西蘭花在PEG模擬干旱脅迫條件下的生理響應(yīng)分析

邵 勤，陳 娜，李曉鵬，袁九香

（1.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.南昌市農(nóng)村社會事務(wù)服務(wù)中心，江西 南昌 330000）

干旱對農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中居首位，是限制植物生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因子。近些年，由于災(zāi)害性天氣的發(fā)生及水資源的短缺等問題頻發(fā)，并影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此掌握農(nóng)作物的抗旱性、研究農(nóng)作物的耐旱機理引起了人們的廣泛關(guān)注［1］。目前，對干旱脅迫的研究方法主要是采用聚乙二醇（PEG）對幼苗進行模擬試驗，通過檢測植物幼苗各項生理生化指標的變化情況，從而研究干旱對幼苗生長的響應(yīng)情況及抗旱性強弱。近些年來，PEG作為水分脅迫材料在花椰菜、白菜、甘藍型油菜等十字花科作物的抗旱性研究上得到了廣泛的應(yīng)用［2］。

西蘭花（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）是十字花科蕓薹屬蔬菜，以食用花球為主。近年來，隨著西蘭花營養(yǎng)成分和功能成分的確定，顯示其營養(yǎng)價值很高，具有補腎益精、補脾和胃、清理血管、抗衰老等特殊療效而價格逐年上漲。西蘭花在我國大部分地區(qū)均有種植，種植面積和產(chǎn)量位居世界第1位。西蘭花是一種秋冬蔬菜，喜溫暖濕潤的氣候條件，各營養(yǎng)生長時期對水分極為敏感，忌干燥，尤其在夏秋季栽培過程中極易受干旱天氣的影響，缺水對出苗率、移苗成活率等的影響較大，最終影響其產(chǎn)量和品質(zhì)［3］，目前，關(guān)于西蘭花耐旱機理的報道較少。為此，本研究通過PEG溶液模擬不同程度土壤干旱脅迫西蘭花幼苗，并檢測其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、生物膜傷害程度及抗氧化特性，分析和探討了西蘭花幼苗在干旱脅迫下的生理響應(yīng)，以期為了解西蘭花的耐旱機制、篩選耐旱種質(zhì)、培育抗旱品種及推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以西蘭花品種“青錦”為試材，雜交一代中早熟品種（70~75 d），耐熱、耐寒，田間性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，采購于宜春市種子市場。

PEG6000、蒽酮等為分析純，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；抗逆系列—生化試劑盒（北京索萊寶）：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、脯氨酸（Pro）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 材料種植 篩選飽滿、均勻的西蘭花種子進行清水常溫浸種，催芽后播于盛有基質(zhì)的塑料平底育苗盤（540 mm×270 mm×60 mm）中，每盤約100粒，覆膜培養(yǎng)，要求陽光充足，基質(zhì)相對濕度75%，等出芽后揭開薄膜繼續(xù)培養(yǎng)，待移栽。整個試驗于2022年10月—2023年1月在宜春學院農(nóng)學基地溫室大棚內(nèi)進行。

1.2.2 材料處理 （1）準備沙子洗凈晾干，裝入直徑8 cm的塑料瓶中，共50份，待用；（2）西蘭花苗長至2葉1心時，選擇大小一致且長勢較好的幼苗，將根洗凈移栽6株至塑料瓶中；（3）滲透脅迫處理：PEG6000濃度分別為0（CK）、5%、10%、15%、20%的溶液各100 mL進行脅迫處理（60株），其中脅迫時間設(shè)置為0、1、3、5、7 d，待植株表現(xiàn)不同程度的癥狀時，隨機選取10株植株上部功能葉片（大小相當、癥狀一致的中上部成熟葉），測定各項生理指標，6次重復。

1.3 指標測定

（1）葉片相對含水量：飽和質(zhì)量法測定［4］；（2）葉片細胞膜相對透性：電導法測定［5］；（3）可溶性糖：蒽酮比色法測定［6］；（4）可溶性蛋白：考馬斯亮藍G-250法測定［7］；（5）丙二醛：硫代巴比妥酸顯色法測定［8］；（6）超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）：按照北京索萊寶科技有限公司試劑盒步驟進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片相對含水量的影響

葉片相對含水量（Relative water content, RWC）是反映干旱脅迫下植物葉片水分狀況重要指標［9-10］。由圖1可知，不同濃度PEG處理后，西蘭花幼苗的RWC隨著脅迫時間的延長、脅迫濃度的增加而呈下降的趨勢。其中，處理1 d后有所降低，各處理與對照之間差異不明顯，說明西蘭花幼苗能適應(yīng)短時間的脅迫；從第3天開始，葉片相對水分含量呈下降趨勢，不同濃度PEG脅迫比對照分別下降了8.30%、12.7%、25.4%、32.15%，依據(jù)Hsiao［11］的方法將相對含水量降低分為輕度（8%~10%）、中度（10%~20%）和嚴重脅迫（20%以上），則5% PEG處理達到了輕度脅迫，10% PEG處理達到中度脅迫，15%~20% PEG處理達到了嚴重脅迫；第7天，葉片相對含水量比對照分別降低了9.70%、35.30%、41.20%、51.30%，除了5% PEG處理外，均達到了嚴重脅迫程度，并觀察到葉片開始萎蔫，影響了植株的正常生長。

圖1 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片RWC的影響

2.2 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片脯氨酸含量的影響

葉片脯氨酸含量（Proline, Pro）是反映植物適應(yīng)逆境脅迫的重要指標之一，在植物抗旱生理中發(fā)揮著重要作用［12］。本研究對西蘭花幼苗的PEG脅迫完全符合這個結(jié)論。

由圖2可知，西蘭花幼苗葉片的脯氨酸含量隨著PEG脅迫濃度的增加、脅迫時間的延長而呈上升趨勢，即使在5%低濃度PEG脅迫下，與對照相比，均有顯著的增加，并隨著PEG脅迫時間的延長和濃度的增加而表現(xiàn)更明顯。在脅迫7 d后，其余3個高濃度PEG脅迫處理下的葉片脯氨酸積累得越來越多，最高達101.28 μg/g，4個處理分別比對照增加了101.20%、107.97%、129.18%、139.49%。

圖2 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片Pro含量的影響

2.3 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片細胞膜相對透性的影響

植物細胞膜對維持細胞正常代謝起著重要作用，其質(zhì)膜透性的變化是檢測植物細胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的可靠指標［13］。

在PEG脅迫下，西蘭花幼苗的相對電導率（Relative electric conductivity, REC）變化如圖3所示。西蘭花幼苗的膜透性隨著PEG濃度的增加和脅迫時間的延長而呈上升趨勢，其中5% PEG脅迫1 d，與對照差異不明顯，說明西蘭花“青錦”具有較強的抗旱性。但隨著脅迫時間的延長，尤其是在10%、15%、20% PEG高濃度脅迫條件下，與對照相比，差異顯著，且REC表現(xiàn)為增加的趨勢，說明PEG滲透脅迫導致西蘭花幼苗的葉片質(zhì)膜在生長過程中受到了損傷，進而影響了其正常的生理代謝過程。

圖3 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片REC的影響

2.4 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片可溶性糖含量的影響

在逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)積累的可溶性糖（Soluble Sugar, SS）是一類重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的增加能提高細胞汁液的濃度，降低細胞水勢，從而提高植物的吸水能力［14］。

由圖4可知，在5%低濃度PEG脅迫下，西蘭花幼苗葉片中可溶性糖含量與對照差異不顯著，隨著PEG濃度的增加，葉片可溶性糖含量逐漸提高。從第3天開始，可溶性糖含量呈升高趨勢，比對照增加了31.9%~43.2%；第5天的葉片可溶性糖含量繼續(xù)穩(wěn)定增加，說明西蘭花已經(jīng)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)作用；但到第7天則明顯下降，說明滲透調(diào)節(jié)能力是有限度的，其中較長時間和較高濃度PEG脅迫會導致西蘭花幼苗葉片生理代謝紊亂。

圖4 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片可溶性糖含量的影響

2.5 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

可溶性蛋白（Soluble protein, SP）是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用，經(jīng)常用作篩選植物抗性的指標之一［15］。

由圖5可知，隨著PEG濃度的增加和脅迫時間的延長，可溶性蛋白含量逐漸下降（第5天最低），與對照相比，分別下降了26.0%、31.7%、40.3%、42.5%，然而第7天的可溶性蛋白含量有所上升，總體呈現(xiàn)先降后升趨勢，說明經(jīng)過一定時間的PEG脅迫處理后，西蘭花幼苗則通過葉片可溶性蛋白含量的增加以維持正常的生理代謝平衡。

圖5 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片SP含量的影響

2.6 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片丙二醛含量的影響

丙二醛（Malonic dialdehyde, MDA）是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，能夠抑制細胞保護酶活性和降低抗氧化物的含量，加劇膜脂的過氧化作用，其含量變化與細胞膜脂過氧化程度的高低呈正相關(guān)［16-18］。

由圖6可知，在不同濃度PEG脅迫下，MDA含量出現(xiàn)了明顯的變化，并隨著脅迫時間的延長和濃度的增加而呈上升趨勢，與對照相比，差異明顯。隨著脅迫時間的延長，4種濃度PEG干旱脅迫處理的MDA含量變化趨勢一致，西蘭花幼苗在遭到脅迫時，表現(xiàn)出強烈的生理反應(yīng)，且始終保持增加，這表明在PEG脅迫處理過程中，脅迫時間的延長對細胞膜的傷害更嚴重。

圖6 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片MDA含量的影響

2.7 PEG脅迫對西蘭花幼苗葉片抗氧化物質(zhì)的影響

植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，細胞內(nèi)活性氧含量處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，可以減少氧自由基對植物的傷害，其活性氧的清除主要是通過有關(guān)酶和一些抗氧化物質(zhì)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等［19］。

由表1可知，在PEG脅迫下，西蘭花幼苗體內(nèi)的SOD酶活性隨著PEG濃度的增加和時間的延長而呈先上升后下降的變化趨勢。其中，SOD酶活性在5%PEG脅迫1 d時有小幅度的增強，隨后降低且與對照差異不明顯；10% PEG在脅迫1和3 d時均有小幅度增強，但在脅迫5 d時達到最大值86.40 U/g FW，顯著高于對照，隨后下降；15% PEG在脅迫1 d時明顯增強，并在脅迫3 d時達到最大值94.15 U/g FW，隨后開始大幅度下降，在脅迫7 d時降低至56.15%，明顯低于對照；20% PEG脅迫開始后就得到了增強，在脅迫3 d時達到最大值108.31 U/g FW，隨后開始大幅度下降，在脅迫7 d時降至42.18 U/g FW，顯著低于對照。由此可知，西蘭花幼苗在短時間、低濃度脅迫時，其葉片SOD酶活性的增加可以有效清除自由基，從而保護葉片免受過度傷害。

表1 PEG脅迫下西蘭花幼苗葉片SOD、POD和 CAT酶活性的影響

隨著PEG脅迫時間的延長，不同PEG濃度脅迫下的POD、CAT酶活性基本呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。5%和10% PEG脅迫下，POD、CAT酶活性小幅增加，脅迫后期與對照差異不顯著。15% PEG脅迫下，POD、CAT酶活性均在脅迫中期（3 d）達到最大值，后期開始下降，并顯著低于對照。20% PEG脅迫下，從一開始就急劇增強，顯著高于對照；在脅迫3 d時達到最大值，隨后開始急劇下降，脅迫5 d時顯著低于對照，在脅迫7 d時的POD、CAT酶活性分別低至343.22、10.28 U/(g·min)。

對照葉片中APX酶活性在PEG脅迫過程中保持相對穩(wěn)定，4種濃度PEG脅迫均呈先增加后降低的變化趨勢。5% PEG脅迫3 d時顯著高于對照，隨后開始降低，在脅迫7 d時趨于對照的水平；10%PEG在脅迫1 d時開始升高，在脅迫5 d時達到最大，脅迫7 d時下降至對照的水平；15% PEG在脅迫1 d時就迅速升高，并在脅迫3 d時達到最大值，隨后開始下降，但酶活性仍高于對照的水平；20%PEG在脅迫3 d時達到最大值，之后開始大幅度降低，在脅迫7 d時APX酶活性顯著低于對照。

從上述SOD、POD、CAT、APX等4種抗氧化酶活性的變化可知，隨著脅迫時間的延長，4種酶活性均呈先增加后下降的變化趨勢，說明西蘭花幼苗在一定濃度的PEG脅迫下能提高這些保護酶的活性，以清除植物體內(nèi)的自由基和活性氧，進而減輕植株受傷害的程度，有效地保護了西蘭花幼苗正常生長，但隨著PEG濃度的增加和脅迫時間的延長，對植株的傷害越來越嚴重，因而對幼苗造成了嚴重的損傷。

2.8 PEG模擬干旱脅迫下西蘭花幼苗生理效應(yīng)的綜合評價

將處理后的各項指標進行相關(guān)性分析，得到相關(guān)系數(shù)矩陣。對PEG模擬干旱處理后西蘭花幼苗的10個指標進行相關(guān)性分析（表2），結(jié)果表明：西蘭花幼苗葉片的RWC與SP呈極顯著正相關(guān)，與Pro、REC、SS、MDA呈極顯著負相關(guān)，表明可以用RWC、Pro、REC、SS、SP、MDA等指標來評價PEG對西蘭花幼苗的脅迫程度。

表2 不同處理西蘭花幼苗各項指標的相關(guān)性分析

對PEG模擬干旱脅迫條件下不同處理對西蘭花幼苗的生理響應(yīng)特性進行綜合評價，將PEG脅迫處理后相關(guān)的10個指標進行主成分分析，提取初始特征值＞1的2個主成分，其特征值分別為5.652和3.485。第1、第2主成分的方差貢獻率分別為56.517%、34.851%，累計方差貢獻率達到91.368%，符合分析要求。

由表3可知，第1主成分綜合了RWC、Pro、REC、SS、SP、MDA這6個指標的信息，第2主成分綜合了SOD、POD、CAT、APX指標的信息。綜合得分的計算公式：F綜=(第1主成分得分×56.517+第2主成分得分×34.851)/91.368。

表3 主成分分析的總方差解釋

由表4可知，西蘭花幼苗在不同濃度PEG脅迫下的綜合得分分別為-1.167（5% PEG）、0.850（10%PEG）、0.718（15% PEG）、0.810（20% PEG）。因此，PEG模擬干旱脅迫下對西蘭花幼苗的生理特性影響排名依次是10% PEG＞20% PEG＞15% PEG＞5% PEG。

表4 不同濃度PEG脅迫處理下西蘭花幼苗的綜合得分及排名

3 討論與結(jié)論

葉片相對含水量是反映植物體內(nèi)水分虧缺程度的生理參數(shù)之一［20］。本研究認為，西蘭花幼苗葉片相對含水量隨著滲透脅迫時間的延長而降低，5% PEG濃度處理表現(xiàn)輕度脅迫，10% PEG濃度處理達到中度脅迫，15%~20% PEG濃度處理達到了嚴重脅迫，說明西蘭花幼苗在輕度滲透脅迫下具有一定的保水能力，但高濃度、長時間的滲透脅迫會使西蘭花幼苗嚴重失水而受到傷害。

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組成成分之一，在植物中廣泛存在于游離態(tài)，研究表明：在干旱、鹽脅迫等非生物脅迫條件下，植株葉片的脯氨酸含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸的含量在一定程度上可以反映植物的抗逆性［21］。本研究結(jié)果可知，西蘭花幼苗葉片脯氨酸含量隨著PEG脅迫濃度的增加、脅迫時間的延長而呈上升趨勢，在5%低濃度PEG脅迫也有較顯著的增加，并隨著時間的延長而顯著增加。研究顯示高濃度PEG脅迫下脯氨酸積累越來越多，最高達101.28 μg/g，分別比對照增加了101.20%、107.97%、129.18%、139.49%。說明PEG脅迫誘導了西蘭花幼苗體內(nèi)脯氨酸的大量積累，具有一定的抗旱能力。

植物細胞膜對維持細胞微環(huán)境的正常代謝起著重要的作用，正常情況下細胞膜的滲透性具有選擇性。研究表明，當植物受到干旱、水淹、鹽、冷凍等脅迫時，可以通過測定相對電導率來鑒定植物細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性［22］。本研究分析了PEG滲透脅迫下西蘭花幼苗葉片的相對電導率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西蘭花幼苗低濃度脅迫條件下與對照差異不顯著，說明其具有一定的抗旱性，但隨著PEG脅迫時間的延長和濃度的增大，其相對電導率變化極顯著，說明在PEG模擬干旱脅迫下，西蘭花幼苗細胞受到了一定的傷害，其傷害程度與脅迫濃度呈正相關(guān)。

植物細胞會積累一些可溶性物質(zhì)來進行滲透調(diào)節(jié)，以提高植物抗逆性。研究表明，可溶性糖含量的增加，能降低細胞原生質(zhì)的滲透勢，增強保水力，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，降低細胞酸性以及解除氨毒［23］。本研究表明，與對照相比，葉片可溶性糖含量增加了31.9%~43.2%，脅迫7 d后則明顯下降，說明滲透調(diào)節(jié)能力是有一定限度的，較高濃度的PEG、較長時間的脅迫均會使西蘭花幼苗失去生理調(diào)節(jié)能力，因此推測在低濃度、短時間脅迫條件下，可溶性糖得到積累而維持西蘭花幼苗正常的代謝過程。

可溶性蛋白與植物細胞的滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，高含量的可溶性蛋白能維持較低的細胞滲透勢，減輕干旱脅迫所造成的傷害，延緩脅迫條件下植物葉片的衰老進程［24］。本研究表明，可溶性蛋白呈先降后升的變化趨勢，說明在一定的干旱脅迫時間內(nèi)，可以誘導葉片產(chǎn)生更多的可溶性蛋白，以抵御PEG脅迫所帶來的傷害，這樣才能維持西蘭花幼苗正常生長。

MDA具有很強的細胞毒性，對膜和細胞中的許多生物功能分子如蛋白質(zhì)、核酸和酶等均有很強的破壞作用，并參與破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能［25］。本研究表明，MDA含量隨著PEG脅迫時間的延長與濃度的增加而呈上升趨勢，與對照相比，差異顯著。隨著時間的變化，4種濃度脅迫的MDA含量變化趨勢一致，西蘭花幼苗在遭受PEG脅迫時，表現(xiàn)出強烈的生理反應(yīng)，且始終保持增加，從PEG脅迫對細胞膜造成的傷害程度來看，長時間干旱脅迫造成的損傷則更為嚴重。

在抗氧化酶體系中，SOD酶活性與植物的抗氧化能力呈正相關(guān)。有研究表明，在輕度干旱脅迫時SOD酶活性開始升高，重度干旱或者脅迫時間的延長，SOD酶活性呈下降趨勢或者先降低后升高的變化趨勢，變化情況較為復雜。前人在研究不同作物幼苗膜質(zhì)過氧化中發(fā)現(xiàn)，輕度干旱脅迫和中度干旱脅迫下的POD、CAT酶活性均呈上升趨勢，且與植物材料的種類和抗旱的敏感程度相關(guān)［26］，本研究結(jié)果與前人得出的結(jié)論一致。

在植物耐旱性研究中發(fā)現(xiàn)，植物的抗旱能力取決于植物體內(nèi)的APX酶活性，表明APX酶也是活性氧清除系統(tǒng)的一部分［27］。本研究結(jié)果可知，在脅迫初期的APX酶活性變化不大，隨著PEG濃度的增加和脅迫時間的延長，APX酶活性先升高后降低，表明西蘭花可以通過增加APX酶活性來抵御質(zhì)膜的過氧化過程，減少對植株的傷害。

綜上所述，在PEG干旱脅迫處理下，高濃度對各項指標的影響比低濃度的大，其原因在于PEG能影響原生質(zhì)膜，改變膜透性，其細胞膜成分會部分改變，進而影響植物的正常生理代謝。西蘭花幼苗通過增加抗氧化酶活性，共同抵御氧化脅迫造成的傷害。西蘭花“青錦”幼苗可以抵抗中等程度的PEG干旱脅迫（10%），可以在半干旱地區(qū)或輕度缺水地區(qū)引種，不僅豐富了西蘭花的抗性種質(zhì)材料，也為今后西蘭花標準化育苗、苗期肥水一體化等管理提供一定的理論依據(jù)。