丁酰膽堿酯酶在胃癌中的預(yù)后價值及其生物學(xué)功能分析

何繼凱，瞿文豪，賈佳琦，楊小兵，王 彬，賈立周，黃衍強，趙 薇*

1右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000；2巴彥淖爾市醫(yī)院中心實驗室，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210006

GC（gastric cancer，GC）是全球第5大癌癥，死亡率居全球第4位［1-2］。目前，GC的治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療，但術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率超過40%［3］。此外，放療和化療后會出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，導(dǎo)致晚期GC患者的5年生存率僅約20%［4-5］。因此，尋找GC新的治療和預(yù)后靶點以提高患者的生存率，已成為一項迫切的公共衛(wèi)生問題。

為篩選出與GC 預(yù)后相關(guān)的基因，本研究采用多種分析方法發(fā)現(xiàn)，在GC中丁酰膽堿酯酶（bcylcholinesterase，BCHE）具有良好的預(yù)后價值。BCHE 是一種由肝臟合成并分泌到血液中的血漿酶，主要表達于外泌體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［6］，其半衰期約為12 d，參考值為5 900～13 200 U/L［7-8］。研究表明，口腔癌和乳腺癌患者血清中BCHE 的表達水平明顯升高［9-10］。然而，BCHE 基因在GC中的表達水平、調(diào)控機制，以及與臨床治療和預(yù)后的相關(guān)性仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究的GC 患者臨床病理信息和基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都來源于UCSC Xena數(shù)據(jù)庫的腫瘤基因組圖譜（TCGA）［11］。

人GC細(xì)胞系HGC27、MKN1和人正常胃上皮細(xì)胞系GES-1（武漢普諾賽生命科技有限公司）。qRTPCR 試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipo6000、CCK-8試劑（上海碧云天生物公司）；基質(zhì)凝膠（廈門模基生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生信數(shù)據(jù)處理

首先使用Lasso 回歸篩選預(yù)后基因［12］，并采用Kaplan-Meier生存曲線和單因素、多因素Cox回歸分析BCHE基因表達在GC中的預(yù)后價值；其次采用卡方檢驗驗證BCHE mRNA與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，使用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］和CIBERSORT 算法研究BCHE 和免疫細(xì)胞浸潤之間相關(guān)性，此外，利用WGCNA 算法和DAVID Bioinformatics Resources數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）［14］對BCHE基因進行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析。

1.2.2 qRT-PCR

使用細(xì)胞RNA 提取試劑盒提取人GC 細(xì)胞HGC27、MKN1和人正常胃上皮細(xì)胞GES-1的RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參對BCHE進行qRT-PCR擴增。BCHE R：5′-TGTTGCAGAGAATCGGAAATCAA-3′，F(xiàn)：5′-CCCAATAAGCATGCAGAGCA-3′。GAPDH R：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，F(xiàn)：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用siRNA靶向敲減BCHE基因。將細(xì)胞分為對照組、空載組（si-NC）和實驗組（si-BCHE），收集處理后的HGC27和MKN1細(xì)胞，并配制成2×105個/mL的細(xì)胞懸液，鋪入6 孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，每孔滴加7.5 μL Lipo6000和7.5 μL siRNA，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行下一步實驗。

1.2.4 CCK-8和克隆形成實驗

CCK-8 實驗：收集處理后的HGC27 和MKN1細(xì)胞，并配制成2×104個/mL 的細(xì)胞懸液，鋪入96 孔板中，每孔100 μL，分別在24、48、72、96 h 后加入10 μL CCK-8試劑，在37 益下孵育2 h后檢測450 nm的吸光度值。克隆形成實驗：收集處理后的HGC27和MKN1 細(xì)胞，并配制成1×103個/mL 的細(xì)胞懸液，鋪入6孔板中，每孔1 mL，觀察到克隆體的外觀后使用甲醛固定細(xì)胞，再用1%結(jié)晶紫對細(xì)胞進行染色，最后PBS洗滌3次并拍照。

1.2.5 細(xì)胞黏附實驗

96孔板每孔加入100 μL的1∶4基質(zhì)凝膠，凝膠凝固后，收集處理過的HGC27 和MKN1 細(xì)胞，并配制成1×105個/mL 的細(xì)胞懸液，鋪入96 孔板中，每孔100 μL，隨后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2、4和8 h，PBS洗滌3次后，更換新的培養(yǎng)基后進行CCK-8檢測。

1.2.6 遷移和侵襲實驗

遷移實驗：收集處理后的HGC27 和MKN1 細(xì)胞，并配制成2×105個/mL 的細(xì)胞懸液，鋪入6 孔板中，每孔2 mL，24 h 后使用滅菌的200 μL 槍頭垂直于6 孔板底部橫線劃線，更換無血清培養(yǎng)基，分別在0、12、24 h后使用熒光倒置顯微鏡拍照。侵襲實驗：收集處理后的HGC27 和MKN1 細(xì)胞，并配制成1×106個/mL 的無血清細(xì)胞懸液，將細(xì)胞加入鋪有1∶8基質(zhì)凝膠的Transwell上層小室中，每孔100 μL。小室的底部加入500 μL 20%的血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，使用甲醛固定細(xì)胞，再用0.1%結(jié)晶紫對細(xì)胞進行染色，最后PBS洗滌3次并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析都使用R 軟件（4.1.2 版本）和GraphPad Prism 8進行，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。根據(jù)中位數(shù)將BCHE mRNA在GC組織中的表達水平分為高表達組和低表達組［15-18］。生存分析采用Kaplan-Meier 法并進行l(wèi)og-rank 檢驗。使用R 包“forestplot”進行單因素和多因素Cox回歸分析，并將單因素分析中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的變量納入多因素分析。BCHE 表達高低與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 BCHE 與GC 患者預(yù)后及臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析

首先通過Lasso 回歸分析篩選出15 個與GC 患者總生存期（overall survival，OS）有關(guān)的基因：BCHE、GPX3、ADAMTS18、ASPA、CD36、SERPINE1、CYP19A1、LRAT、CGB5、ANO3、SOX14、CYMP、CFHR4、F13B和OTX2（圖1A）；其次，根據(jù)生存曲線分析篩選出影響預(yù)后差異最顯著的基因BCHE（P＜0.001，圖1B），且發(fā)現(xiàn)BCHE mRNA 高表達的GC 患者無進展生存期（P=0.001）、疾病特異性生存期（P=0.002）和無病生存期（P=0.004）更短（圖1C～E）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，BCHE mRNA 在腫瘤組織中的表達水平高于癌旁組織（P＜0.001），同時BCHE mRNA 在晚期GC（Ⅲ/Ⅳ期）患者中的表達水平高于早期GC（Ⅰ/Ⅱ期）患者（P=0.020，圖1F）。根據(jù)BCHE mRNA 在GC 組織中表達水平的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組，分析BCHE mRNA 的表達與GC患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，BCHE mRNA 的高表達與T 分期（P=0.029）、TNM 分期（P=0.035）、腫瘤類型（P＜0.001）、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）（P＜0.001）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）（P＜0.001）等臨床病理參數(shù)相關(guān)（表1）。此外，單因素分析結(jié)果顯示BCHE mRNA 的表達水平（P＜0.001）、年齡（P=0.010）、T分期（P=0.002）、M分期（P=0.002）、N分期（P=0.002）、TNM分期（P＜0.001）和腫瘤類型（P=0.030）與GC患者預(yù)后有關(guān)。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床因素和BCHE表達水平因素一并納入多因素分析，結(jié)果表明BCHE mRNA 的表達水平（P=0.006）、年齡（P=0.025）和M分期（P=0.019）均是GC患者的獨立預(yù)后因素（表2）。

表1 BCHE mRNA與GC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 The relationship of BCHE mRNA with clinical features

表2 BCHE mRNA及臨床病理參數(shù)的單因素及多因素Cox回歸分析Table 2 Univariate analysis and multivariate Cox regression analysis of BCHE mRNA and clinical features

圖1 BCHE mRNA在GC中的表達水平及相關(guān)生存分析Figure 1 The expression of BCHE mRNA and related survival analysis in GC

2.2 BCHE表達和免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

首先，使用CIBERSORT 算法研究BCHE mRNA與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。結(jié)果表明，BCHE mRNA 高表達與多種免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)，包括漿細(xì)胞、B 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等（P＜0.05，圖2A）；進一步通過TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫研究BCHE mRNA 表達與免疫細(xì)胞浸潤之間的具體相關(guān)性。結(jié)果表明，在GC 中BCHE mRNA 的表達與B 細(xì)胞（r=0.192，P＜0.001）、單核細(xì)胞（r=0.226，P＜0.001）、巨噬細(xì)胞（r=0.169，P＜0.001）、NK 細(xì)胞（r=0.137，P=0.008）、肥大細(xì)胞（r=0.432，P＜0.001）和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer fibroblast，CAF）（r=0.733，P＜0.001）顯著正相關(guān)；與CD4+T 細(xì)胞（r=-0.256，P＜0.001）和CD8+T 細(xì)胞（r=-0.104，P=0.043）顯著負(fù)相關(guān)（圖2B）。

圖2 BCHE與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析Figure 2 The correlation between BCHE and immune cell infiltration

2.3 BCHE基因的富集分析

為了解目的基因BCHE可能存在的生物學(xué)功能和信號通路，我們利用WGCNA 算法和ESTIMATE算法篩選與BCHE 基因相關(guān)的共表達基因，選擇了與免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性最高的棕色模塊（包含了188 個與BCHE 共表達的基因）（圖3A），使用DAVID數(shù)據(jù)庫對這188個基因進行富集分析，GO分析結(jié)果表明BCHE 的表達可能與細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移等功能有關(guān)（圖3B）。KEGG 分析表明，BCHE 的功能可能與PI3K-Akt 信號通路、TGF-β信號通路和癌癥通路等有關(guān)（圖3C）。

圖3 BCHE mRNA的富集分析Figure 3 Enrichment analysis of BCHE mRNA

2.4 BCHE 敲減對GC 細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲的影響

為驗證BCHE 在GC 細(xì)胞中的作用，本研究驗證了該基因的體外功能。qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，GC 細(xì)胞株（HGC27 和MKN1）中BCHE mRNA 的表達顯著高于胃組織正常細(xì)胞株（GSE-1）（P＜0.001，圖4A）。通過siRNA 敲減BCHE 表達，敲減效率如圖4B、C 所示，選擇敲減效率最高的1 號片段（si-BCHE-1）進行下游的功能實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCHE 敲減后明顯抑制了GC 細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05）和克隆形成能力（P＜0.001，圖4D～G）。黏附實驗結(jié)果表明，BCHE敲減后能夠促進GC細(xì)胞的黏附能力（P＜0.05，圖5A、B）。遷移和侵襲實驗結(jié)果表明，BCHE 敲減后明顯抑制GC 細(xì)胞的遷移（P＜0.001）和侵襲能力（P＜0.001，圖5C～F）。這些結(jié)果表明，BCHE 是GC 細(xì)胞中的一個促癌基因，敲減BCHE可抑制其介導(dǎo)的惡性生物學(xué)功能。

圖4 敲減BCHE抑制胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成的能力Figure 4 Knock-down of BCHE inhibits proliferation and colony formation of gastric tumor cells

3 討論

BCHE 是一個潛在的腫瘤標(biāo)志物，其mRNA 水平在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中顯著升高［9，19-20］，且BCHE mRNA的高表達與子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者較差的總生存率相關(guān)［19，21］。本研究通過生信數(shù)據(jù)分析以及實驗驗證發(fā)現(xiàn)，BCHE 在GC 細(xì)胞中高表達，且BCHE mRNA 的高表達與GC 預(yù)后不良呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果提示，BCHE可能是GC新的預(yù)后生物標(biāo)志物。

鑒于GC 微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有重要作用，本研究使用CIBERSORT 算法和TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，BCHE mRNA 高表達與B細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。研究報道顯示，腫瘤微環(huán)境中存在較多的免疫細(xì)胞亞型，部分免疫細(xì)胞亞型與腫瘤患者較差的預(yù)后相關(guān)，如M2型巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞等［22-24］；亦有研究表明，B細(xì)胞浸潤可能和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)［25］。另外，部分T 細(xì)胞上高表達免疫抑制性分子（如PD-1、CTLA-4）等，當(dāng)與攜帶相應(yīng)配體的腫瘤細(xì)胞結(jié)合時，可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷功能，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫體內(nèi)免疫系統(tǒng)的檢查點監(jiān)視，這也成為針對免疫檢查點治療的核心所在［26］。據(jù)此，有理由推測GC 組織中BCHE 的高表達可能通過重塑腫瘤免疫微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進而可影響免疫治療的效果。

研究表明，BCHE 與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生有關(guān)［27-28］。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，BCHE mRNA的敲低顯著抑制了癌細(xì)胞的增殖和侵襲［28］。在對子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)BCHE可能和TGF-β信號通路有關(guān)［21］。然而，BCHE 在GC 中的生物學(xué)功能的研究尚未見報道。本研究通過敲低BCHE mRNA表達顯著減緩了GC細(xì)胞增殖和克隆，并促進GC細(xì)胞的黏附、抑制GC細(xì)胞的遷移和浸潤能力。因此，BCHE 是一個促癌基因，降低BCHE 的表達可抑制其介導(dǎo)的惡性生物學(xué)功能。但本研究仍有不足，如未對BCHE的分子機制進行實驗驗證，因此，本研究團隊將會在今后的工作中完善對該部分內(nèi)容的探索。