鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯降解菌群的篩選及特性研究

周冰玉，孫翔宇，周 宇，汪 彬，王春平

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters，PAEs）是一類混合在塑料中以增強其可塑性和多功能性的有機化合物[1]，主要是依靠非化學鍵與塑料母體相連。在塑料制品的使用過程中，隨著塑料結構的破壞，大量的鄰苯二甲酸酯被釋放到環(huán)境中，引發(fā)環(huán)境污染問題[2]。近年來，隨著設施農業(yè)的發(fā)展，在農田土壤，甚至動植物產品中都檢測到鄰苯二甲酸酯的殘留，對人類健康造成潛在威脅[3-6]。鄰苯二甲酸酯是一種內分泌干擾物，對人體具有肝腎和生殖系統(tǒng)毒性，并對動物有致畸性、致突變性和致癌性[3]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是近年來檢出最多且較難降解的PAEs 污染物，其在自然環(huán)境中水解、光解的速率非常慢，微生物降解是其最主要的降解途徑[7]，由于生物降解技術具有效率高、成本低、易實施等優(yōu)點，得到科技工作者的廣泛關注。目前，已報道的能夠降解鄰苯二甲酸酯的微生物種類較多，例如不動桿菌、紅球菌、假單胞菌、戈登氏菌、芽孢桿菌等[8-12]。有研究表明，從PAEs 污染地區(qū)分離的部分復合菌群對污染物的降解效果優(yōu)于單一菌株[13]，而目前有關復合菌群用于PAEs 污染土壤修復的報道較少。

因此，研究以鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）為降解對象，篩選具有高效降解能力的復合微生物菌群，并對菌群的降解特性進行分析，期望為DEHP 污染土壤的高效修復提供更豐富的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采集于湖南省益陽市赫山區(qū)泥江口鎮(zhèn)某長期使用塑料薄膜大棚種植蔬菜的農田。DEHP購自國藥試劑有限公司，所用有機溶劑為色譜級。

無機鹽（MSM）培養(yǎng)基：KH2PO44.5 g/L，K2HPO45.8 g/L，(NH4)SO42.0 g/L，NaCl 0.75 g/L，MgCl20.16 g/L，CaCl20.02 g/L，F(xiàn)eCl30.002 g/L，pH 值7.0。固體培養(yǎng)基按1.8%比例添加瓊脂粉。

DEHP 降解培養(yǎng)基：往無機鹽培養(yǎng)基中加入一定濃度的DEHP 母液，配制成以DEHP 為唯一碳源的培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 DEHP 降解菌群的分離篩選 取土壤樣品約5 g 加入到盛有100 mL 含有終濃度為100 mg/L DEHP的MSM 液體培養(yǎng)基中，采用含200、400、600、800、1 000 、1 200 mg/L 的DEHP 濃度梯度馴化，每個周期培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件：30℃、180 r/min、避光。每次轉接1 mL 培養(yǎng)液到下一濃度梯度的培養(yǎng)基中，將最后獲得的馴化培養(yǎng)液在相同濃度的DEHP培養(yǎng)基中連續(xù)轉接4 次，獲得穩(wěn)定培養(yǎng)液，命名為HM6，同時利用甘油冷凍保藏法將菌種在－80℃冰箱保存。

1.2.2 HM6 菌群群落組成分析 使用DNA 提取試劑盒抽提HM6 菌群的總DNA，利用引物338F（5′-ACTC CTACGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′）擴增16S rRNA 基因的V3—V4 區(qū)，建庫后利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序，并利用美吉生物有限公司的云平臺進行微生物群落組成分析。

1.2.3 HM6 菌群對DEHP 降解能力的測定 將HM6 菌群接種在含600 mg/L DEHP 的MSM 培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 避光培養(yǎng)，24 h 后收集菌液進行低溫離心，去上清，加入無菌水重懸菌體（調節(jié)OD600約為0.2），作為種子液備用。按2%接種量將上述種子液添加到初始DEHP 濃度為600 mg/L 的MSM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與種子液制備條件相同，每隔1 d 測定培養(yǎng)液中剩余的DEHP 含量，持續(xù)檢測7 d。DEHP 含量采用高效液相色譜法（HPLC）測定[14]，利用外標法定量，以峰面積對應DEHP 濃度繪制標準曲線。培養(yǎng)液中DEHP 萃取收集方法：加入50 mL 正己烷到培養(yǎng)液中，充分振蕩靜置后，收集有機相，重復2 次；將2 次萃取液合在一起，利用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)至近干，加入10 mL 甲醇重新溶解萃取物，并使用0.22 μm 過濾器過濾；參照筆者實驗室已報道的色譜條件進行HPLC 分析[15]，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-18（200 mm×4.6 mm），流動相為95%甲醇溶液，流速為1 mL/min，柱溫30℃，紫外檢測波長為228 nm，進樣量20 μL。

1.2.4 環(huán)境條件對HM6 菌群降解DEHP 的影響（1）溫度。將1.2.3 中制備的HM6 種子液按2%的接種量轉接至MSM 液體培養(yǎng)基中（DEHP 濃度600 mg/L），培養(yǎng)溫度分別設置為15、20、25、30、35、40℃，180 r/min 遮光培養(yǎng)4 d 后測定剩余的DEHP含量，以未接菌、相同溫度處理作對照，計算降解率。（2）pH 值。分別用HCl 和NaOH 調節(jié)MSM 液體培養(yǎng)基的pH 值為5、6、7、8、9，接種量為2%，30℃、180 r/min 遮光培養(yǎng)，4 d 后測定剩余的DEHP含量，以未接菌、相同pH 值處理作對照，計算降解率。（3）DEHP 初始濃度。按2%的接種量將HM6 種子液轉接到初始濃度為50、200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 mg/L 的DEHP 無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 遮光培養(yǎng)4 d，測定菌液中剩余的DEHP 含量，以未接菌、相同初始濃度處理作對照，計算降解率。

1.2.5 HM6 菌群在DEHP 污染土壤中的應用 模擬試驗所用土壤采集于益陽市赫山區(qū)泥江口鎮(zhèn)農田（未檢出DEHP），土樣經風干并過20 目篩后備用，取200 g 土壤，加入DEHP 溶液配制成終濃度為200 mg/kg 的人工DEHP 污染土壤。按2%的接種量將HM6 種子液轉接到人工DEHP 污染土壤中，以未接種HM6 的人工DEHP 污染土壤為空白對照，將錐形瓶放入30℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，每隔3 d 取樣測定剩余DEHP 含量，總周期為21 d。土壤中DEHP 的提取參照楊婧等[14]報道的方法，含量分析同1.2.3 中介紹的方法。

2 結果與分析

2.1 HM6 菌群的群落組成分析

由圖1 可知，HM6 菌群在科和屬的分類水平上組成非常豐富。在科分類水平上，Nocardiaceae的豐度最高，占比達64.87%，這一結果與Li等[13]報道的DEHP 降解菌群類似，除此之外，Alcaligenaceae（7.91%）、Comamonadaceae（5.34%）、Chitinophagaceae（4.53%）、Rhizobiaceae（3.49%）、Xanthomonadaceae（2.82%）、Burkholderiaceae（2.76%）也是占比較高的科。在屬分類水平上，豐度最高的屬為Rhodococcus，占比達57.5%，另外unclassified_f_Alcaligencaceae（7.90%）、Gordonia（6.23%）、Hydrogenophaga（3.43%）、Terrimonas（2.95%）、Pandoraea（2.76%）、Pseudoxanthomonas（2.63%）、Ensifer（2.19%）等屬的比例也較高。據報道，Rhodococcus、Gordonia屬的菌株具有PAEs降解能力。因此，研究獲得的HM6 菌群中這2 個屬的豐度均較高，間接說明HM6 菌群在DEHP 污染修復方面的潛在應用價值較高。

圖1 HM6 菌群的群落組成

2.2 HM6 菌群降解DEHP 的能力分析

從圖2 可以看出，在含600 mg/L DEHP 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d 后，培養(yǎng)基中DEHP 含量降低不明顯，可能是該菌群處于生長適應期，生長繁殖較慢，因此對DEHP 的利用較少；培養(yǎng)2～3 d 后，DEHP 含量顯著降低，說明HM6 菌群已經適應環(huán)境，以DEHP為碳源開始大量生長繁殖；培養(yǎng)3 d 以后，培養(yǎng)基中的DEHP 含量無顯著變化，原因可能是培養(yǎng)基的環(huán)境已不適應菌群生長，菌體進入衰退期。

圖2 HM6 菌群對DEHP 的降解曲線

2.3 環(huán)境條件對HM6 菌群降解DEHP 的影響

2.3.1 溫 度 溫度會影響微生物的生長繁殖，也會影響降解酶的活性，從而影響微生物對有機物質的降解[1]。圖3 的結果顯示，在15～30℃范圍內，HM6 菌群對DEHP 的降解率隨著溫度的升高而上升，且在30～35℃時達到最大值（＞92%）；但環(huán)境溫度提高到40℃時，降解率有所降低。在該研究設定的溫度范圍內，HM6 均對DEHP 有較大程度地降解，說明該菌株適應環(huán)境溫度變化的能力較強。

圖3 溫度對HM6 菌群降解DEHP 的影響

2.3.2 pH 值 根據土壤pH 值范圍，該研究考察了pH 值在5～9 之間時HM6 菌群對DEHP 的降解情況。由圖4 可知，pH 值為6～8 時，HM6 菌群對DEHP 的降解率無顯著性差異，說明中性條件有利于菌株對DEHP 的降解，這一結果與已報道的B6菌株[1]的特性類似；當pH 值降低至5 或提高至9 時，HM6 菌群對DEHP 的降解率顯著降低，但仍處于65%以上，說明HM6 菌群能夠在較寬pH 值范圍內高效降解DEHP，這可能與HM6 菌群組成豐富，在不同pH 值條件下均有菌株發(fā)揮DEHP 降解功能有關，從而使HM6 菌群高效降解DEHP 的pH 值范圍較廣。

圖4 pH 值對HM6 菌群降解DEHP 的影響

2.3.3 DEHP 初始濃度 由圖5 可知，DEHP 初始濃度≤1 000 mg/L 時， HM6 菌群對DEHP 的降解率均在86%以上，表明菌群對DEHP 具有較強的耐受性；當濃度繼續(xù)提高至1 500、2 000 mg/L 時，菌群對DEHP 的降解率分別下降至76.4%、61.8%，原因可能是高濃度的DEHP 會對HM6 菌群中部分菌株的生長繁殖產生抑制作用，從而影響DEHP 的降解。與已報道的菌株ASW6D[14]、Lff[16]、B6[1]相比，在一定的DEHP 濃度范圍內，該研究的HM6 菌群對DEPH 的降解效率更高。

圖5 DEHP 初始濃度對HM6 菌群降解DEHP 的影響

2.4 HM6 菌群對土壤中DEHP 的降解效果

從圖6 可以看出，21 d 試驗周期結束時，接種HM6 菌群的試驗組，DEHP 的降解率達70.6%，而對照組的DEHP 降解率僅為28.5%。這表明HM6 菌群的添加顯著提高了污染土壤中DEHP 的降解率。處理后不同時期HM6 菌群對DEHP 的降解速率差異較大；處理前3 d，試驗組的DEHP 降解率與對照組無顯著差異；處理3～9 d 時，HM6 菌群對DEHP的降解達到高峰；隨后，HM6 菌群對DEHP 的降解速率又變得較為緩慢。導致這種結果的原因可能是接種菌群3 d 后，外源微生物已適應土壤環(huán)境，以DEHP 為碳源開始大量生長繁殖；接種9 d 后降解速度變慢可能是DEHP 通過分配作用進入土壤微孔內，導致微生物難以利用[17]。

圖6 HM6 菌群對土壤中DEHP 的降解效果

3 結 論

該研究從長期使用塑料薄膜大棚種植蔬菜的農田土壤中篩選到一個可高效降解DEHP 的菌群，課題組將其命名為HM6 菌群，對該菌群的群落組成結構進行分析，發(fā)現(xiàn)HM6 菌群中最主要的科是Nocardiaceae（64.87%）、Alcaligenaceae（7.91%）、Comamonadaceae（5.34%）、Chitinophagaceae（4.53%），最主要的屬為Rhodococcus（57.5%）、unclassified_f_Alcaligencaceae（7.90%）、Gordonia（6.23%）、Hydrogenophaga（3.43%）。對該菌群的DEHP 降解能力進行測定，發(fā)現(xiàn)在含600 mg/L DEHP 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 后，HM6 菌群對DEHP 的降解率可達93.9%，表明該菌群對DEHP 的降解性能優(yōu)良。研究還發(fā)現(xiàn)，該菌群可在較寬溫度、pH 值范圍內高效降解DEHP，最適降解溫度為30 或35℃，最適pH值為6.0～8.0，當初始DEHP 濃度≤1 000 mg/L 時，菌群對DEHP 的降解率均大于86%，表明該菌群對DEHP 的耐受能力較強。同時，該研究還考察了HM6 菌群在DEHP 污染土壤（200 mg/kg）中的應用效果，結果顯示21 d 試驗周期結束時，接種HM6菌群的試驗組，DEHP 的降解率達70.6%，而對照組的DEHP 降解率僅為28.5%。這表明HM6 菌群的添加顯著提高了污染土壤中DEHP 的降解率，其在DEHP 污染土壤的生物修復方面具有較高的潛在應用價值。