縮,取濃縮液置烘干箱(45 ℃)烘干,即可獲得菊苣種子粗提物,置于-20 ℃冰箱備用。

    1.3.2 菊苣種子水提物的成分測定

    1)總多糖的測定。采用苯酚-硫酸顯色法測定,精確稱取葡萄糖、菊苣標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg,蒸餾水定容,最終獲得濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液、測試液。依次吸取0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液、測試液0(蒸餾水代替)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 定容至2.0 mL,取5%苯酚、5 mL 濃硫酸依次加入定容瓶,混勻、冷卻,30 ℃水浴20 min。用紫外可見分光光度計于波長490 nm處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算總多糖含量[5]。

    2)總生物堿的測定。采用鹽酸法測定,精確稱取駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 用蒸餾水定容,獲得濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液;取10 mL 標(biāo)準(zhǔn)液用0.1 mol/L的HCl定容,獲得0.02 mg/mL 溶液;依次吸取1、2、3、4、5、6 mL 溶液至玻璃試管中,添加0.1 mol/L HCl 至試管中溶液總量為10 mL,振蕩混勻,分光光度計345 nm 處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子粗提物5 mg 用蒸餾水定容,同步以上方法測定總生物堿含量。

    3)總 黃 酮 的 測 定。采 用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法測定,精確稱取蘆丁10 mg,用80%乙醇定容,獲得濃度為0.4 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液;依次吸取0(蒸餾水代替)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液至試管中,分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL 混勻后靜置6 min;加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,混勻后靜置6 min;各管加入4% NaOH 溶液4 mL,蒸餾水定容至10 mL,靜置10 min;分光光度計510 nm 處測定吸光度,根據(jù)測得的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子粗提物10 mg,同步以上方法測定總黃酮含量。

    4)總皂苷的測定。使用香草醛-高氯酸顯色法測定,精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,用甲醇定容,獲得濃度為0.8 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;依次吸取0(蒸餾水代替)、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液至試管中,加入5%香草醛-冰乙酸0.2 mL,振蕩混勻后加入高氯酸0.6 mL,試管封口并置于65 ℃恒溫水浴鍋20 min;冷卻后吸入冰乙酸5 mL,振蕩搖勻,用蒸餾水定容至10 mL,搖勻。分光光度計550 nm 處測定吸光度,根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子水提物20 mg,同步以上方法測定總皂苷含量。

    5)總多酚的測定。使用Folin 顯色法測定,精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 置于100 mL 容量瓶,蒸餾水定容;依次吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 溶液置于10 mL 容量瓶,緩慢吸入Folin 試劑1 mL,混勻;吸入12% NaHCO3溶液2 mL 溶液,蒸餾水定容,振蕩混勻,錫箔紙避光放置1 h,分光光度計765 nm 處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子水提物25 mg,置于容量瓶,同步以上方法測定總多酚含量。

    1.3.3 可信度檢測 為保證結(jié)果的可信度,分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加標(biāo)回收率檢測試驗。

    1)精密度檢測。分別配制標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖、駱駝蓬堿、蘆丁、齊墩果酸、沒食子酸1.25、1.00、1.00、1.20、1.50 mL,按照相對應(yīng)的顯色方法顯色,分別于490、345、510、550、765 nm 測定吸光度,每種標(biāo)準(zhǔn)液均測定6 次,計算標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

    2)穩(wěn)定性檢測。測得顯色后的5 種標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的最大吸光度,在最大波長處,每隔0.5 h 測定其吸光度,測定6 次,并計算RSD。

    3)重復(fù)性檢測。取同一批菊苣種子粉碎后,過20 目篩,按照5 種樣品液制備方法,分別配制5 組樣品液,每組6 份,于相應(yīng)波長處測定吸光度,計算RSD。

    4)加標(biāo)回收率。使用重復(fù)性試驗中剩余的樣品液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中的濃度梯度隨機抽取3 個濃度,每組按相同體積顯色,在每種成分的最大波長處測定其OD值,計算回收率、平均回收率及RSD。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 可信度檢測

    如表1 所示,標(biāo)準(zhǔn)液總多糖、總生物堿、總黃酮、總皂苷、總多酚精密度檢測RSD分別為1.74%、1.83%、1.73%、0.64%、1.71%,符合檢測要求,精密度良好;穩(wěn)定性檢測中3 h 內(nèi)5 種標(biāo)準(zhǔn)品、樣品成分均具有較強的穩(wěn)定性;重復(fù)性檢測RSD分別為0.79%、2.35%、2.03%、2.10%、1.79%,符合檢測要求,測定方法重復(fù)性良好,表明該檢測方法可靠,具有參考應(yīng)用價值。

    表1 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果 (單位:%)

    2.2 菊苣種子5 種活性成分含量測定

    如表2 所示,菊苣種子5 種活性成分測定中,活性成分含量大小依次為總多糖(29%)>總黃酮(19%)>總多酚(11%)>總皂苷(8%)>總生物堿(2%)。由此可見,菊苣種子中總多糖、總黃酮含量較高,合理利用具有很大的經(jīng)濟價值。

    表2 菊苣種子5 種活性成分含量回歸方程

    3 討論

    菊苣所含生物活性物質(zhì)具有降血糖、抗氧化、增強免疫、降血脂等多種功效,被40 多個國家認(rèn)可、允許作為食品的營養(yǎng)增補劑。菊苣種植范圍廣、藥材廉價、安全性高,菊苣露、護(hù)肝布祖熱顆粒(種子∶根為2∶1)[6]、炎消迪娜兒糖(種子∶根為1∶2)[7]、復(fù)方木尼孜其顆粒(種子∶根為1∶1)[8]等產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于脂肪肝、肝炎、調(diào)節(jié)體液等疾病。臧薇等[9]報道毛菊苣粗提物(種子∶根為1∶2 和2∶1)對HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生的抑制率、凋亡率高于單個給藥劑量,顯著增加S期細(xì)胞占比和降低G2 期細(xì)胞占比。

    通過已報道菊苣相關(guān)文獻(xiàn)分析,菊苣中多糖類、黃酮類、多酚類、皂苷類、生物堿類生物活性物質(zhì)含量均有一定的差異,一方面與菊苣所生長的地理環(huán)境、種植年限、密度、野生、栽培、品種因素有關(guān)。卓瑪草等[10]選取菊苣Puna Ⅱ和Choice 2 個品種,研究黃土高原產(chǎn)草量及營養(yǎng)品質(zhì),結(jié)果表明品種Puna Ⅱ的營養(yǎng)價值高于Choice。王貴等[11]選取菊苣TOPSCORE 品種分析不同種植密度對根用菊苣表型性狀及營養(yǎng)品質(zhì)的影響,結(jié)果顯示種植密度為1.33×105株/hm2的菊苣營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)含量較高。另一方面與現(xiàn)代提取工藝、溶劑、儀器等因素有關(guān)。本研究區(qū)域菊苣種子中總多糖(29%)含量最高,其次為總黃酮(19%)。吳雨龍[12]報道菊苣多糖分離率為46.75%,由果糖、葡萄糖、山梨醇等成分組成。薛順[13]采用水提法測得菊苣粗多糖分離率為18.93%。研究表明,菊苣多糖能夠促進(jìn)胰島素分泌,影響糖代謝酶的活性,抑制糖異生,改善腎臟過氧化狀態(tài),起到保護(hù)腎臟的作用[14,15]。莊紅艷等[16]報道菊苣中多糖含量為53.82%,不同產(chǎn)地、不同批次菊苣總多糖含量存在差異。許芳等[17]報道優(yōu)化超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖獲得率為46.75%。

    黃酮類化合物是藥用植物產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、抗炎、改善心血管等多種作用。菊苣檢測出黃酮類成分40 余種,其中以黃酮醇、黃酮、花色素和苷類為主[13]。趙月等[18]通過響應(yīng)面法確定超聲-微波協(xié)同萃取栽培菊苣種子總黃酮,結(jié)果表明總黃酮提取得率為93.23 mg/g,栽培菊苣種子中的主要黃酮成分是綠原酸和洋薊素,洋薊素對DPPH 自由基的清除作用較大。劉馨瑤等[19]采用加熱回流法提取結(jié)球菊苣中總黃酮取率為4.11%;陳永平[20]報道菊苣根采取超聲波、復(fù)合酶解提取方法測得總黃酮得率為(5.43±0.12)mg/g。翁馨等[21]對毛菊苣地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行研究,分離出新的黃酮苷化合物槲皮素-3-O-[6"-O-(3-乙氧基-1,3-二氧代丙基)]-β-D-吡喃葡糖苷(1)。

    多酚類化合物有良好的清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用[22]。菊苣含有菊苣酸、綠原酸等多酚類物質(zhì),其中綠原酸具有抗氧化作用,菊苣酸具有增強免疫功能、抗炎作用。尚紅梅等[23]報道菊苣種子總酚含量為10.17 mg/g,菊苣酚類化合物與菊苣根的抗氧化活性具有較大的關(guān)系。菊苣中含有咖啡因等生物堿,略帶苦味,能增加浸煮液色澤,提高咖啡的溶解質(zhì)量,紀(jì)可[24]報道菊苣根咖啡因提取率為2.14 mg/g。因此,常用作咖啡的添加物或代用品。

    菊苣還有秦皮甲素、秦皮乙素、山萵苣素和山萵苣苦素等具有特殊生物活性的物質(zhì),也是菊苣保健功能的重要指標(biāo)[25]。葉銀松等[26]報道菊苣成分山萵苣素、山萵苣苦素具有較強的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,尤其對乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用較強。楊建等[27,28]報道毛菊苣種子中山萵苣素、山萵苣苦素、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、菊苣酸含量分別為0.381 5、0.331 8、0.197 0、1.714 0、1.247 0 mg/g。布威海麗且姆·阿巴拜科日等[29]認(rèn)為毛菊苣莖、根、葉秦皮乙素含量隨著生長發(fā)育進(jìn)程而發(fā)生變化,6—7 月枝葉茂盛時秦皮乙酸含量最高。努力比亞·阿不都克尤木等[30]報道毛菊苣中分離得到的母菊素可阻斷大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6 的TGF-β/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制HSC-T6 激活,防止大鼠肝纖維化現(xiàn)象。

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