基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討葛根芩連湯治療2 型糖尿病的作用

范堯夫，許 娟，孫洪平，曹 琳

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210028）

目前全球有超過(guò)4.63 億糖尿病患者，到2045 年糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到7 億［1-2］。在糖尿病人群中，約90%以上為2 型糖尿?。═2DM），其主要病理特征是胰島素抵抗及胰島β 細(xì)胞功能障礙［3］。目前針對(duì)T2DM 的治療主要以化學(xué)藥物為主，雖然降糖療效確切，但常伴隨各種不良反應(yīng)的發(fā)生。研究已證實(shí)，肝臟糖異生作用的增加是糖尿病發(fā)病機(jī)制中極為關(guān)鍵的一點(diǎn)，且該作用可貫穿T2DM 的整個(gè)病程。因此，調(diào)控肝臟異常糖異生作用，減少肝糖原輸入是治療T2DM 的重要且有前景的方法。近年來(lái)，中醫(yī)藥在改善糖脂代謝方面取得了顯著成效。葛根芩連湯作為治療早中期腸道濕熱型T2DM 的代表方劑收錄于《中國(guó)2 型糖尿病防治指南》［4］。葛根芩連湯出自《傷寒論》，具有清利濕熱功效，在改善肝臟胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝糖異生方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［5-6］，但是其治療T2DM 的確切機(jī)制和靶點(diǎn)并不明確。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-通路” 多維網(wǎng)絡(luò)，探討葛根芩連湯治療T2DM 的分子機(jī)制，并通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可能機(jī)制，為葛根芩連湯改善糖脂代謝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 葛根芩連湯有效成分、靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái) （TCMSP），以藥物口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取葛根芩連湯有效成分，再借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，將其信息轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因。

1.1.2 2 型糖尿病疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因收集 以“type 2 diabetes mellitus” 為檢索詞，檢索 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中T2DM 靶點(diǎn)基因，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行人源基因轉(zhuǎn)換。

1.1.3 葛根芩連湯有效成分、T2DM 共同靶點(diǎn)基因的篩選及韋恩圖構(gòu)建 運(yùn)用Rx64 軟件處理葛根芩連湯有效成分的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)和T2DM 疾病靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行匹配和交集基因篩選，繪制韋恩圖。

1.1.4 有效成分-潛在作用靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用“Network Analysis” 功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析，根據(jù)Degree 值篩選出具有核心調(diào)控作用的化合物。

1.1.5 靶蛋白相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 采用STRING （https： / /string-db.org） 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，物種定位為人，設(shè)定置信度閾值＞0.90，將篩選的蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，對(duì)節(jié)點(diǎn)連接度進(jìn)行分析，篩選出核心靶點(diǎn)。

1.1.6 基因功能及生物通路富集分析 利用R 語(yǔ)言軟件包對(duì)潛在靶基因進(jìn)行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05。GO 分析中從生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成 （cellular component，CC）、分子功能 （molecular function，MF） 3 個(gè)方面來(lái)探究潛在靶基因的功能水平，KEGG 分析中識(shí)別葛根芩連湯干預(yù)T2DM 的生物學(xué)通路，以揭示其對(duì)T2DM 的干預(yù)機(jī)制。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物 C57BL/6J 小鼠40 只，雄性，SPF 級(jí)，12 周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2012-0002］，飼養(yǎng)條件為相對(duì)濕度50% ～70%。所有實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格遵守南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的相關(guān)準(zhǔn)則。

1.2.2 藥物 葛根、黃芩、黃連、甘草均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑室吳軍教授鑒定為正品，四者按8 ∶3 ∶3 ∶2 比例進(jìn)行配制［5］，采用傳統(tǒng)水煎法提取后濃縮至生藥量1.56 g/mL，取部分濃縮液稀釋至0.78 g/mL，分瓶保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 試劑與儀器 鹽酸吡格列酮片（江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20110048）。腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素17 （IL-17） ELISA 試劑盒和TNF-α、核因子κB （NF-κB）、β-actin 抗體 （英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab46070、ab100702、ab215188、ab16502、ab6276 ）。Biospectrum 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP 公司）； 組織切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）； 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2.4 建模與給藥 40 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為正常組（8 只） 和造模組（32 只）。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，批號(hào)2017416，含脂量60%） 喂養(yǎng)，4 周后腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液（45 mg/kg），持續(xù)3 d，注射后72 h，經(jīng)尾靜脈檢測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，即為造模成功。將造模組分為模型組、吡格列酮組和葛根芩連湯低、高劑量組，每組8 只，吡格列酮組灌胃吡格列酮30 mg/kg，葛根芩連湯低、高劑量組灌胃葛根芩連湯10、20 g/kg［5］，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，每天1 次，持續(xù)8 周，每周稱量小鼠體質(zhì)量以調(diào)整灌胃量。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè) 造模成功后，每周固定時(shí)間采大鼠尾靜脈血，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖（FBG）。末次給藥后小鼠禁食不禁水24 h，稱量體質(zhì)量，心臟采血后處死，全血離心后取血清，于-20 ℃下保存，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清空腹胰島素（FINS）、TNF-α、IL-17 水平； 采用穩(wěn)態(tài)模型（HOMA） 評(píng)估胰島素抵抗（IR） 數(shù)值，公式為HOMA-IR＝FBG×FINS/22.5。取各組大鼠肝組織，部分于10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，部分冷凍保存，Western blot 法檢測(cè)KEGG 富集核心通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，勻漿后使用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用BCA 試劑盒測(cè)定濃度，進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，使用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各蛋白條帶灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析； 不符合正態(tài)分布或方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯有效成分及靶點(diǎn)篩選 葛根芩連湯化學(xué)成分共489 種，按OB≥30%、DL≥0.18 條件篩選后得到146種有效成分，其中葛根4 種，黃芩36 種，黃連14 種，甘草92 種，刪除重復(fù)后共140 種，見(jiàn)表1。再使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行人源基因轉(zhuǎn)換，去重合并后得到212 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 葛根芩連湯有效成分（OB 值前二十位）

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn) 將 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中10 821 個(gè)T2DM 靶標(biāo)基因利用Venn 作圖軟件，得到204 個(gè)葛根芩連湯治療T2DM 相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 葛根芩連湯與T2DM 交集靶點(diǎn)Venn 圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn) 利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 軟件，構(gòu)建了包含204 個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選得到核心靶點(diǎn)18個(gè)，處于核心位置前十的關(guān)鍵靶點(diǎn)有JUN、AKT1、STAT3、MAPK3、FOS、MAPK1、MYC、MAPK14、ERS1、TP53，見(jiàn)圖3。

圖2 葛根芩連湯與T2DM 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI 核心靶點(diǎn)篩選流程圖

2.4 “中藥有效成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將葛根芩連湯的4 味中藥、140 種有效成分、204 個(gè)潛在靶點(diǎn)采用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“中藥有效成分-靶點(diǎn)-疾病” 可視化網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)“Network Analyzer” 功能對(duì)節(jié)點(diǎn)、邊的數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)19 種活性成分的degree、BC、CC 均高于平均值，其中排名前三的為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin），見(jiàn)圖4。

圖4 “中藥有效成分-靶點(diǎn)-疾病” 可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語(yǔ)言處理后進(jìn)行GO 功能、KEGG 通路富集分析。選取BP、CC、MF 顯著性排名前十者構(gòu)成GO 富集氣泡圖。GO-BP 主要涉及對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)等，GO-CC 主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等，GO-MF 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酰胺結(jié)合等，見(jiàn)圖5。對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共得到119 條信號(hào)通路，選取排名前二十者繪制氣泡圖，進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖6。進(jìn)一步對(duì)GO 生物過(guò)程和KEGG 通路按照P值篩選分析，結(jié)果顯示，TNF 通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路在T2DM 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，見(jiàn)圖7。

圖5 葛根芩連湯治療T2DM 的GO 功能富集分析

圖6 葛根芩連湯治療T2DM 的KEGG 通路分析

圖7 TNF 通路過(guò)程分析

2.6 葛根芩連湯對(duì)T2DM 小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增加 （P＜0.01），F(xiàn)BG、FINS 及HOMA-IR 水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均降低 （P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平變化（±s，n＝8）

2.7 葛根芩連湯對(duì)T2DM 小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 與正常組比較，模型組小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肝臟脂質(zhì)沉積、空泡變性及水樣變性； 與模型組比較，各給藥組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍腫大，呈放射狀排列，肝臟組織形態(tài)學(xué)紊亂減輕，可見(jiàn)散在脂肪空泡，邊界稍模糊，見(jiàn)圖9。

圖9 各組小鼠肝組織HE 染色（×400）

2.8 葛根芩連湯對(duì)T2DM 小鼠血清TNF-α、IL-17 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平降低（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較（±s，n＝8）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-17/（pg·mL-1）TNF-α/（ng·L-1）正常組58.04±8.2626.45±2.51模型組103.59±14.02**58.19±7.82**吡格列酮組65.37±9.45＃＃32.27±4.43＃＃葛根芩連湯低劑量組66.78±10.26＃＃31.25±4.60＃＃葛根芩連湯高劑量組62.31±8.62＃＃28.96±2.67＃＃

2.9 葛根芩連湯對(duì)T2DM 小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖10。

圖10 各組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達(dá)變化（±s，n＝8）

3 討論

越來(lái)越多研究證實(shí)，葛根芩連湯治療T2DM 療效確切［7-11］?！吨袊?guó)2 型糖尿病防治指南（2017 年版） 》 推薦葛根芩連湯用于治療早、中期腸道濕熱證T2DM［4］。然而，中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)十分復(fù)雜，這導(dǎo)致了其作用機(jī)制研究的不明確性。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起為中藥復(fù)方的研究提供了新的方法和思路，也為更好地理解中藥復(fù)方的藥效和療效機(jī)制提供了新的途徑。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，最終獲得葛根芩連湯140 種有效成分和212 個(gè)對(duì)應(yīng)藥物靶點(diǎn)。采用Venn 分析后得到204 個(gè)交集靶點(diǎn)； 通過(guò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選出關(guān)鍵基因18 個(gè)。根據(jù)degree 值篩選前3 位有效成分為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素。這3 種成分均屬于黃酮類化合物，可以提高胰島素敏感性和改善胰島β 細(xì)胞數(shù)目［12-15］。我國(guó)一項(xiàng)大型橫斷面研究顯示槲皮素?cái)z入量與T2DM 的患病率呈負(fù)相關(guān)［12］。槲皮素是一種天然多羥基黃酮類化合物，可以降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，抑制INS-1 細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌［13］。山柰酚可以增加Akt 和己糖激酶活性，降低肝臟中葡萄糖-6 磷酸酶的活性，并通過(guò)抑制肝臟中的糖異生發(fā)揮降糖作用［16］。漢黃芩素可通過(guò)胰島素受體-1/PI3K/堿性磷酸酶途徑促進(jìn)葡萄糖攝取和糖酵解，抑制肝細(xì)胞糖異生，改善胰島素抵抗［17］。上述研究表明，葛根芩連湯可能這3 種有效成分作用于關(guān)鍵靶蛋白來(lái)發(fā)揮治療T2DM 的作用。

GO 分析表明葛根芩連湯可能作用于多細(xì)胞組分產(chǎn)生不同生物學(xué)功能，從而發(fā)揮治療T2DM 的功效。KEGG 富集分析結(jié)果顯示葛根芩連湯治療T2DM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與TNF 信號(hào)通路等。隨著T2DM 發(fā)病機(jī)制的深入研究，很多學(xué)者認(rèn)為T2DM 可能是一種免疫性的炎性反應(yīng)性疾病，其中TNF-α 參與炎癥反應(yīng)及糖脂代謝的調(diào)節(jié)［18-20］。Skuratovskaia 等［21］發(fā)現(xiàn)，TNF-α 可以抑制胰島素受體底物-1的磷酸化進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，增加T2DM 病程的進(jìn)展。另外研究表明，TNF-α 可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性，使血管內(nèi)皮屏障功能受損； 此外，TNF-α 還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和脫落，從而增加糖尿病血管病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［22］。以上研究均表明，TNF-α 信號(hào)通路在T2DM 中發(fā)揮重要作用。

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯可以有效降低T2DM 小鼠胰島素、HOMA-IR、TNF-α 及IL-17 水平，改善高血糖狀態(tài)； 減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴積聚，有助于維持肝細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能； 降低肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的藥物作用靶點(diǎn)與實(shí)際藥物作用靶點(diǎn)有較高的一致性，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物與疾病靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。

綜上所述，葛根芩連湯治療T2DM 具有多成分、多靶點(diǎn)特性，其可能通過(guò)TNF-α 信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮降糖療效，這將為進(jìn)一步研究葛根芩連湯治療T2DM 的基礎(chǔ)研究提供一定的理論依據(jù)。