大型艾美耳球蟲重組蛋白GAPDH對(duì)兔的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

鄭若愚,肖 潔,白 鑫,陳 浩,蒲家艷,任永軍,楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130;2.四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066;3.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066)

大型艾美耳球蟲(Eimeriamagna)具有明顯的致病性,是兔球蟲中的常見蟲種之一[1-2]。在大型艾美耳球蟲裂殖生殖時(shí)期,裂殖子進(jìn)入腸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育繁殖,新的裂殖子產(chǎn)生后逸出,再進(jìn)入新的上皮細(xì)胞內(nèi),如此反復(fù),嚴(yán)重破壞腸道組織,損壞絨毛結(jié)構(gòu),導(dǎo)致疾病發(fā)作[3-4]。藥物預(yù)防是目前兔業(yè)生產(chǎn)中防治兔球蟲的主要手段[5-7],但由于球蟲耐藥性增強(qiáng)以及藥物在兔肉中殘留等問題,免疫防控越來越受到人們的關(guān)注。目前已選育出大型艾美耳球蟲的早熟株[8-9],并建立了大型艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因蟲株[10]。同時(shí),采用基因工程技術(shù)來研制安全、有效的兔球蟲新型疫苗也是一個(gè)很有吸引力的研究方向。其中,重組亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)較為成熟,該系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn),而篩選具有良好免疫保護(hù)效果的疫苗抗原蛋白,無疑是重組亞單位疫苗研制的關(guān)鍵[11]。

三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是催化糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,該酶在真核生物以及原核生物中廣泛存在,且表達(dá)水平高[12-13]。日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)[14-17]、曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)[18-20]、旋盤尾絲蟲(Onchocercavolvlus)[21-22]、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)[23]和雞巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)[24]的GAPDH可作為重組亞單位疫苗候選抗原。目前尚無有關(guān)兔大型艾美耳球蟲GAPDH的研究報(bào)道,本研究基于實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的大型艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出Em-GAPDH基因,通過原核表達(dá)獲得了重組蛋白rEm-GAPDH,通過動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)了rEm-GAPDH的免疫保護(hù)效果,為兔大型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可與倫理聲明

本實(shí)驗(yàn)所有程序均按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)(中國,雅安)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與使用規(guī)則的要求進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào):2019-189)。

1.2 材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用蟲株、cDNA及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大型艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的cDNA(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、裂殖體和配子體)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心自繁自養(yǎng)的無球蟲新西蘭兔50只(雌雄各半),體重為1.1 kg±0.2 kg。幼兔在18日齡斷奶,使用人用嬰兒奶粉飼喂至30日齡。實(shí)驗(yàn)兔雌雄分開,每2只飼養(yǎng)于不銹鋼籠具中,飼養(yǎng)籠經(jīng)火焰噴燒處理,在底部放置塑料隔板,減少實(shí)驗(yàn)兔與糞便的接觸。期間提供煮沸的飲水和80 ℃烘烤后的兔飼料,并輪換使用抗球蟲藥物地克珠利和癸氧喹酯,攻蟲前1周實(shí)驗(yàn)兔停藥并進(jìn)行檢測(cè),后續(xù)使用專門定制的未添加抗球蟲藥物的兔飼料進(jìn)行飼喂。

1.2.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶(BamH I/EcoR I)、pMD19-T載體、T4 DNA Ligase購自寶生物工程(大連)有限公司;大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)購自天根生化科技(北京)有限公司;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;pET32a(+)質(zhì)粒由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供;Rabbit IFN-γ ELISA development kit (HRP)試劑盒,購自瑞典Mabtech 公司;Rabbit IL-2、IL-4、IL-10、IL-17 ELISA Kit試劑盒,Rabbit Transforming Growth factor β1(TGF-β)ELISA Kit試劑盒,購自武漢CUSABIO BIOTECH公司。

PCR儀:Mastercycler Gradient,eppendorf,美國;中高壓層析系統(tǒng):NGCTM10,Bio-Rad,美國;半干轉(zhuǎn)印槽:SEMIDRYBLOT,Bio-Rad,美國;McMaster計(jì)數(shù)板,富士平工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1Em-GAPDH基因的克隆測(cè)序與生物信息學(xué)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出的Em-GAPDH基因,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物:(上游5′-CGGGATCCATGCTCTACGCTGACGTGTAC-3′,BamHI;下游5′-CGGAATTC-TTAGTTGCCGTCTTTCTGAGACA-3′,EcoRI)?？寺y(cè)序后利用生物信息學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析,使用ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI),使用SignalP5.0 Server和TMHMM Server v. 2.0.預(yù)測(cè)該基因信號(hào)肽和跨膜區(qū)的存在。

1.3.2Em-GAPDH的表達(dá)與純化 取不同發(fā)育階段蟲體cDNA混合液為模板,對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的條帶與pMD19-T載體連接,以測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒為模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物和pET32a(+)質(zhì)粒一起雙酶切、T4連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)中,培養(yǎng)陽性菌至菌液OD590 nm至0.6后,加入1.0 mmol·L-1IPTG,37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h(110 r·min-1);菌液7 000 r·min-1離心10 min,在菌體沉淀中加入裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH=8.0)重懸菌體,反復(fù)凍融3次后超聲破碎。取上清和尿素溶解的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE判斷原核表達(dá)重組蛋白的可溶性。用鎳離子親和層析的方法純化重組蛋白,并將純化后的重組蛋白用PBS進(jìn)行透析,SDS-PAGE分析純化效果。

1.3.3 rEm-GAPDH的蛋白免疫印跡分析 人工感染大型艾美耳球蟲陽性兔血清與球蟲陰性兔血清由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供。所有血清樣品均儲(chǔ)存于-20 ℃。

樣品(40 μL蛋白質(zhì)和10 μL負(fù)載緩沖液)煮沸10 min,12%十二烷基硫酸鈉-PAGE分離,在室溫下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜35 min。膜在Tris-Buffed生理鹽水-吐溫-(TBST)(20 mmol·L-1Tris-HCl,150 mmol·L-1氯化鈉,0.05%v/v吐溫-20,pH 7.4)中清洗3次,每次5 min,包被5%脫脂牛奶2 h,然后與陽性血清孵育過夜(用0.01 mol·L-1PBS稀釋1∶200)。再用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶1 000稀釋)孵育2 h,再清洗4次,用二氨基聯(lián)苯胺試劑檢測(cè)信號(hào)。

1.3.4 rEm-GAPDH的穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇純化后的重組蛋白rEm-GAPDH,分別保存于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃,每周固定時(shí)間分別制樣,持續(xù)7周。SDS-PAGE分析對(duì)比7周的蛋白濃度變化。

1.3.5 大型艾美耳球蟲rEm-GAPDH對(duì)兔的免疫保護(hù)效果觀察

1.3.5.1 分組和免疫程序:本試驗(yàn)中,50只45日齡的無球蟲感染幼兔分組情況如表1。免疫方式為頸部皮下注射,免疫接種2次,兩次免疫時(shí)間間隔14 d。加強(qiáng)免疫后14 d,除空白對(duì)照組外,其余實(shí)驗(yàn)兔均口服感染1×105個(gè)孢子化卵囊。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和免疫程序

1.3.5.2 免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià):觀察首免、二免及攻蟲后各組實(shí)驗(yàn)兔的精神狀態(tài)、食欲及糞便形狀等臨床表現(xiàn)。

在首免前、二免前及宰殺前對(duì)實(shí)驗(yàn)兔逐只稱重,免疫后攻蟲前平均增重=攻蟲前體重-首免前體重;攻蟲后平均增重=剖殺前體重-攻蟲前體重;相對(duì)增重率=(實(shí)驗(yàn)各組平均增重/不感染不免疫平均增重)×100%;料肉比=(飼喂前飼料總量-剖殺后剩余飼料總量)/感染后增重總量;試驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集實(shí)驗(yàn)兔腸道進(jìn)行病變計(jì)分,ACI=(相對(duì)增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)。效果判定標(biāo)準(zhǔn)如下:ACI≥180 保護(hù)效果優(yōu)秀,160≤ACI<179保護(hù)效果良好,120≤ACI<160保護(hù)效果中等,ACI<120無保護(hù)效果[25-27]。

參考動(dòng)物球蟲病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18647—2020),剖檢時(shí),從每只實(shí)驗(yàn)兔直腸中收集2 g糞便,使用麥克馬斯特法計(jì)算每克糞便中的卵囊排出量(oocyst per gram, OPG),并計(jì)算卵囊減少率。卵囊減少率=[(不免疫攻蟲組OPG-免疫組OPG)/不免疫攻蟲組OPG]×100%。

1.3.6 細(xì)胞因子及抗體水平的檢測(cè) 從首免前開始,到攻蟲后直至剖殺,每周定時(shí)采集實(shí)驗(yàn)兔血清。對(duì)攻蟲前血清中不同細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β、IFN-γ)水平進(jìn)行測(cè)定,具體操作方法參照試劑盒說明書。使用基于重組蛋白rEm-GAPDH的間接ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔每周的血清中特異性IgG抗體水平(蛋白稀釋比1∶100,二抗稀釋比1∶3 000)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 使用GraphPad軟件(GraphPad Prism版本5.0)制作生成所有圖形。使用SPSS Statistics 20.0確定組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對(duì)每個(gè)因變量(平均增重、卵囊排出量)的重復(fù)測(cè)量進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Em-GAPDH基因克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)

以大型艾美耳球蟲cDNA為模板擴(kuò)增出Em-GAPDH基因,經(jīng)克隆測(cè)序分析,擴(kuò)增片段與大型艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列相似性達(dá)100%(GenBank:OQ128328)。Em-GAPDH序列長(zhǎng)度為1 149 bp(圖1a),編碼382個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為41.19 ku,計(jì)算等電點(diǎn)(PI)為7.01。

泳道: M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。a. Em-GAPDH的擴(kuò)增:1:基因Em-GAPDH擴(kuò)增結(jié)果。b. 雙酶切鑒定:1～4. Em-GAPDH的雙酶切;5～7. pET32a(+)載體質(zhì)粒的雙酶切。c. 成功構(gòu)建表達(dá)載體:1～5. Em-GAPDH表達(dá)載體菌液PCRLane: M. DNA marker; a. Amplification of Em-GAPDH: 1. Em-GAPDH; b. Double-restriction digestion identification: 1-4. Em-GAPDH; 5-7. pET32a(+) vector; c. Successful construction of expression vector; 1-5. Identification by bacterial liquid PCR圖1 基因Em-GAPDH的克隆(a)、雙酶切鑒定(b)與菌液PCR鑒定(c)Fig.1 Cloning, enzymatic cleavage and PCR identification of the gene Em-GAPDH

以測(cè)序成功的菌液擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,將基因克隆菌的質(zhì)粒與pET32a(+)質(zhì)粒一起在37 ℃條件下進(jìn)行雙酶切30 min。酶切反應(yīng)完成后,其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1b),并成功與pET-32a(+)載體連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板及單菌落鑒定,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-Em-GAPDH(圖1c)。

2.2 rEm-GAPDH的蛋白純化和免疫印跡分析

重組蛋白rEm-GAPDH在誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1,37 ℃ 130 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)12 h的條件下表達(dá)量最高,大小在59 ku左右,且大部分表達(dá)在包涵體。重組蛋白經(jīng)鎳離子親和層析后的純化效果良好,無明顯雜條帶(圖2)。同時(shí),rEm-GAPDH能識(shí)別兔大型艾美耳球蟲陽性血清(圖3),具有良好的免疫反應(yīng)性。

泳道:M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(ku);1. 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解物上清;2～5. 菌體裂解物先后溶解于2、4、6、8 mol·L-1尿素;6. 誘導(dǎo)表達(dá)后未經(jīng)純化的rEm-GAPDH;7. 經(jīng)純化的rEm-GAPDHLanes: M. protein molecular weight markers (in ku);1. soluble protein;2-5.inclusion body in 2,4,6,8 mol·L-1 urea;6. non-purified rEm-GAPDH; 7. purified rEm-GAPDH圖2 重組蛋白rEm-GAPDH的可溶性分析及純化后效果Fig.2 SDS-PAGE of solubility analysis of recombinant protein rEm-GAPDH

泳道:M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(ku);1.經(jīng)純化的rEm-GAPDH與人工感染大型艾美耳球蟲兔血清識(shí)別反應(yīng);2.經(jīng)純化的rEm-GAPDH與無球蟲感染健康兔血清識(shí)別反應(yīng)Lanes: M.protein molecular weight markers (in ku); 1.purified rEm-GAPDH detected by serum from naturally infested with Eimeria magna; 2.purified rEm-GAPDH detected by healthy rabbit′s serum圖3 純化后重組蛋白rEm-GAPDH的蛋白免疫印跡分析Fig.3 Western blotting of purified recombinant protein

2.3 重組蛋白rEm-GAPDH穩(wěn)定性試驗(yàn)

純化后重組蛋白各加5%的甘油,混勻后分別保存于-80 ℃、-20 ℃、4℃三種溫度下,持續(xù)觀察7周。由SDS-PAGE結(jié)果可知,重組蛋白在7周內(nèi)濃度恒定,沒有出現(xiàn)明顯的降低情況(圖4)。所以重組蛋白rEm-GAPDH的穩(wěn)定性良好。

泳道:M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(ku);1～7,保存于-80℃下純化后蛋白0～7周的制樣;8～14,保存于-20℃下純化后蛋白0～7周的制樣;15～21,保存于4℃下純化后蛋白0～7周的制樣Lanes: M.protein molecular weight markers (in ku); 1-7. stored at -80℃ for 0-7 weeks of purified protein preparation; 8-14. stored at -20℃ for 0-7 weeks of purified protein preparation; 15-21. stored at 4℃ for 0-7 weeks of purified protein preparation圖4 純化后重組蛋白rEm-GAPDH在不同溫度下0～7周制樣的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-Page of purified recombinant protein rEm-GAPDH samples prepared at different temperatures for 0-7 weeks

2.4 rEm-GAPDH對(duì)家兔的免疫保護(hù)效果

2.4.1 臨床表現(xiàn)及剖檢病變 在攻蟲前各組實(shí)驗(yàn)兔體況表現(xiàn)正常,在經(jīng)口感染1×105個(gè)孢子化卵囊后,第1周未有明顯癥狀,感染后第2周不免疫攻蟲組出現(xiàn)大型艾美耳腸球蟲病的典型癥狀:食欲輕微減退,精神沉郁,糞便變軟不成形;而rEm-GAPDH免疫組癥狀不明顯。

剖檢觀察腸道病變發(fā)現(xiàn),rEm-GAPDH免疫組整體病變程度相較三個(gè)攻蟲對(duì)照組更輕,病變計(jì)分(1.30±0.95)低于不免疫攻蟲組(1.70±0.67)、Trx-His-S tag攻蟲對(duì)照組(1.60±0.97)和Quil-A saponin攻蟲對(duì)照組(1.60±0.70),但不存在顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 相對(duì)增重 初次免疫、二次免疫和攻蟲時(shí)各組體重?zé)o明顯差異。感染14 d后空白對(duì)照組平均增重(423.75±39.72 g),與不免疫攻蟲組(平均增重183.33±168.39 g)、Trx-His-S tag攻蟲對(duì)照組(平均增重205.50±72.62 g)和Quil-A saponin攻蟲對(duì)照組(平均增重191.81±76.98 g)的三個(gè)組間呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。rEm-GAPDH免疫組平均增重288.00±41.24 g,與其他對(duì)照組之間也存在明顯差異(P<0.05)。其中,不免疫攻蟲組的相對(duì)增重率僅為空白對(duì)照的43.26%,感染后第二周甚至有個(gè)別試驗(yàn)兔體重出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng);而rEm-GAPDH免疫組的相對(duì)增重率為67.96%(表2)。

表2 rEm-GAPDH對(duì)兔感染大型艾美耳球蟲的保護(hù)效果統(tǒng)計(jì)

2.4.3 卵囊排出量 感染后14 d結(jié)束試驗(yàn)并檢測(cè)每只實(shí)驗(yàn)兔的卵囊排出量,空白對(duì)照組的糞便樣本中未檢查到大型艾美耳球蟲卵囊;不免疫攻蟲組平均OPG達(dá)3.15×104,Trx-His-S tag攻蟲對(duì)照組平均OPG達(dá)3.09×104,Quil-A saponin攻蟲對(duì)照組平均OPG達(dá)3.11×104,均不存在顯著差異(P>0.05)。而rEm-GAPDH免疫組的平均OPG為1.34×104,與不免疫攻蟲組相比顯著減少(P<0.05),免疫組的卵囊減少率達(dá)57.16%(表2)。綜合上述指標(biāo),得到rEm-GAPDH免疫組的ACI值為144.96,具有中等保護(hù)效果。

2.4.4 血清中特異性IgG抗體水平的變化 免疫接種后,rEm-GAPDH免疫組實(shí)驗(yàn)兔的血清平均特異性IgG抗體水平升高,其平均水平極顯著的高于各個(gè)對(duì)照組的抗體水平(P<0.01);rEm-GAPDH免疫組的血清平均特異性IgG抗體水平在加強(qiáng)免疫后1周達(dá)到最高水平,但后續(xù)抗體水平未維持在較高水平,在第7周出現(xiàn)較明顯的下降(圖5)。

Immunization:第一次和第二次免疫蛋白;challenge:大型艾美耳球蟲攻蟲Immunization: first and second immunization with vaccine; challenge: challenge with Eimeria magna圖5 實(shí)驗(yàn)兔血清中特異性IgG抗體水平的變化情況Fig.5 Variation of specific IgG antibody levels in sera of immunized rabbits

2.4.5 細(xì)胞因子 免疫組除IL-17水平無明顯變化外,其他細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ)水平均顯著高于不免疫攻蟲組及Quil-A saponin攻蟲對(duì)照組(圖6)。

3 討 論

兔球蟲基因工程苗的研究主要集中在核酸疫苗[28]、活載體疫苗[29-30]和重組亞單位疫苗[31-32]上,而這些研究的關(guān)鍵在于篩選具有良好免疫保護(hù)作用的候選抗原。目前已有研究表明,大型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗能為家兔提供良好的抗感染保護(hù)效果[33-35]。

GAPDH除了在糖酵解反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用外,還具有其他多種生物學(xué)功能[36-37]。比如與基質(zhì)蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng),在病原毒力和表面定位中發(fā)揮作用等[38-40]。GAPDH在雞的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)子孢子入侵雞腸上皮細(xì)胞的過程中起到正向調(diào)控作用[41]。同時(shí),包括惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)在內(nèi)的幾種致病原蟲不存在三羧酸循環(huán),只依賴糖酵解產(chǎn)生能量,其代謝過程所需的ATP完全來自糖酵解反應(yīng),并且進(jìn)一步通過試驗(yàn)證明了瘧原蟲子孢子GAPDH與宿主肝細(xì)胞相識(shí)別,作用于抑制子孢子穿越和感染肝[42-43]。研究表明,GAPDH可以作為預(yù)防細(xì)菌和寄生蟲病的疫苗候選抗原[38]。本研究中動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)表明,重組蛋白rEm-GAPDH免疫實(shí)驗(yàn)兔能夠有效抵抗大型艾美耳球蟲的感染,產(chǎn)生中等保護(hù)效果,卵囊減少率達(dá)57.16%,為兔的大型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的研制提供了候選抗原。

細(xì)胞免疫在預(yù)防艾美耳球蟲感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[44]。雞體內(nèi)的IFN-γ可以通過抑制雞球蟲子孢子的生長(zhǎng)發(fā)育、參與抗原呈遞等過程增強(qiáng)宿主的抗球蟲感染能力[45]。IL-2可以抑制雞球蟲子孢子和裂殖子的活化增殖[46-47]。如果抑制雞體內(nèi)的IL-2產(chǎn)生,其抵抗球蟲的能力會(huì)下降,因此將IL-2與候選抗原進(jìn)行融合表達(dá)可以增強(qiáng)疫苗效果,其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)特異性更佳,持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),抗球蟲的效果也更好[48]。IL-4、IL-10是介導(dǎo)Th2型反應(yīng)的細(xì)胞因子,在弓形蟲感染中,它們能夠降低炎癥反應(yīng),減少宿主的病理變化[49]。TGF-β是一種抗炎性的細(xì)胞因子,參與修復(fù)受損傷的黏膜上皮細(xì)胞,降低宿主的炎性反應(yīng)[50]。本研究中檢測(cè)了rEm-GAPDH免疫組細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、 TGF-β、IFN-γ),除IL-17的濃度水平與對(duì)照組無顯著差異外,免疫組其余細(xì)胞因子水平都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明免疫組的重組蛋白能引發(fā)細(xì)胞因子水平的變化,其中IFN-γ、IL-2水平的上調(diào),可能在抗大型艾美耳球蟲感染的過程中起到了一定作用。

本試驗(yàn)檢測(cè)到免疫組的特異性IgG抗體水平較對(duì)照組顯著上升。重組蛋白rEm-GAPDH誘發(fā)產(chǎn)生的特異性IgG抗體可能引起宿主的免疫保護(hù)作用。在雞球蟲重組亞單位疫苗研究中,GAPDH已經(jīng)被證明是雞的堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)和巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)的共同抗原[24]。在雞的柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲分別感染及三種球蟲混合感染的情況下呈現(xiàn)出較好的保護(hù)效果(ACI>160),其中卵囊減少率最高可達(dá)79%[51]。而本研究結(jié)果顯示rEm-GAPDH引發(fā)了宿主(兔)體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,免疫組的卵囊減少率達(dá)57.16%,具有一定免疫保護(hù)作用。Em-GAPDH能否成為對(duì)多種兔球蟲產(chǎn)生共同保護(hù)效果的疫苗抗原,未來還需深入研究。

4 結(jié) 論

對(duì)大型艾美耳球蟲GAPDH基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)獲得了重組蛋白,免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,rEm-GAPDH免疫兔后能顯著減少增重?fù)p失和卵囊排出,可以引發(fā)宿主體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。試驗(yàn)結(jié)果表明rEm-GAPDH可以作為大型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的候選抗原。