PIWI相互作用RNA：結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物

聞 杰，李雪婷，李百祥

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的數(shù)據(jù)［1］：在2020 年，結(jié)直腸癌成為全球癌癥死亡的第二大原因。其中，結(jié)直腸癌在我國(guó)癌癥死亡原因中位居第5位，新增28萬(wàn)人死亡，每年新發(fā)病例達(dá)55萬(wàn)人，且結(jié)直腸癌發(fā)病年輕化趨勢(shì)明顯。因早期通常無(wú)癥狀且缺乏有效的檢測(cè)手段，60%～70%的結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已是晚期。結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)是決定其預(yù)后的最重要因素。因此，探索結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，識(shí)別新的標(biāo)志物是結(jié)直腸癌早期診斷早期治療的關(guān)鍵。最近研究表明，piRNA在血清/血漿與腫瘤組織中表達(dá)穩(wěn)定且易于檢測(cè)［2］，異常表達(dá)的PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，并在惡性腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良中發(fā)揮重要作用。此外，在人類基因組中已經(jīng)鑒定出超過(guò)2 萬(wàn)個(gè)piRNA，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于miRNA（2 000 個(gè)左右）的數(shù)量［3］。這表明piRNA可能是潛在的、有效的癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。文章重點(diǎn)闡述了piRNA 的生物學(xué)功能和在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的新進(jìn)展，以及piRNA 在結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后中的新思路。

1 piRNA的概述

1.1 piRNA的特征與生物發(fā)生

人類基因組中估計(jì)含有約2 萬(wàn)個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，約占基因組序列的2%。僅轉(zhuǎn)錄成RNA（約3 000 個(gè)）不編碼蛋白質(zhì)的基因被稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［4］。這些ncRNA 主要包括小干擾RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、piRNA等（表1）。piRNA是一種長(zhǎng)度約為26～30個(gè)核苷酸，能與來(lái)自Argonaut蛋白亞家族的PIWI蛋白結(jié)合，參與轉(zhuǎn)座因子沉默與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小RNA［5］。最近，開(kāi)發(fā)了許多生物信息學(xué)方法用于piRNA 鑒定，分析它們的功能，以及尋找同源piRNA 和piRNA 簇（表2）。piRNA 與其他小分子ncRNA 如siRNA 或miRNA相比，長(zhǎng)度更長(zhǎng)。其次，piRNA由少量長(zhǎng)單鏈RNA 前體生成，這些前體通過(guò)RNaseⅢ型酶獨(dú)立機(jī)制從不同的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄而來(lái)，稱為“piRNA 簇”［6］。最后，piRNA 在3′-端有2′-O-甲基修飾，在5′端有一個(gè)單磷酸基團(tuán)，這表明其在不同物種中功能高度保守，具有抗氧化降解的能力，可作為一組有前景的腫瘤標(biāo)志物［7］。piRNA的生物發(fā)生包括兩種主要途徑：一次擴(kuò)增和二次擴(kuò)增（也稱為乒乓循環(huán)）［8］。這兩種途徑是對(duì)抗轉(zhuǎn)座子強(qiáng)大防御功能的關(guān)鍵。在一次擴(kuò)增途徑中，長(zhǎng)piRNA 前體從piRNA 簇中轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞質(zhì)中被復(fù)雜因子切割和修飾，然后與PIWI蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，產(chǎn)生的piRNA可能在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮作用［9］。次要piRNA在乒乓循環(huán)中形成，以特異性增強(qiáng)piRNA序列［10］。

表1 小的ncRNA的分類Table 1 Classification of small non-coding RNA

表2 piRNA數(shù)據(jù)庫(kù)及其描述Table 2 piRNA database and its description

1.2 piRNA的生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)制

以往研究表明，piRNA/PIWI 通路通過(guò)DNA 甲基化參與轉(zhuǎn)錄基因沉默。DNA 甲基化是DNA 化學(xué)修飾的一種類型，是在不改變DNA堿基序列的情況下，由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控［11］，它在長(zhǎng)期基因沉默中起著重要作用，特別是在啟動(dòng)子區(qū)域［12］。DNA高甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)，DNA低甲基化則會(huì)激活基因的表達(dá)。DNA甲基化異?？赡苤苯踊蜷g接導(dǎo)致腫瘤抑制因子失活［13］，piRNA 可以通過(guò)調(diào)節(jié)DNA 甲基化參與疾病進(jìn)展［14］。piRNA 與DNA甲基化之間的相互作用對(duì)基因組穩(wěn)定性和基因表達(dá)具有深遠(yuǎn)影響，可能導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的畸變，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生［15］。已有研究證明，piRNA 在水螅和人類等生物中抑制轉(zhuǎn)座子動(dòng)員［5］。轉(zhuǎn)座子，被稱為跳躍基因，它們通過(guò)將自身插入基因組的方式進(jìn)行重排，轉(zhuǎn)座子的不當(dāng)插入可能會(huì)破壞基因組的穩(wěn)定性和完整性，引起染色體易位、反轉(zhuǎn)、復(fù)制和缺失，過(guò)度激活的轉(zhuǎn)座子有很高的致病性［16］。piRNA簇含有很多轉(zhuǎn)座子，piRNA可以和PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA/PIWI 復(fù)合物（piRISC）。piRISC 通常被認(rèn)為是“細(xì)胞的免疫系統(tǒng)”，因?yàn)樗谡麄€(gè)基因組中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子的表達(dá)水平［17］，參與轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默。piRISC功能喪失或表達(dá)減少可通過(guò)轉(zhuǎn)座子的不受限制作用誘導(dǎo)更大的基因組損傷，同時(shí)導(dǎo)致疾病相關(guān)基因的異常表達(dá)［18］。piRNA可以抑制轉(zhuǎn)座子動(dòng)員，通過(guò)表觀遺傳機(jī)制實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄沉默，并通過(guò)形成piRISC參與轉(zhuǎn)錄后抑制，從而調(diào)控癌癥進(jìn)展［7］。

piRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控是通過(guò)多種方式進(jìn)行的，如表觀遺傳機(jī)制和piRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)的基因調(diào)控。其中，piRNA通過(guò)與RNA或RNA核酸內(nèi)切裂解的相互作用，以及對(duì)mRNA 穩(wěn)定性或選擇性剪接。同樣重要的是，在生理和病理環(huán)境下，干擾RNA/piRNA 樣（iRNA/piRNA-L）可能通過(guò)與蛋白質(zhì)編碼基因的直接聯(lián)系參與基因表達(dá)的翻譯或翻譯后調(diào)控［19］。此外，piRNA和PIWI蛋白在生殖干細(xì)胞中高度富集，參與生殖細(xì)胞發(fā)育、干細(xì)胞維持、減數(shù)分裂等。癌癥干細(xì)胞處于異常的“干細(xì)胞”狀態(tài)，參與癌癥的發(fā)生，并與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。癌癥干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄信號(hào)、表觀遺傳狀態(tài)和信號(hào)通路與干細(xì)胞中相類似。一些關(guān)鍵的信號(hào)通路，包括Wnt/β-catenin和Hedgehog通路，在癌癥干細(xì)胞中可能被異常調(diào)節(jié)［20］。因此，piRNA 可能是癌癥預(yù)后和診斷的潛在生物標(biāo)志物。

2 piRNA與腫瘤

許多研究表明，piRNA參與了多種癌癥的發(fā)生，并在癌組織和非癌組織中差異表達(dá)，包括胃癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等［21］。然而，piRNA 在不同類型癌癥中的作用可能是復(fù)雜的（抑癌或促癌）。piR-823是最重要的piRNA之一，其在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等［21］幾種癌癥中顯著上調(diào)并促進(jìn)癌癥進(jìn)展。然而，piR-823在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，piR-823高表達(dá)模型中胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，這表明piR-823抑制胃癌的發(fā)展［22］。同時(shí)，它被發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌組織中下調(diào)，但矛盾的是它與較差的預(yù)后呈正相關(guān)，這表明piR-823 在腎細(xì)胞癌中發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性［23］。除此之外，piR-651 也是研究較多的piRNA 之一。它在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤［24］、胃癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等幾種癌癥中都顯著上調(diào)［21］。與piR-823不同的是，piR-651在胃癌的發(fā)展中具有促進(jìn)作用。piR-651 抑制劑（拮抗劑）可以抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期［25］。值得注意的是，雖然piR-651在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤患者樣本中過(guò)表達(dá)，但低水平的piR-651與患者預(yù)后差有關(guān)。綜上，piRNA在不同類型癌癥中的作用可能具有特異性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，piRNA可能通過(guò)PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK 這兩條通路參與癌癥的進(jìn)展［26］。piRNA 的異常表達(dá)很可能導(dǎo)致癌細(xì)胞機(jī)制失衡，從而引起細(xì)胞凋亡減少、增殖增加以及侵襲和轉(zhuǎn)移增加，導(dǎo)致癌癥發(fā)展。因此，探索癌癥發(fā)生中相關(guān)的piRNA 及其分子機(jī)制，可以為癌癥診斷與預(yù)后研究提供新的手段。

3 piRNA 作為結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后生物標(biāo)志物的價(jià)值

目前，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)了一些異常表達(dá)的piRNA，如piR-823、piR-1245和piR-54265等（圖1）。這些異常表達(dá)的piRNA 與結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究表明在診斷結(jié)直腸癌方面，piRNA 比常用的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物，如CEA和CA19-9更敏感［27-28］，且在反復(fù)凍融或長(zhǎng)期室溫環(huán)境下，有些piRNA 在血清和血漿樣本中表現(xiàn)出高穩(wěn)定性［2］。此外，piR-017724和piR-1245等少數(shù)piRNA表達(dá)異常與結(jié)直腸癌晚期和整體臨床表現(xiàn)不佳相關(guān)［2，29］。因此，piRNA有成為結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，甚至成為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。

圖1 結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的piRNAFigure 1 Abnormal expression of piRNA in colorectal cancer

3.1 piRNA作為結(jié)直腸癌診斷生物標(biāo)志物的價(jià)值

3.1.1 piR-020619和piR-020450

結(jié)直腸癌患者血清中piR-020619和piR-020450的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組［28］，piRNA 的激活可能參與了結(jié)直腸癌發(fā)病。聯(lián)合使用這兩種piRNA的診斷性能較好。靈敏度高于常用的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物（CEA 和CA19-9）。最后，在胃癌、肺癌和乳腺癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)piR-020619和piR-020450的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相似，證明這兩種piRNA對(duì)結(jié)直腸癌診斷具有一定特異性［28］。

3.1.2 piR-823

在血漿和癌細(xì)胞系中已經(jīng)鑒定出piR-823，其被認(rèn)為是調(diào)節(jié)惡性腫瘤相關(guān)的piRNA 之一［30］。高表達(dá)的血清piR-823 與結(jié)直腸癌晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化較差有關(guān)［30］。piR-823在結(jié)直腸癌發(fā)展中有多種機(jī)制。第一種機(jī)制是piRNA/PIWI 復(fù)合物2 磷酸化STAT3，通過(guò)STAT3/BCLx1/cyclinD1信號(hào)通路，可能使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKI）表達(dá)，從而控制G1 期的進(jìn)展。另一種是通過(guò)“翻譯后機(jī)制”，使熱休克蛋白表達(dá)增加，從而抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖，發(fā)揮促瘤作用［30］。piR-823的診斷性能較好［30］，受試者工作特征曲線（ROC 曲線）顯示，piR-823診斷結(jié)直腸癌的特異度為89.3%，靈敏度為83.3%，曲線下面積為0.933（P＜0.001），結(jié)直腸癌患者血清中piR-823的表達(dá)與癌變組織表達(dá)呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.929，P＜0.001）。這些研究支持piR-823作為結(jié)直腸癌診斷的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物。

3.1.3 piR-54265

piR-54265 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與患者耐藥和預(yù)后不良有關(guān)，是結(jié)直腸癌的致癌piRNA［31］。功 能研究表明，piR-54265 可以結(jié)合PIWIL2 蛋白，并通過(guò)激活STAT3 信號(hào)通路起作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［31］。此外，血清piR-54265比臨床常用的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物CEA、CA19-9 和CA125 對(duì)結(jié)直腸癌的檢測(cè)更敏感，該piRNA穩(wěn)定存在于患者血清中［27］。與對(duì)照組和其他類型癌癥患者相比，發(fā)現(xiàn)只有結(jié)直腸癌患者血清piR-54265 的水平升高［27］，表明血清piR-54265 在結(jié)直腸癌診斷中具有一定特異性。這些發(fā)現(xiàn)支持血清piR-54265作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

3.1.4 piR-24000

與鄰近正常組織相比，piR-24000 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯升高，為結(jié)直腸癌中的致癌基因［32］。piR-24000 過(guò)表達(dá)與侵襲性結(jié)直腸癌表型有很大相關(guān)性。piR-24000診斷的ROC曲線下面積為0.818（95%CI 為0.752～0.883，靈敏度為93.1%，特異度為68.97%，P＜0.001）［32］。數(shù)據(jù)顯示，piR-24000可以作為結(jié)直腸癌潛在的診斷標(biāo)志物。但是，這種piRNA 的特異性相對(duì)較低，與其他相關(guān)的生物標(biāo)志物聯(lián)合使用為宜。

3.1.5 piR-5937和piR-28876

piR-5937 和piR-28876 在結(jié)腸癌患者的血清樣本中顯著下調(diào)，與目前使用的生物標(biāo)志物CEA 和CA19-9相比，它們?cè)跈z測(cè)結(jié)腸癌方面具有更高的靈敏度［33］。此外，術(shù)后1 個(gè)月患者血清樣本中兩種piRNA 的表達(dá)水平均顯著升高。提示piR-5937 和piR-28876 可作為早期結(jié)腸癌檢測(cè)的非侵入性生物標(biāo)志物，也可以作為手術(shù)治療后監(jiān)測(cè)患者的潛在手段。

3.1.6 piR-18

piR-18 在結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于鄰近組織和正常腸黏膜上皮細(xì)胞，這表明，piR-18 可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑制作用［34］。實(shí)驗(yàn)證明，piR-18 過(guò)表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480、LOVO）的增殖、侵襲以及遷移。上調(diào)piR-18表達(dá)是結(jié)直腸癌治療的新思路，piR-18 有望成為新的診斷和治療結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物。

3.2 piRNA作為結(jié)直腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物的價(jià)值

3.2.1 piR-823

過(guò)表達(dá)的piR-823與結(jié)直腸癌患者較差的總生存率有關(guān)，抑制piR-823 可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖［35］。機(jī)制研究表明，piR-823 通過(guò)G6PD/HIF-α通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，為有前景的結(jié)直腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物。

3.2.2 piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365

研究發(fā)現(xiàn)，診斷結(jié)直腸癌的5個(gè)piRNA組合（包括piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365）在腫瘤患者中差異表達(dá)［2］。此外，組合piRNA 的診斷潛力優(yōu)于CEA 和CA19-9，血清piRNA的穩(wěn)定性較好。低水平血清piR-017724與患者生存期較差有關(guān)，可能是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素，有作為結(jié)直腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力［2］。

3.2.3 piR-18849、piR-19521和piR-17724

與鄰近非腫瘤組織相比，結(jié)直腸癌組織中piR-18849、piR-19521 和piR-17724 的表達(dá)水平升高［36］。高表達(dá)piR-18849 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，piR-18849 和piR-19521 的表達(dá)上調(diào)與腫瘤分化程度較差有關(guān)［36］，提示這兩種piRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)生中起調(diào)控作用，piR-18849 和piR-19521 可能成為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.2.4 piR-1245

在結(jié)直腸癌中，piR-1245的表達(dá)上調(diào)，起促癌作用［29］。piR-1245的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖率呈正相關(guān)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，抑制piR-1245可以激活p53 通路，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡。piR-1245 影響癌癥相關(guān)基因，通過(guò)抑制幾種腫瘤抑制基因的RNA水平發(fā)揮致癌作用，包括B-細(xì)胞易位基因1（BTG1）、人尿苷磷酸化酶1（UPP1）、激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）等在內(nèi)的9個(gè)功能相關(guān)的癌癥基因［29］。結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良與piR-1245 表達(dá)上調(diào)有關(guān)，piR-1245 高表達(dá)患者的總生存期較短。由此表明，piR-1245 是結(jié)直腸癌患者可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，piRNA 在結(jié)直腸癌組織與血清中異常表達(dá)，提示piRNA 可能調(diào)控了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。此外，piRNA 診斷性能優(yōu)于常用生物標(biāo)志物，piRNA 高表達(dá)患者的總生存期較短。由此我們認(rèn)為piRNA 為結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后提供了新的可能。但總的來(lái)說(shuō)，目前對(duì)這些piRNA 在結(jié)直腸癌中的研究仍處于起步階段，在臨床實(shí)踐中，建立新的基于piRNA 的預(yù)后或診斷程序仍存在大量障礙。未來(lái)對(duì)piRNA 在結(jié)直腸癌中的研究，需要關(guān)注以下幾方面：①深入對(duì)piRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)病調(diào)控機(jī)制的研究；②確定結(jié)直腸癌中piRNA 的整體表達(dá)譜；③增加實(shí)驗(yàn)所用結(jié)直腸癌臨床監(jiān)測(cè)樣本量；④盡可能增加結(jié)直腸癌樣本深度測(cè)序的數(shù)量。相信隨著多組學(xué)、測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)步，piRNA作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的價(jià)值會(huì)得到全面和更深入的評(píng)估。