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    UHPLC-MS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中19 種成分

    2023-10-30 06:11:50馬志會成麗媛
    中成藥 2023年10期
    關(guān)鍵詞:補(bǔ)骨脂素槲皮苷乙素

    馬志會,成麗媛,張 玥,3,周 昆,3*

    (1.晉城大醫(yī)院,山西 晉城 048006; 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津 301617; 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室,天津 301617)

    壯骨關(guān)節(jié)膠囊由熟地黃、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、桑寄生、狗脊、乳香、沒藥、雞血藤、獨活、木香12 味中藥組成[1],具有舒經(jīng)活絡(luò)、養(yǎng)血活血、理氣止痛功效,臨床常用于治療氣滯血瘀、肝腎不足、經(jīng)絡(luò)痹阻所致的退行性骨關(guān)節(jié)病、腰肌勞損等疾病[2-4]。

    目前,對壯骨關(guān)節(jié)膠囊的研究大多為臨床、藥效方面[5-8],鮮有涉及含量測定[9-10],并且主要是采用HPLC 法分析單一成分(如補(bǔ)骨脂素等),缺少多種成分全面檢測。因此,本實驗建立UHPLCMS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素的含量,以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器 TripleQuad 4500 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司); LD-30A UHPLC超高效液相色譜儀(日本島津公司); Legend Micro 21R 低溫高速離心機(jī)(美國Thermo 公司); XS204電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SK5200Hp 超聲波清洗器 (上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);Integral 5 純水機(jī)(美國密理博公司); Concentrator plus 真空濃縮儀(德國Eppendorf 公司)。

    1.2 試劑與藥物 毛蕊花糖苷(批號19082201)、淫羊藿苷 (批號18012906)、朝藿定A (批號17022003)、柚皮苷(批號18032101)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ ( 批號 19121901 )、槲皮素 ( 批號19082203)、槲皮苷(批號19091104)、異槲皮苷(批號18082901)、補(bǔ)骨脂素 (批號19101703)、異補(bǔ)骨脂素(批號19101704)、補(bǔ)骨脂酚(批號18041103)、補(bǔ)骨脂甲素(批號16110701)、補(bǔ)骨脂乙素(批號16061203)、新補(bǔ)骨脂異黃酮(批號16091201)、刺芒柄花素(批號18032702)、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(批號19091001)、蛇床子素(批號16061303) 對照品均購自成都普菲德生物科技有限公司,純度均≥98%; 朝藿定B (批號MUST-16071403)、朝藿定 C ( 批號 MUST-16070705) 對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司,純度均≥98%。

    壯骨關(guān)節(jié)膠囊共7 批,購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司,編號S1 (批號1908001S)、S2 (批號1909001S)、S3 (批號 1909002S)、S4 (批號1909003S)、S5 (批號 1909004S)、S6 (批號1909005S)、S7 (批號1909006S)。

    甲醇、乙腈為色譜純,購自德國Merck 公司;乙酸乙酯為分析純,購自天津市匯杭化工科技有限公司。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 UHPLC-MS/MS 分析條件

    2.1.1 色譜 Hypersil GOLD Selectivity C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm); 流動相0.1% 甲酸(A) -乙腈(B),梯度洗脫(0 ~1 min,5% ~12%B; 1~3 min,12% ~25%B; 3 ~7 min,25% ~36%B; 7~8 min,36% B; 8 ~11 min,36% ~56% B;11~13 min,56% ~60% B; 13 ~16 min,60% B;16~17 min,60% ~78% B,17 ~18 min,78% B;18~20 min,78% ~5%B; 20 ~22 min,5%B); 體積流量0.2 mL/min; 柱溫40 ℃; 進(jìn)樣量3 μL。

    2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI); 正負(fù)離子掃描; 多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式; 離子噴霧電壓±4 500 V; 源溫度500 ℃; GAS I、GASⅡ、氣簾氣壓力40、50、10 psi (1 psi =6.895 kPa),其他主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表1 各成分主要質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

    2.2 溶液制備

    2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量,置于10 mL 量瓶中,甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的溶液,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

    2.2.2 供試品溶液 精密稱定本品內(nèi)容物0.2 g,置于25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,稱定質(zhì)量,密封超聲提取30 min,取出,放冷至室溫,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,取上清液,0.22 μm 微孔濾膜過濾,甲醇稀釋20 倍,即得,在4 ℃下保存。檢測前精密吸取100 μL,揮干后加100 μL 50% 乙腈復(fù)溶。

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分色譜柱在相應(yīng)保留時間處無干擾,表明該方法專屬性良好。

    圖1 各成分UHPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of various constituents

    2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量,甲醇稀釋成7 個質(zhì)量濃度,取適量混合,精密吸取100 μL 后揮干,加100 μL 50%乙腈復(fù)溶,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積(Y) 對其質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行回歸,并以S/N≥3 為檢測限,S/N≥10 為定量限,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

    2.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定6 次,測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為1.75%、1.59%、0.74%、1.15%、1.13%、1.69%、1.48%、1.59%、1.87%、1.97%、1.85%、1.53%、1.18%、1.79%、1.55%、1.71%、1.76%、1.79%、1.70%,表明儀器精密度良好。

    2.3.4 重復(fù)性試驗 精密吸取同一批本品(S5),按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定,測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為1.67%、0.67%、1.84%、1.78%、1.83%、0.94%、1.54%、1.66%、1.62%、1.27%、1.57%、1.66%、1.96%、1.64%、1.55%、1.53%、1.41%、1.51%、1.96%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批本品(S5),按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液,于0、6、24 h 在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定,測得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素含量RSD 分別為2.96%、3.78%、2.17%、4.17%、3.97%、4.29%、3.14%、1.81%、2.82%、2.42%、3.16%、1.51%、2.06%、4.12%、3.40%、2.39%、0.96%、2.27%、2.94%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一批本品(S5) 0.1 g,加入等量對照品,按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定,計算回收率。結(jié)果,毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素平均加樣回收率分別為99.34%、101.78%、98.55%、100.22%、99.97%、101.24%、100.56%、98.89%、99.59%、102.01%、99.35%、99.89%、99.18%、100.24%、100.08%、99.59%、101.44%、99.94%、101.32%,RSD 分別為1.44%、0.99%、1.45%、1.36%、2.06%、1.89%、2.89%、1.68%、2.10%、1.69%、1.80%、1.58%、1.99%、0.98%、2.44%、3.32%、1.65%、2.38%、1.87%。

    2.4 樣品含量測定 取7 批樣品,按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液,分別精密吸取100 μL,在“2.1” 項條件下進(jìn)樣測定,計算含量,結(jié)果見表3。

    表3 各成分含量測定結(jié)果(mg/g,n=6)Tab.3 Results of content determination of various constituents (mg/g,n=6)

    3 討論

    本實驗首先考察了不同體積分?jǐn)?shù) (50%、70%、100%) 甲醇的提取效果,發(fā)現(xiàn)甲醇提取時各成分色譜峰峰形穩(wěn)定,響應(yīng)值高,故選擇其作為提取溶劑。再考察了以水-乙腈洗脫時各成分色譜行為,發(fā)現(xiàn)個別色譜峰峰形響應(yīng)值較低,故在水相中加入0.1%甲酸,此時大多數(shù)峰形有所改善,響應(yīng)值更高,故選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相。

    含量測定結(jié)果顯示,各成分含量總體上較穩(wěn)定,與文獻(xiàn)[10-17] 報道一致,但個別成分存在一定差異,這可能與所用藥材產(chǎn)地、批次有關(guān),其中補(bǔ)骨脂所含成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮含量在S1~S4 批次樣品中較穩(wěn)定,而在S5 ~S7 批次樣品中明顯更高,并且補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚差異較大。大量研究表明,不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂中有效成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量存在差異[18-20],故應(yīng)考慮其產(chǎn)地、批次、采收時間等因素以減小批間差異。

    4 結(jié)論

    本實驗建立UHPLC-MS/MS 法同時測定壯骨關(guān)節(jié)膠囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、刺芒柄花素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素的含量,該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,符合分析要求,可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

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