白頭翁散煎劑發(fā)酵物對感染豬流行性腹瀉病毒仔豬腸道屏障功能的影響

常偉辰,李帥奇,李 琰,閆 微,張紅英,王彥彬,楊明凡,張昂克

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是引起初生仔豬腹瀉的主要病毒性疾病之一,可感染所有年齡的豬, 7～10 d的仔豬死亡率高達(dá)80%～100%[1],PEDV毒株的變異以及多種腹瀉病毒的交叉感染導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗對PEDV感染的保護(hù)有限[2]。中藥的應(yīng)用效果和安全性已得到廣泛驗(yàn)證,成為畜牧業(yè)疾病防治的研究熱點(diǎn)。白頭翁散臨床上常用于治療腹瀉,含有多種活性成分(如白頭翁皂苷、小檗堿、鹽酸巴馬汀等),具有抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用,主要作用于胃腸道[3];對潰瘍性結(jié)腸炎有良好的治療效果[4],還可通過調(diào)節(jié)小鼠TLR4/Myd88信號通路治療流感病毒FM1誘導(dǎo)的肺炎[5]。益生菌發(fā)酵可裂解植物細(xì)胞壁并轉(zhuǎn)化其代謝產(chǎn)物,提高中藥的功效和適口性,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強(qiáng)腸道功能,從而達(dá)到防控疾病及健康養(yǎng)殖的目的[6]。如中藥及其乳桿菌發(fā)酵物可改善頭孢曲松鈉引起的小鼠異常腹瀉[7];枯草芽胞桿菌發(fā)酵中藥可調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群組成,顯著提高前腸中雙歧桿菌的相對豐度[8]。此外,益生菌定植于宿主腸道,發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和增強(qiáng)免疫功能的作用[9]。因此,擬建立PEDV感染模型,探究白頭翁散能否減輕感染PEDV仔豬的腸道損傷。尚未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道白頭翁散在減輕感染PEDV仔豬腸道損傷和調(diào)節(jié)腸道菌群方面的作用,本研究將為預(yù)防或治療PEDV感染提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

干酪乳酸桿菌R、豬流行性腹瀉病毒(PEDV,HN2021)均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;黃連、黃柏、白頭翁和秦皮購自北京同仁堂股份有限公司。

煎劑根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定配伍,將黃柏(45 g)、黃連(30 g)、白頭翁(60 g)、秦皮(60 g)等原藥材在常溫下用蒸餾水浸泡1.5 h,再用2 000 mL蒸餾水煎煮2次,每次1 h,最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 g·mL-1,保存于4 ℃。將干酪乳酸桿菌R在無菌液體MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h,菌液(4%)添加到白頭翁散煎劑中(100 mL),用食品級Na2CO3調(diào)節(jié)pH至6.5,37 ℃培養(yǎng)24 h,菌落達(dá)到109CFU·mL-1[7]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)方案遵循河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物護(hù)理和使用專業(yè)委員會批準(zhǔn)[許可證編號SCXK(河南)2013-0001]。從PEDV陰性農(nóng)場購買24頭7日齡體重相近(杜×長×大)雜交仔豬,采用隔離室飼養(yǎng),每個隔離室有單獨(dú)的通風(fēng)和排水系統(tǒng),防止交叉污染。將仔豬隨機(jī)分為4組:對照組,PEDV組,煎劑組,發(fā)酵組,每組3個重復(fù)。試驗(yàn)期為12 d,經(jīng)過3 d適應(yīng)期,第4天對照組接種生理鹽水,其他3組中每頭仔豬以104.5TCID50劑量接種PEDV(HN2021);第5～9天,煎劑組和發(fā)酵組每天灌服煎劑和發(fā)酵液(0.2 mL·kg-1);經(jīng)過3 d觀察期,第12天,前腔靜脈采集血液,然后處死全部仔豬,收集腸道樣本并用4%多聚甲醛固定或液氮速凍,-80 ℃保存待用。

1.3 生長性能與腹瀉指數(shù)指標(biāo)

試驗(yàn)期間每天記錄仔豬體重、腹瀉和采食量,收集新鮮糞便進(jìn)行活菌培養(yǎng)。糞便評分如Zhang等[10]描述,分為4個等級:0=正常,1=糊狀,2=半液體,3=液體。分?jǐn)?shù)≥2為腹瀉。計(jì)算公式:平均日增重(ADG)=總增重/試驗(yàn)時間。

料肉比(F/G)=每頭仔豬總采食量/每頭仔豬總增重。

1.4 腸道細(xì)菌組成指標(biāo)

新鮮糞便均質(zhì)后在生理鹽水中梯度稀釋,將稀釋度為10-1～10-7的樣品涂布在不同的選擇性瓊脂培養(yǎng)基上。采用平板計(jì)數(shù)法對大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.5 腸道中病毒拷貝量指標(biāo)

將0.5～1.0 cm的腸道樣本切成碎片, 加入1 mL TRIzol進(jìn)行RNA提取,用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量,隨后使用Prime-ScriptTM試劑盒合成cDNA。引物序列如表1所示。qRT-PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒建立,并在應(yīng)用生物系統(tǒng)7500快速RT-PCR上進(jìn)行分析,反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,39個循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)部對照,采用2-ΔΔCt法檢測目的基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.6 腸道形態(tài)和屏障功能指標(biāo)

將腸道樣本的固定組織沿橫切面切成約1 cm的管狀,4%多聚甲醛固定,經(jīng)過脫水,透明并包埋在石蠟中,切片至4 μm厚,蘇木精-伊紅染色后晾干制片,測量絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)、絨毛高度/隱窩深度的比值(VH/CD)。

將采集的血液樣本在4 ℃下、3 000 r·min-1離心10 min,獲得血清。按照試劑盒說明書中提供的步驟和方法檢測血清中D-木糖含量,腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)和二胺氧化物(DAO)的活性。

1.7 血清和腸道抗氧化酶指標(biāo)

稱取0.15 g腸道組織,剪碎混勻制備10%的組織勻漿,3 000 r·min-1離心10 min,取上清,用于檢測抗氧化指標(biāo)。根據(jù)試劑盒的說明書檢測血清和腸道中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 對生長性能和PEDV復(fù)制的影響

由圖1可知,PEDV感染前,4組間仔豬平均日增重(ADG)和料肉比(F/G)無明顯差異,無腹瀉現(xiàn)象;PEDV感染后仔豬ADG顯著降低,F/G顯著升高(P<0.05);灌藥可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象,患病仔豬ADG顯著升高(P<0.05)。感染PEDV仔豬糞便評分顯著升高,與PEDV組相比,灌藥后糞便評分顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明灌藥后可改善患病仔豬的生長性能,降低腹瀉率。

A. 平均日增重(ADG);B. 料肉比(F/G);C. 糞便評分;D. PEDV復(fù)制。差異顯著性以小寫字母表示,標(biāo)有相同字母為差異不顯著(P>0.05),標(biāo)記字母不同為差異顯著(P<0.05),下同A. Average daily gain (ADG); B. Feed to meat ratio (F/G); C. Fecal score; D. PEDV replication. The significance of the difference is indicated by lowercase letters, the same letter means the difference is not significant (P>0.05), and the different letter means the difference is significant (P<0.05), the same as below圖1 灌藥對平均日增重、料肉比、糞便評分和PEDV復(fù)制的影響Fig.1 Effect of administration on Average daily gain,feed to meat ratio, fecal score and PEDV replication

為了檢測灌藥對腸道中病毒復(fù)制的影響,檢測了PEDVM基因在十二指腸,空腸和回腸中的表達(dá)量。結(jié)果表明,PEDV感染后M基因在十二指腸、空腸和回腸中均高表達(dá),對照組未檢測到M基因表達(dá)。與PEDV組相比,煎劑組和發(fā)酵組M基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。表明灌藥后可顯著抑制PEDV在腸道中的復(fù)制。

2.2 對腸道細(xì)菌組成的影響

由圖2可知,與對照組相比,PEDV組第5、7、10天大腸桿菌和沙門菌數(shù)量顯著增加,乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著減少(P<0.05),表明感染PEDV仔豬腸道菌群組成遭到破壞,灌藥后腸道菌群組成顯著改善,乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)。發(fā)酵組第10天乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加,與對照組相比也有顯著升高的趨勢(P<0.05)。

表明灌藥后可改善患病仔豬腸道細(xì)菌組成,有助于乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。

A.大腸桿菌的活菌計(jì)數(shù);B. 灌藥對沙門菌數(shù)量的影響;C. 灌藥對乳酸桿菌數(shù)量的影響;D. 灌藥對雙歧桿菌數(shù)量的影響A. Live bacteria counts of Escherichia coli; B. Live bacteria counts of Salmonella; C. Live bacteria counts of Lactobacillus; D. Live bacteria counts of Bifidobacterium 圖2 灌藥對試驗(yàn)第5、7和10天大腸桿菌、沙門菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的影響Fig.2 Effect of administration on the number of Escherichia coli,Salmonella, Lactobacillus and Bifidobacterium on days 5, 7 and 10 of test

2.3 對腸道形態(tài)和屏障功能的影響

由圖3可知,對照組腸道絨毛結(jié)構(gòu)正常,無明顯組織學(xué)病變。PEDV感染后組織學(xué)病變主要出現(xiàn)在十二指腸、空腸和回腸,表現(xiàn)為腸絨毛萎縮、溶解,腸腺損傷,上皮細(xì)胞部分脫落,灌藥后可大量減少組織病變。PEDV組十二指腸、空腸和回腸VH降低,CD增加,灌藥后各腸道組織中VH顯著升高,CD顯著降低,VH/CD顯著升高(P<0.05)(圖4)。表明灌藥后可改善患病仔豬的腸道形態(tài)。

紅箭頭.絨毛溶解,萎縮,損傷,上皮細(xì)胞排列不規(guī)則Red arrow. Villus dissolution, atrophy,damage, and epithelial cells arranged irregularly圖3 灌藥對十二指腸,空腸和回腸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響(蘇木精-伊紅染色,100×)Fig.3 Effect of administration on the histopathological structure of duodenum, jejunum and ileum (hematoxylin and eosin staining, 100×)

A. 絨毛高度(VH);B. 隱窩深度(CD);C. 絨毛高度/隱窩深度(VH/CD);D. D-木糖、二胺氧化物和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平A. Villus height (VH); B. Crypt depth (CD); C. Villus height/crypt depth (VH/CD); D. D-xylose, diamine oxide (DAO) and intestinal fatty acid binding protein (I-FABP) level圖4 灌藥對絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度以及D-木糖、二胺氧化物(DAO)和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)水平的影響Fig.4 Effect of administration on villus height,crypt depth, villus height /crypt depth, D-xylose, diamine oxide and intestinal fatty acid binding protein level

由圖4可知,PEDV感染后血清中D-木糖含量顯著降低(P<0.05),I-FABP和DAO濃度均顯著提高(P<0.05)。相比之下,灌藥后可顯著提高D-木糖含量,降低血漿中I-FABP的濃度(P<0.05),表明灌藥后可增強(qiáng)腸道屏障功能。

2.4 對血清和腸道抗氧化酶的影響

由圖5可知,PEDV組血清中GSH-Px活性以及血清和十二指腸T-SOD活性均顯著降低(P<0.05),十二指腸,空腸和回腸中MDA含量顯著升高(P<0.05)。然而,灌藥后PEDV感染仔豬十二指腸,空腸和回腸中GSH-Px活性以及MDA含量顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,灌藥后回腸GSH-Px活性和空腸MDA含量無顯著性差異(P>0.05)。表明灌藥后可改善患病仔豬血清和腸道中的抗氧化酶水平,提高抗氧化能力。

A. 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性;B. 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;C. 丙二醛(MDA)含量A. Glutathione peroxidase (GSH-Px) activity; B. Total superoxide dismutase (T-SOD) activity; C. Malondialdehyde (MDA) content圖5 灌藥對谷胱甘肽過氧化物酶活性、總超氧化物歧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig.5 Effect of administration on glutathione peroxidase activity,total superoxide dismutase activity, and malondialdehyde content

3 討 論

PEDV感染臨床癥狀包括腹瀉、嘔吐,以及體重減輕,與PEDV引起的腸道功能障礙密切相關(guān)[11]。本試驗(yàn)中,灌服白頭翁散煎劑和發(fā)酵液可顯著提高感染PEDV仔豬的ADG,從而改善患病仔豬的生長性能。白頭翁散對生長性能的有利作用可能是通過增強(qiáng)腸道功能來促進(jìn)腸道吸收,與此觀點(diǎn)一致的是,感染PEDV仔豬腹瀉減輕,如糞便評分降低所示。值得注意的是,發(fā)酵液治療效果優(yōu)于煎劑,表明發(fā)酵后白頭翁散復(fù)方中的活性成分大量釋放,并且添加干酪乳桿菌R有助于減少腹瀉。據(jù)報(bào)道,羅氏乳桿菌HY25101治療可降低PEDV引起的腹瀉和死亡率[12]。此外,作者發(fā)現(xiàn)十二指腸中病毒拷貝量最高,這與Jung等[13]的研究結(jié)果不一致,Jung等認(rèn)為空腸和回腸是PEDV復(fù)制的主要靶點(diǎn)。這種差異可能是由于檢測方法和毒株的不同,重要的是白頭翁散煎劑及其發(fā)酵液均可降低腸道組織中病毒基因的表達(dá)。

PEDV感染與腸道菌群之間存在潛在關(guān)聯(lián),調(diào)節(jié)腸道菌群有助于降低PEDV的發(fā)病率和死亡率[14]。中藥可通過增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量改善腹瀉引起的腸道菌群紊亂[15]。作者發(fā)現(xiàn)白頭翁散可提高PEDV感染仔豬腸道益生菌數(shù)量,抑制有害菌群,這與白頭翁皂苷通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成,改善大鼠炎癥的發(fā)現(xiàn)一致。乳酸菌可改善仔豬腹瀉,提高腸道細(xì)胞對大腸桿菌的抵抗力[16]。目前尚不清楚腸道中乳酸桿菌數(shù)量的增加是否抑制PEDV感染,但有助于抑制有害菌群增殖,增強(qiáng)腸道免疫。腸道菌群組成對胃腸功能和健康至關(guān)重要,調(diào)節(jié)腸道菌群可能是預(yù)防或治療PED的一種措施。需要進(jìn)一步研究來確定菌群物種水平上的具體變化,尤其是乳酸菌群。

PEDV感染易產(chǎn)生大量氧自由基,導(dǎo)致氧化損傷;MDA含量作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志,可用來判斷細(xì)胞的損傷程度[17]。在本試驗(yàn)中,感染PEDV仔豬十二指腸、空腸和回腸MDA含量顯著升高,這與Wang等[18]的發(fā)現(xiàn)一致。作者發(fā)現(xiàn)灌藥可顯著降低MDA含量,升高血清和十二指腸中T-SOD活性,表明白頭翁散可調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài),減輕氧化損傷。

PEDV感染主要破壞腸道上皮細(xì)胞和絨毛形態(tài),可引起肉眼可見和顯微鏡下的組織學(xué)病變[19],白頭翁散煎劑和發(fā)酵液可使患病仔豬腸黏膜損傷明顯降低,表明白頭翁散有助于保護(hù)感染PEDV仔豬的腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。此外,PEDV感染顯著降低D-木糖含量,提高DAO活性,引起腸道功能障礙,作者發(fā)現(xiàn)灌藥治療扭轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象,從而增強(qiáng)腸道屏障功能?？紤]到患病仔豬腹瀉率的降低,調(diào)節(jié)腸道菌群組成以及腸道形態(tài)和屏障功能的改善,可認(rèn)為白頭翁散有利于PEDV感染仔豬的腸道健康。

4 結(jié) 論

白頭翁散可增強(qiáng)感染PEDV仔豬的腸道屏障功能,且灌服煎劑發(fā)酵物的治療效果優(yōu)于煎劑,具有改善患病仔豬生長性能、降低腹瀉率,調(diào)節(jié)腸道菌群組成,保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性和增強(qiáng)腸道屏障功能,并提高抗氧化能力。