UHPLC-MS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中19 種成分

馬志會，成麗媛，張 玥，3，周 昆，3*

（1.晉城大醫(yī)院，山西 晉城 048006； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617； 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

壯骨關(guān)節(jié)膠囊由熟地黃、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、桑寄生、狗脊、乳香、沒藥、雞血藤、獨活、木香12 味中藥組成［1］，具有舒經(jīng)活絡(luò)、養(yǎng)血活血、理氣止痛功效，臨床常用于治療氣滯血瘀、肝腎不足、經(jīng)絡(luò)痹阻所致的退行性骨關(guān)節(jié)病、腰肌勞損等疾病［2-4］。

目前，對壯骨關(guān)節(jié)膠囊的研究大多為臨床、藥效方面［5-8］，鮮有涉及含量測定［9-10］，并且主要是采用HPLC 法分析單一成分（如補(bǔ)骨脂素等），缺少多種成分全面檢測。因此，本實驗建立UHPLCMS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 TripleQuad 4500 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）； LD-30A UHPLC超高效液相色譜儀（日本島津公司）； Legend Micro 21R 低溫高速離心機(jī)（美國Thermo 公司）； XS204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； SK5200Hp 超聲波清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Integral 5 純水機(jī)（美國密理博公司）； Concentrator plus 真空濃縮儀（德國Eppendorf 公司）。

1.2 試劑與藥物 毛蕊花糖苷（批號19082201）、淫羊藿苷 （批號18012906）、朝藿定A （批號17022003）、柚皮苷（批號18032101）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ （ 批號 19121901 ）、槲皮素 （ 批號19082203）、槲皮苷（批號19091104）、異槲皮苷（批號18082901）、補(bǔ)骨脂素 （批號19101703）、異補(bǔ)骨脂素（批號19101704）、補(bǔ)骨脂酚（批號18041103）、補(bǔ)骨脂甲素（批號16110701）、補(bǔ)骨脂乙素（批號16061203）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號16091201）、刺芒柄花素（批號18032702）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號19091001）、蛇床子素（批號16061303） 對照品均購自成都普菲德生物科技有限公司，純度均≥98%； 朝藿定B （批號MUST-16071403）、朝藿定 C （ 批號 MUST-16070705） 對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%。

壯骨關(guān)節(jié)膠囊共7 批，購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，編號S1 （批號1908001S）、S2 （批號1909001S）、S3 （批號 1909002S）、S4 （批號1909003S）、S5 （批號 1909004S）、S6 （批號1909005S）、S7 （批號1909006S）。

甲醇、乙腈為色譜純，購自德國Merck 公司；乙酸乙酯為分析純，購自天津市匯杭化工科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 UHPLC-MS/MS 分析條件

2.1.1 色譜 Hypersil GOLD Selectivity C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）； 流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～1 min，5% ～12%B； 1～3 min，12% ～25%B； 3 ～7 min，25% ～36%B； 7～8 min，36% B； 8 ～11 min，36% ～56% B；11～13 min，56% ～60% B； 13 ～16 min，60% B；16～17 min，60% ～78% B，17 ～18 min，78% B；18～20 min，78% ～5%B； 20 ～22 min，5%B）； 體積流量0.2 mL/min； 柱溫40 ℃； 進(jìn)樣量3 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； 正負(fù)離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM） 模式； 離子噴霧電壓±4 500 V； 源溫度500 ℃； GAS I、GASⅡ、氣簾氣壓力40、50、10 psi （1 psi ＝6.895 kPa），其他主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分主要質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的溶液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供試品溶液 精密稱定本品內(nèi)容物0.2 g，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，密封超聲提取30 min，取出，放冷至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，甲醇稀釋20 倍，即得，在4 ℃下保存。檢測前精密吸取100 μL，揮干后加100 μL 50% 乙腈復(fù)溶。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜柱在相應(yīng)保留時間處無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分UHPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，甲醇稀釋成7 個質(zhì)量濃度，取適量混合，精密吸取100 μL 后揮干，加100 μL 50%乙腈復(fù)溶，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，并以S/N≥3 為檢測限，S/N≥10 為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定6 次，測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為1.75%、1.59%、0.74%、1.15%、1.13%、1.69%、1.48%、1.59%、1.87%、1.97%、1.85%、1.53%、1.18%、1.79%、1.55%、1.71%、1.76%、1.79%、1.70%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密吸取同一批本品（S5），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為1.67%、0.67%、1.84%、1.78%、1.83%、0.94%、1.54%、1.66%、1.62%、1.27%、1.57%、1.66%、1.96%、1.64%、1.55%、1.53%、1.41%、1.51%、1.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批本品（S5），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，于0、6、24 h 在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為2.96%、3.78%、2.17%、4.17%、3.97%、4.29%、3.14%、1.81%、2.82%、2.42%、3.16%、1.51%、2.06%、4.12%、3.40%、2.39%、0.96%、2.27%、2.94%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一批本品（S5） 0.1 g，加入等量對照品，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素平均加樣回收率分別為99.34%、101.78%、98.55%、100.22%、99.97%、101.24%、100.56%、98.89%、99.59%、102.01%、99.35%、99.89%、99.18%、100.24%、100.08%、99.59%、101.44%、99.94%、101.32%，RSD 分別為1.44%、0.99%、1.45%、1.36%、2.06%、1.89%、2.89%、1.68%、2.10%、1.69%、1.80%、1.58%、1.99%、0.98%、2.44%、3.32%、1.65%、2.38%、1.87%。

2.4 樣品含量測定 取7 批樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別精密吸取100 μL，在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝6）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝6）

3 討論

本實驗首先考察了不同體積分?jǐn)?shù) （50%、70%、100%） 甲醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時各成分色譜峰峰形穩(wěn)定，響應(yīng)值高，故選擇其作為提取溶劑。再考察了以水-乙腈洗脫時各成分色譜行為，發(fā)現(xiàn)個別色譜峰峰形響應(yīng)值較低，故在水相中加入0.1%甲酸，此時大多數(shù)峰形有所改善，響應(yīng)值更高，故選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相。

含量測定結(jié)果顯示，各成分含量總體上較穩(wěn)定，與文獻(xiàn)［10-17］ 報道一致，但個別成分存在一定差異，這可能與所用藥材產(chǎn)地、批次有關(guān)，其中補(bǔ)骨脂所含成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮含量在S1～S4 批次樣品中較穩(wěn)定，而在S5 ～S7 批次樣品中明顯更高，并且補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚差異較大。大量研究表明，不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂中有效成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量存在差異［18-20］，故應(yīng)考慮其產(chǎn)地、批次、采收時間等因素以減小批間差異。

4 結(jié)論

本實驗建立UHPLC-MS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素的含量，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，符合分析要求，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。