荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜建立及13 種成分測(cè)定

張艷欣，江美芳，2＃，王丹丹*

（1.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 200120； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120）

荊銀顆粒由荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風(fēng)、甘草9 味藥材組成，具有疏風(fēng)清熱、宣肺利咽的作用，臨床用于治療風(fēng)熱感冒［1］。方中荊芥辛溫疏解，溫而不燥，入肺肝二經(jīng)，為治風(fēng)溫之主藥［2］，而金銀花清熱解毒，宣散透表，為清熱解毒之要藥［3］； 臣藥四季青、蒲公英、大青葉均可清肺熱，增強(qiáng)君藥清熱解毒之功［4］； 佐藥魚腥草、牛蒡子具有宣肺化痰、解毒利咽之功［5-6］； 使藥甘草、防風(fēng)功效解毒和中、調(diào)和諸藥［7］。以往研究證實(shí)，荊銀顆粒具有抗炎、抗病毒作用［8-13］，被推薦用于H1N1 甲型流感病毒、COVID-19 新型冠狀病毒的預(yù)防與治療［14-17］。然而，荊銀顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有TLC鑒別、原兒茶醛含量測(cè)定［18-19］，難以全面評(píng)價(jià)該制劑整體質(zhì)量。

指紋圖譜［20-23］具有中藥多組分、多靶點(diǎn)的整體作用特點(diǎn)，是從全成分角度出發(fā)的一種現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制方法，比單一成分更全面。本實(shí)驗(yàn)建立荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷的含量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1 材料

Waters Acquity ARC 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Direct-Q 3UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）。

原兒茶酸（批號(hào)5668，純度100%）、咖啡酸（批號(hào)7403，純度99.7%）、隱綠原酸 （批號(hào)3208，純度98.0%）、升麻素苷（批號(hào)3246，純度99.6%）、甘草苷（批號(hào)9722，純度100.0%）、蘆丁（批號(hào)5981，純度91.7%）、木犀草苷（批號(hào)6567，純度99.3%）、異綠原酸B （批號(hào)3089，純度98.5%）、異綠原酸A （批號(hào)10639，純度99.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)6381，純度99.6%）、牛蒡子苷（批號(hào)5691、純度98.3%）對(duì)照品均購(gòu)自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)A22GB158496，純度99.4%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司； 異綠原酸C 對(duì)照品（批號(hào)22070639，純度98.0%） 購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司。

荊銀顆粒共23 批 （批號(hào)211201、220401、220402、220403、220404、220405、220406、220407、220408、220409、220410、220411、220412、220413、220414、220501、220502、220503、220504、220701、220704、220708、221203，編號(hào)S1 ～S23），由上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）； 流動(dòng)相0.1%磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～3 min，95% A； 3 ～16 min，95% ～90% A； 16 ～21 min，90% ～88% A；21～35 min，88% ～83%A； 35 ～55 min，83% ～70%A；55 ～65 min，70% ～55% A； 65 ～66 min，55% ～5%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，50% 甲醇溶解稀釋，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.458、0.548、0.438、0.678、0.386、0.234、0.321、0.309、0.356、0.436、0.386、0.504、0.245 mg/mL），密閉保存。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取23 批樣品，每批2.5 g，加入50% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（200 W、40 kHz） 處理30 min，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 單味飲片溶液 根據(jù)處方工藝，取荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風(fēng)、甘草單味飲片適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

純氮施用量為102 kg/hm2?；士墒┯脧?fù)合肥（10∶8∶24）594 kg/hm2，采用定點(diǎn)定位環(huán)行施肥法在理墑前施下。提苗肥在煙株移栽后7 d內(nèi)施加，30%的追肥在栽后20～25 d施加。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取本品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各共有峰峰面積RSD 均小于2.53%，相對(duì)出峰時(shí)間RSD 均小于0.46%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰峰面積RSD 均小于3.00%，相對(duì)出峰時(shí)間RSD 均小于0.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰峰面積RSD 均小于2.91%，相對(duì)出峰時(shí)間RSD 均小于0.16%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取23 批樣品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版） ” 建立指紋圖譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配，再通過中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜（R），見圖1。由此可知，共有16 個(gè)共有峰，其相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.03% ～0.43%，表明各批樣品出峰時(shí)間穩(wěn)定，同時(shí)由于綠原酸（峰4） 峰面積較大，保留時(shí)間適中，分離度較好，故選擇其作為參照峰（S）。另外，各批樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜的相似度均超過0.970，可用于其整體質(zhì)量控制。

圖1 23 批荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for twenty-three batches of Jingyin Granules

圖2 對(duì)照品HPLC 色譜圖（A）、對(duì)照指紋圖譜（B）Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances （A）and reference fingerprint （B）

圖3 荊銀顆粒、單味飲片HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Jingyin Granules and single decoction pieces

2.4 各成分含量測(cè)定

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取本品適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰均具有良好的分離度、峰形對(duì)稱性，并且與相應(yīng)對(duì)照品一一匹配，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取各對(duì)照品適量，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備不同質(zhì)量濃度的相應(yīng)溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Results of content determination of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取本品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.17%、0.48%、0.64%、0.09%、0.73%、0.26%、2.10%、2.53%、1.18%、2.44%、0.76%、0.82%、2.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.20%、0.24%、0.81%、0.54%、0.25%、1.23%、2.60%、1.45%、2.09%、0.97%、0.56%、2.42%、0.39%，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.07%、0.70%、0.58%、0.15%、0.89%、1.42%、2.73%、0.78%、2.58%、1.23%、2.87%、0.71%、1.41%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品9 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備與供試品溶液中各成分含量相同的對(duì)照品溶液，分別按后者的0.5、1.0、1.5 倍加到供試品溶液中，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷平均加樣回收率分別為99.87%、100.98%、97.26%、96.34%、98.13%、101.55%、98.77%、96.05%、101.96%、100.84%、97.29%、102.06%、99.91%，RSD 分別為1.97%、0.98%、1.37%、1.99%、2.16%、1.09%、1.97%、2.06%、1.74%、1.45%、2.76%、1.21%、1.04%。

2.4.7 樣品含量測(cè)定 取23 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （%，n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先考察了水及不同體積分?jǐn)?shù)（10%、25%、50%、75%、100%） 甲醇、乙醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取時(shí)各成分色譜峰數(shù)量較多，響應(yīng)強(qiáng)度整體較強(qiáng)，故選擇其作為提取溶劑。再進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在210 nm 處各成分色譜峰數(shù)量較多，并且均有較強(qiáng)吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

23 批荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜中有16 個(gè)共有峰，并鑒定出其中13 個(gè)，覆蓋了方中全部9 味藥材的特征成分，主要為有機(jī)酸、黃酮、木脂素、色原酮等。其中，君藥荊芥標(biāo)定了6 個(gè)，金銀花標(biāo)定了7 個(gè)，主要為有機(jī)酸、黃酮，也是具有抗菌、抗病毒、抗炎活性的藥效物質(zhì)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷的含量，有助于該制劑整體質(zhì)量控制，可為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持，也能為其后續(xù)深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。