血小板輸注無效患者HLA-Ⅰ類抗體產(chǎn)生率及其eplets 的分析*

黃晶晶，何紅紅，王儀含，陸 榮，左元玲，成 婧，蔣 敏，湯龍海*

(1 江蘇省蘇州市中心血站，蘇州 215006；2 蘇州大學附屬第一醫(yī)院輸血科)

近年來在尋找提高血小板輸注效果、降低血小板輸注反應發(fā)生率的方法方面取得了重要進展，包括輸注ABO 同型血小板、去除血小板輸注成分中的白細胞等[1]，但血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness,PTR)依舊是一個重要的臨床問題，影響著多達14%的血液病患者[2]。發(fā)生PTR 的患者一般預后都較差，包括致死性出血增加、生存率降低等[3]。PTR 包括免疫性PTR 和非免疫性PTR，其中約90%的免疫性PTR 與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-Ⅰ類抗體有關[4]。

HLA 抗體對HLA 等位基因間因氨基酸差異而導致結構差異的抗原表位具有特異性。2006 年R.J.DUQUESNOY[5]提出了“eplet”的概念，eplets 的定義類似于功能表位的概念，它是HLA 分子表面能夠誘導抗體應答所需的最小的氨基酸構型，所涉及到的氨基酸殘基都在3.0～3.5 A°內(nèi)。Eplets 決定著抗原多態(tài)性決定簇的特異性，每個HLA 抗原都被視為一串eplets 的集合。與抗原水平匹配相比，基于eplets 的匹配被認為是改善免疫結局、減少抗體形成的更精確的策略。

為探究PTR 患者體內(nèi)HLA-Ⅰ類抗體產(chǎn)生的原因，本研究對133 例PTR 的血液病患者體內(nèi)的HLA-Ⅰ類抗體進行統(tǒng)計，并對檢出抗體對應等位基因的eplets 進行比較分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選取2021 年8 月—2022 年12 月蘇州大學附屬第一醫(yī)院收治的133 例出現(xiàn)PTR 的血液病患者，其中急性白血病63 例，骨髓增生異常綜合征32 例，再生障礙性貧血49 例。

1.2 試劑與儀器 LUMINEX 200(LUMINEX)及配套試劑LABScreenTMSingle Antigen HLA Class I 試劑盒(One Lambda)。

1.3 HLA-Ⅰ類抗體檢測 對133 例PTR 患者進行HLA-Ⅰ類抗體檢測，參照試劑說明書操作，在LUMINEX 200 上讀取數(shù)據(jù)，使用配套軟件分析解讀數(shù)據(jù)結果。按照微球的平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)判定抗體結果，MFI≥10 000 為強陽性，5 000～＜10 000 為陽性，500～＜5 000 為弱陽性，＜500 為陰性。對所有病例的檢測結果進行匯總分析。

1.4 檢出HLA-Ⅰ類抗體對應等位基因的eplets 分析 對檢出的HLA-Ⅰ類抗體所對應等位基因進行高分辨率eplets 分型，統(tǒng)計抗體出現(xiàn)頻率，并與該抗體對應基因型在人群中出現(xiàn)頻率(數(shù)據(jù)見http://www.epitopes.net/index.html)進行比較分析?？贵w出現(xiàn)頻率=該基因型抗體出現(xiàn)次數(shù)/抗體出現(xiàn)總例數(shù)。

HLA 錯配的eplets 數(shù)目與患者產(chǎn)生抗體的概率之間存在明確關系[6]，但每個eplet 的免疫原性并不相同，并不是每個eplet 表位都具有相同的免疫原性潛能。本研究參考G.H?NGER 等[7]的研究方法，對eplets 賦予免疫原性評分，每個eplet 評分=eplet 特異性抗體的發(fā)生率除以eplet 錯配發(fā)生率，其中評分＞0.2 的eplets 是高免疫原性eplets。

2 結果

2.1 PTR 患者HLA-Ⅰ類抗體強度分析 133 例PTR 患者中，共有86 例(64.66%)血清中檢測出HLA-Ⅰ類抗體。其中49 例體內(nèi)同時存在強陽性、陽性和弱陽性抗體，62 例體內(nèi)同時存在陽性和弱陽性抗體。

2.2 HLA-Ⅰ類抗體出現(xiàn)頻率與抗體對應等位基因在人群中出現(xiàn)頻率的比較 由表1 可見，86 例HLA-Ⅰ類抗體陽性患者中，共檢測出30 種HLA-A基因型抗體和48 種HLA-B 基因型抗體，其中A*68:02、A*23:01、A*25:01、A*24:03、A*32:01、A*34:02、A*68:01 等和B*57:01、B*15:12、B*49:01、B*08:01、B*15:16、B*56:01 等基因型在人群中出現(xiàn)頻率＜1%，但抗體出現(xiàn)率＞20%；相對的，A*11:01 在人群中出現(xiàn)頻率為20.03%，但只有16.90%的患者體內(nèi)檢測到了此種基因型抗體，這表明不同基因型的HLA 分子免疫原性不同，誘導抗體產(chǎn)生的能力也有所差別。

表1 不同基因型抗體出現(xiàn)頻率與該基因型在人群中出現(xiàn)的頻率%

2.3 HLA 分子eplets 免疫原性分析 選取在人群中出現(xiàn)頻率＜1%，抗體產(chǎn)生率＞20%的HLA-A 分子和人群中出現(xiàn)頻率＜1%但抗體產(chǎn)生率＞30%的HLAB 分子(共32 個)和低免疫原性HLA 分子(即A*11:01)上的eplets(https://www.epregistry.com.br/)進行比較，由表2 可見，這些高免疫原性HLA 分子大多包含一個或多個高免疫原性評分的eplets，即41T、45KE、62LQ、62GE、80I、82LR、107W、127K、131S、144TKH、145KHA(紅色標出)；而A*11:01 上的eplets免疫原性評分都較低，免疫原性最高的表位為90D，評分為0.125。然而也有部分高免疫原性的HLA 分子(A*34:02、A*66:01、A*66:02、B*07:03、B*08:01、B*81:01)中并沒有高免疫原性評分的eplets 表位。

表2 高免疫原性與低免疫原性HLA 分子間的eplets 比較分析

3 討論

Eplets 的負荷(即供者-受者中不匹配的eplets總和)與抗體形成的程度相關，然而基于eplets 負荷的免疫風險評估作用有限，因為不同的eplets 間的免疫原性差別較大，并非每一個eplet 錯配都能誘導抗體的產(chǎn)生。Eplets 錯配數(shù)量的增加與抗體之間的關聯(lián)可能僅反映錯配的eplets 越多，患者越有可能暴露于高免疫原性的eplets 的事實[8]。本研究也證實了這一點，多數(shù)高頻率抗體所對應的基因型分子上有一個或多個高免疫原性eplets。一是因為G.H?NGER等[7]提出一些表位出現(xiàn)的頻率較低，在受者人群的自身HLA 庫中通常較少出現(xiàn)，雖然免疫原性評分較低，但有相當大的潛在的免疫原性；二是因為本研究的樣本量較少，不具備全面性，可能會造成部分HLA 分子的免疫原性評價虛高的情況，還需擴大樣本量進行研究。

G.H?NGER 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)無免疫原性的eplets(62RR、76ESN、80TLR、156D、163RW)都定位于在α1或α2 結構域的α-螺旋內(nèi)，與遞呈的肽位置相當接近，這可能會降低B 細胞受體互補決定區(qū)的可及性；而那些免疫原性較高的eplets 多位于α2 結構域的側(cè)前方，正好在β2-m 的對面，這也強調(diào)了在體液免疫應答開始期間，B 細胞受體能不受阻礙地接近大型抗原區(qū)域的重要性。

除了錯配eplets 的空間位置，它的理化性質(zhì)也影響著自身的免疫原性。抗體與靶抗原結合的特異性和穩(wěn)定性受到兩個分子之間靜電和疏水相互作用的強烈影響，不匹配eplets 之間的理化差異(疏水性和靜電電荷)強烈影響HLA-Ⅰ類抗原的免疫原性。V.KOSMOLIAPTSIS 等[9]通過疏水性錯配評分對錯配eplets 的疏水性進行評分。高疏水性或靜電電荷錯配評分的HLA-A 和HLA-B 錯配特異性更具有免疫原性，可能引發(fā)同種抗體應答，因此最好避免。

C.S.M.KRAMER 等[10]指出某一HLA 等位基因錯配誘發(fā)抗體的概率取決于其最具免疫原性的eplet 在人群中的出現(xiàn)頻率。如果這一頻率較高，則供者和受者更有可能共享該表位，從而導致具有該抗體特異性的患者數(shù)量較少。如果人群中該高免疫原性eplet 的出現(xiàn)頻率較低，則在HLA 等位基因不匹配的情況下，針對該HLA 等位基因產(chǎn)生抗體的發(fā)生率則較高。然而目前還沒有針對中國人群各個表位出現(xiàn)頻率的大樣本量數(shù)據(jù)，無法以此為依據(jù)篩選可接受錯配。

總之，這提示未來在配型時不僅要關注錯配的eplets 數(shù)量，更要關注錯配eplet 的免疫原性，不同的eplets 具有不同的免疫原性，需預防高免疫原性的錯配以避免HLA-Ⅰ類抗體的產(chǎn)生，配型時應根據(jù)每個eplet 的危險性質(zhì)對其進行加權，從而改善基于表位的HLA 匹配。