基于PARMS技術的稻瘟病抗性基因分子標記研究及其在江蘇太湖稻區(qū)的應用

宋云生，曹鵬輝，于雅潔，喬中英，朱勇良，謝裕林，袁彩勇，董明輝

（江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 蘇州 215000）

0 引言

水稻(Oryza sativaL.)是全球最為重要的糧食作物之一，尤其在我國其產(chǎn)量和穩(wěn)定性對國家糧食安全和經(jīng)濟穩(wěn)定具有至關重要的作用［1］。然而，水稻的產(chǎn)量和品質往往受到各種病害的嚴重威脅，其中稻瘟病(Magnaporthe oryzae)對水稻的影響尤為顯著［2］。近年來，江蘇太湖稻區(qū)的稻瘟病發(fā)生頻率和嚴重程度均有上升的趨勢［3］，給當?shù)厮旧a(chǎn)帶來了重大壓力，而抗病品種的利用是抵抗稻瘟病災害風險最直接、最有效的方法，因此，對稻瘟病抗病育種的研究成為太湖稻區(qū)水稻研究的重要內容。

在稻瘟病的防治中，利用抗性基因對水稻品種進行篩選和改良是一種有效的策略［4］。隨著基因工程和生物技術的快速發(fā)展，已經(jīng)成功克隆并研究了一系列抗稻瘟病基因［5］，如Pi1、Pi2、Pi9、Pia、Pib、Pik和Pita等。然而，由于不同水稻品種中抗性基因的分布、頻率和效果存在較大差異［6］，如何準確、高效地在育種材料中識別和利用抗性基因，已經(jīng)成為當前學者們的重要研究方向之一。相比于傳統(tǒng)的育種方法，分子標記輔助育種［7］(Marker-Assisted Selection， MAS)有助于提高育種的效率和精確性，利用抗性基因的分子標記，可以在育種過程中對目標基因進行追蹤和篩選，從而實現(xiàn)快速、準確的育種進程。以往多項研究［8-9］已開發(fā)了一系列的分子標記，如SSR、AFLP、CAPS、SNP等分子標記在抗性基因的定位、鑒定和輔助選擇育種等方面取得了顯著的成果。作為一種獨特的SNPPCR分析技術，PARMS (Penta-Primer Amplification Refractory Mutation System，五引物擴增受阻突變體系）結合了1對通用熒光引物、1對SNP等位基因特異引物以及1條反向共用引物進行檢測［10］，該技術無須對PCR擴增產(chǎn)物進行耗時的DNA電泳分析，簡化了操作過程，同時保持了較高的標記精確性，使得在大規(guī)模的育種項目中快速、準確地篩選和鑒定抗性基因成為可能。卿冬進等［11］采用PARMS技術成功開發(fā)了水稻Pigm基因的分子標記，通過對48份水稻親本進行基因型鑒定，并結合田間抗性表型驗證，證實了該技術的可靠性。伍豪等［12］研究表明，利用PARMS技術開發(fā)的分子標記可有效地運用于水稻抗病性分子標記輔助育種。然而，以往研究大多集中于單個抗性基因的分子標記開發(fā)和應用，對于多個抗性基因共同作用的研究相對較少，而且抗性基因的效果容易受到遺傳背景和自然環(huán)境的影響［13］。因此，利用抗性基因進行水稻抗病性育種仍需要進一步研究和探索。

江蘇太湖稻區(qū)水稻種植歷史悠久，品種變異類型多樣、抗性基因資源豐富［14］，開發(fā)和利用分子標記對于提升該地區(qū)水稻的抗性育種水平具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以課題組多年篩選培育的水稻高代材料為主體，針對江蘇太湖稻區(qū)的稻瘟病種類和病原菌特性［15］，基于PARMS技術對Pi2、Pib、Pita和Pik等4個基因的快速準確檢測進行深入研究，分析以上抗性基因在供試水稻材料中的分布特征，并根據(jù)田間抗病性表現(xiàn)探討其與抗性基因之間的關系，旨在為該地區(qū)抗稻瘟病水稻品種選育提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所篩選培育的高代穩(wěn)定材料206份。供試菌株為2021年江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供的代表性稻瘟病菌株（2021-3、2021-43、2021-71、2021-150和2021-497）。由4個抗性基因分子標記開發(fā)的感病和抗病品種對照分別為嘉58和淮稻5號(Pi2)、南粳46和淮稻5號(Pib)、武運粳24和南粳46(Pita)、武運粳24和南粳46(Pik)。

1.2 供試水稻材料穗頸瘟抗性鑒定

穗頸瘟田間自然鑒定在江蘇省常州市金壇試驗基地進行。供試水稻材料和誘發(fā)品種（蘇御糯、麗江黑谷）采用交錯播種方式，在水稻分蘗階段將稻瘟病菌樣撒布在田間，于成熟期觀察并記錄穗頸瘟的發(fā)病情況，群體抗性分級標準如表1所示。水稻全生育期內不防治病害，蟲害防治和水肥管理參照大田常規(guī)生產(chǎn)。

表1 水稻穗頸瘟發(fā)病群體抗性分級標準

1.3 水稻葉片DNA提取與PCR擴增

2021年8月對206份水稻材料葉片進行取樣。取長、寬約1 cm的葉片置入深孔板中（96孔1.2 mL)，注入100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉，進行50 Hz磨樣1 min，研磨完成后以3000 r/min離心1 min，隨后在沸水浴中處理1 min，加入400 μL 0.2 mol/L Tris-HCl混勻，再次進行沸水浴1 min，水浴完成后以3000 r/min離心1 min，取上清液稀釋10~30倍，用于后續(xù)PCR擴增。參考卿冬進等［11］的研究方法對所選206份水稻材料進行PCR擴增，通過PARMS引物設計網(wǎng)站(http://www.snpway.com)設計等位基因特異引物和反向共用引物，詳細的標記引物序列見表2，由武漢景肽生物科技有限公司負責合成引物。

表2 分子標記引物序列及熒光信號類型

1.4 等位基因型分型鑒定

PCR擴增完成之后，采用酶標儀(TECAN infinite M1000)讀取擴增產(chǎn)物的熒光信號強度，使用snpdecoder 在線軟件(www.snpway.com/snpdecoder)將熒光信號進行解析并轉換，以獲取清晰且直觀的基因分型圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和圖表繪制。采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對水稻材料攜帶的抗性基因與其田間穗頸瘟抗性級別進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 分子標記開發(fā)

利用稻瘟病抗性品種基因序列與感病品種等位基因的序列差異，設計針對水稻抗稻瘟病基因Pi2、Pib、Pita和Pik的4組共顯性SNP分子標記，相應的分子標記名稱分別為SYS-Pi2、SYS-Pib、SYS-Pita和SYS-Pik，其引物序列及熒光信號類型見表2。對每個基因都設計了1對通用熒光引物、1對SNP等位基因特異引物以及1條反向共用引物，以確保擴增出目標基因的SNP位點。

其中，2條攜帶不同熒光信號的等位基因特異引物，將分別與PARMS master mix中帶FAM和HEX的熒光信號相互匹配。根據(jù)引物序列對比分析可知，預測PCR擴增后，以上引物能夠有效地擴增目標基因的SNP位點，并通過檢測2種熒光信號將抗病品種與感病品種的基因型區(qū)分開，以實現(xiàn)這4組分子標記的特異性。

2.2 基因型檢測

利用開發(fā)設計的4組熒光分子標記檢測206份水稻材料的基因型，于PCR擴增后經(jīng)熒光掃描、數(shù)據(jù)分析，得到FAM和HEX熒光信號的散點圖（圖1）。在供試水稻材料中，4組分子標記均能有效識別區(qū)分相應的SNP差異，表明分子標記開發(fā)成功。

圖1 分子標記對206份水稻材料的基因分型檢測結果

根據(jù)圖1結果，匯總稻瘟病抗性基因在供試材料中的分布如圖2所示。結合引物設計原理分析，發(fā)現(xiàn)在206份水稻材料中Pib抗性基因的檢出率最高，達到了98.06%（202/206）；其次為Pita和Pik基因，檢出率分別為85.44%（176/206）和40.29%（83/206）；Pi2基因的檢出率則較低，為26.70%（55/206）；而未檢出以上抗性基因的材料僅1份。以上結果表明，多年的育種選擇在很大程度上提高了抗性基因存在的比例，其中Pib、Pita和Pik抗性基因在樣本中具有較為廣泛的分布，而Pi2基因的低檢出率也提示了其在水稻材料中的稀缺性，這可能與水稻材料的遺傳背景和種質資源有關。

進一步分析顯示，在所有研究材料存在的基因組合中，同時存在4個抗性基因(Pi2+Pib+Pita+Pik)和3個抗性基因(Pi2+Pita+Pik)的材料數(shù)量較少，均僅有11份，占比均為5.34%（11/206）。而存在2個抗性基因和3個抗性基因的組合分別以(Pib+Pita)和(Pib+Pita+Pik)的材料較多，占比分別為84.47%（174/206）和34.47%（71/206）。這種情況反映出在太湖稻區(qū)，水稻更傾向于利用Pib、Pita和Pik基因提供對穗頸瘟的抗性，而較少依賴Pi2基因。

2.3 田間誘發(fā)抗病性鑒定

206份水稻材料田間誘發(fā)穗頸瘟發(fā)病情況統(tǒng)計結果顯示（表3），穗頸瘟達到1級的有48份，表現(xiàn)為抗；3級的有90份，表現(xiàn)為中抗；5級的有47份，表現(xiàn)為中感；7級的有21份，表現(xiàn)為感；0級高抗和9級高感的材料均未發(fā)現(xiàn)。結合4個抗性基因存在情況發(fā)現(xiàn)，具有單一Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟上表現(xiàn)優(yōu)異，中抗級別以上材料有4份，而Pi2、Pita和Pik基因則相對較弱，這突顯了Pib基因在防控稻瘟病中的重要性。在復合基因型中，當同時存在2個基因“Pib+Pita”時，水稻材料對穗頸瘟的抗性表現(xiàn)出更強的穩(wěn)健性，中抗級別以上材料有48份，反映出這2個基因在防治稻瘟病上的潛在協(xié)同作用。此外，三基因型“Pi2+Pita+Pik”的抗性級別偏向于較強，中抗以上材料達到47份，尤其是當4個抗性基因Pi2、Pib、Pita和Pik共存時，雖然樣本量僅有11份，但其抗性表現(xiàn)較好，特別是在1級的抗性級別中占比最高，揭示了多抗性基因共存對稻瘟病的抵抗力顯著增強。

表3 不同抗性基因組合的田間抗病性鑒定結果

相關性分析表明，Pib基因的存在與穗頸瘟的抗性呈極顯著相關（r=0.204**，P＜0.01），表明帶有Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟病方面可能有更好的表現(xiàn)。Pik基因與穗頸瘟抗性的相關性也達顯著水平(r=0.149*，P＜0.05），而Pi2和Pita基因與穗頸瘟抗性的相關性均不顯著(r=0.086和r=0.135，P＞0.05），這表明Pib和Pik基因可能對稻瘟病的抗性產(chǎn)生更大的影響。

3 討論與結論

水稻抗稻瘟病的種質創(chuàng)新和優(yōu)良品種的選育是稻瘟病防治的最有效、最經(jīng)濟的手段［16］，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在減少了對化學藥劑的依賴，不僅降低了對生態(tài)環(huán)境的破壞，還有效地減輕了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的成本負擔。分子標記技術在抗病品種的選育過程中起到了重要的推動作用，可以迅速、高效地從大量水稻品種中篩選出攜帶抗性基因的優(yōu)良品種［17-18］。本研究基于PARMS技術開發(fā)了針對抗稻瘟病基因的分子標記，并對江蘇太湖稻區(qū)206份水稻育種高代穩(wěn)定材料的基因型進行了準確鑒定，為了解抗稻瘟病基因的分布和作用，以及抗性基因與田間抗病性的關聯(lián)，提供了高效的技術工具。通過應用分子標記對基因型的鑒定結果，有針對性地對水稻育種材料進行稻瘟病抗性篩選改良，可提高稻瘟病抗性選育效率。

水稻品種的抗病水平與其抗性基因種類密切相關［19］，不同種植區(qū)域水稻中蘊含的稻瘟病抗性基因有所不同［20］，深入了解抗性基因的分布情況是稻瘟病抗性品種選育的基礎。本研究結果顯示，Pib、Pita和Pik抗性基因在太湖稻區(qū)供試水稻材料中分布廣泛，同時存在2個抗性基因(Pib+Pita)和3個抗性基因(Pib+Pita+Pik)的樣本較多，而Pi2基因的檢出率則較低。王小秋等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在江蘇粳稻品種中Pib和Pita基因的比例超過了50%，說明以上2個基因在稻瘟病抗性育種中應用廣泛。范方軍等［22］通過對近年來審定的江蘇水稻品種進行稻瘟病抗性基因檢測，發(fā)現(xiàn)大部分品種都包含Pib、Pita、Pik基因，多數(shù)材料聚合了多個基因，與本研究結果較為一致。本研究對基因型與田間自然誘發(fā)抗病性表現(xiàn)的關系進行了深入分析，探討了基因間的協(xié)同作用。供試材料中具有單一Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟上表現(xiàn)優(yōu)異，當Pib和Pita同時存在時，對稻瘟病的抗性顯著增強，特別是4個抗性基因Pi2、Pib、Pita和Pik共存時，材料中達到1級抗性級別的占比最高，這與王軍等［23-25］的研究結果一致，均強調了復合抗性基因在病害抗性增強中的關鍵作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)Pib和Pik基因與穗頸瘟的抗性呈（極）顯著正相關，表明Pib和Pik基因可能會對稻瘟病的抗性產(chǎn)生更大的影響，為進一步理解稻瘟病抗性的遺傳機制提供了重要線索。與傳統(tǒng)的PCR技術和序列標記位點（SNP）技術相比，PARMS技術在基因型鑒定中表現(xiàn)出更高的檢測效率［26］，近年來在水稻［11］、小麥［27］、玉米［28］、油菜［29］上被廣泛應用。然而，本研究在操作中發(fā)現(xiàn)，當目標區(qū)域變異較小或重復序列較多時，PARMS技術的準確性會受到影響，在應用中還需注意進行相應優(yōu)化。

盡管本文在抗稻瘟病基因分布和基因型與田間抗病性關系等方面取得了一些研究結果，但試驗數(shù)據(jù)可能受到研究材料和技術選擇的影響，仍存在一些局限性。由于研究聚焦于江蘇太湖稻區(qū)，選擇的水稻材料和抗性基因也主要是針對該地區(qū)，一方面可能會限制結論的泛化性，但另一方面也使本研究結果更具有針對性和實際應用價值。今后的研究將進一步考慮抗性基因的組合及其與抗病性的關系，進行更全面的抗性基因檢測和更大樣本的田間抗病性鑒定。