A1 類清道夫受體通過促進M2 型巨噬細(xì)胞極化增加脂肪組織產(chǎn)熱能力

張?zhí)焯欤罱鸾?，柏雪雅，?惠，陳 琪，朱旭冬

江蘇省心血管病靶向干預(yù)研究重點實驗室，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，江蘇 南京 211166

心血管疾病發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)仍在逐年上升。肥胖、高血壓和糖尿病等多種危險因素都與心血管疾病發(fā)生相關(guān)［1］。其中，肥胖可歸因于能量攝入與消耗失衡，表現(xiàn)為過多脂質(zhì)在脂肪組織的異常積聚，并伴隨有大量免疫細(xì)胞浸潤。肥胖可導(dǎo)致2型糖尿病、高血壓、腦卒中和多種類型癌癥（胃癌、肝癌、膽囊癌、卵巢癌等）的發(fā)生［2］。與主要負(fù)責(zé)能量存儲的白色脂肪細(xì)胞不同，棕色脂肪細(xì)胞由于富含有大量的線粒體，具備較強的產(chǎn)熱能力［3］。近年的研究表明，白色脂肪細(xì)胞在特殊條件刺激下可以轉(zhuǎn)化為具有產(chǎn)熱能力的米色脂肪細(xì)胞［4］。米色脂肪細(xì)胞可能成為治療糖尿病、慢性炎癥和肥胖等代謝紊亂疾病的新型靶細(xì)胞［5］。

A1 類清道夫受體（macrophage scavenger receptor 1，MSR1）是一類巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體，可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞多種功能，包括脂質(zhì)攝取、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞趨化和極化分型等［6］。MSR1在動脈粥樣硬化、心肌梗死和肥胖誘導(dǎo)的高血壓等心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要保護作用。已有研究表明，慢性低溫刺激誘導(dǎo)下，皮下白色脂肪組織（subcutaneous white adipose tissue，scWAT）中的M2 型巨噬細(xì)胞大量積聚，并促進脂肪細(xì)胞的活化和產(chǎn)熱［7-8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MSR1 可以促進肥胖小鼠附睪脂肪組織中巨噬細(xì)胞的M2 型分化，發(fā)揮拮抗炎癥的作用，提示MSR1 也可能調(diào)控脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力。因此，本研究擬探討MSR1 在低溫刺激誘導(dǎo)脂肪產(chǎn)熱進程中的作用及其機制，尋找新的肥胖相關(guān)性疾病干預(yù)靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6 背景的MSR1 基因敲除小鼠（MSR1-/-）購自美國Jackson 動物研究中心。C57BL/6 小鼠購自江蘇省醫(yī)藥動物實驗中心。

UCP1抗體（Abcam公司，英國）；牛血清白蛋白、HEPES 酸（Biosharp 公司，美國）；BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce 公司，美國）；Electrochemi Luminescence（ECL）（Amersham Biosciences 公司，美國）；免疫組化ABC染色試劑盒（Santa Cruz Biotechnology公司，美國）；RNA 提取試劑（TaKaRa 公司，日本）；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Roche公司，美國）；各種qRT-PCR引物序列由美國Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型及分組

選取8 周齡正常飲食（common diet，CD）的雄性MSR1+/+小鼠作為野生型對照組，MSR1-/-小鼠作為敲除型實驗組，分別將兩種小鼠置于室溫（25 益）或低溫條件（6 益）下持續(xù)刺激1 d或者14 d，或給予兩種小鼠連續(xù)12 周的高脂飲食（high fat diet，HFD）后置于室溫或低溫條件下持續(xù)刺激7 d（HFD 喂養(yǎng)的肥胖小鼠因代謝紊亂，冷刺激14 d 后整體狀態(tài)不佳，故采用冷刺激7 d 方案）。正常飲食實驗?zāi)Ｐ头譃? 組：MSR1+/+25 益組、MSR1-/-25 益組、MSR1+/+6 益組、MSR1-/-6 益組；高脂飲食實驗?zāi)Ｐ头譃? 組：MSR1+/+HFD 25 益組、MSR1-/-HFD 25 益組、MSR1+/+HFD 6 益組、MSR1-/-HFD 6 益組。所有實驗操作均獲得南京醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-2009003）。

1.2.2 MSR1-/-小鼠基因型鑒定

提取MSR1-/-小鼠鼠尾DNA，設(shè)定PCR 反應(yīng)體系擴增產(chǎn)物，配制3%瓊脂糖凝膠，待膠凝固后上樣，插上電極，DNA 由負(fù)極向正極電泳，電壓為200 V。當(dāng)條帶電泳至膠2/3 處時，觀察DNA 成像，其中MSR1+/+為154 bp；MSR1-/-為202 bp。

1.2.3 小鼠巨噬細(xì)胞清除實驗

給予野生型小鼠尾靜脈注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體（clodronate liposomes）或?qū)φ罩|(zhì)體（PBS liposomes）（200 μL/只），用以清除巨噬細(xì)胞。

1.2.4 造模小鼠體重監(jiān)測與代謝籠檢測

每周檢測對照組與實驗組小鼠體重并做好記錄。CD 和HFD 小鼠造模結(jié)束后，送至南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行代謝籠檢測，包括小鼠耗氧量、產(chǎn)熱量。

1.2.5 小鼠造模標(biāo)本收取與處理

造模結(jié)束后麻醉小鼠，進行眼球后靜脈叢取血，并收取小鼠scWAT 和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT），經(jīng)液氮速凍，置于-80 益保存，部分標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中進行固定。

1.2.6 冰凍組織免疫熒光染色

選取小鼠脂肪組織冰凍切片，室溫放置30 min后，PBS 清洗，10%牛血清封閉，加入巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80抗體（Abcam公司，英國）4 益孵育過夜。清洗，二抗室溫避光孵育1～2 h，PBS 清洗，封片，滴加1～2 滴DAPI 覆蓋組織切片，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色

選取小鼠脂肪組織進行石蠟切片，將切片脫蠟至水，依次用3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%牛血清封閉，加入UCP1 抗體（Abcam 公司，英國）4 益孵育過夜。清洗，生物素標(biāo)記工作液室溫避光孵育20 min，PBS清洗，堿性磷酸酶標(biāo)記的工作液室溫孵育20 min，PBS沖洗，顯色劑顯色15 min，充分清洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 qRT-PCR實驗

TRIzol 法提取小鼠脂肪組織總RNA，測定RNA濃度，隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qRT-PCR 擴增目的基因，指標(biāo)18S作為內(nèi)參，校正每個樣本目的基因的Ct 值，以2-ΔΔCt值表示基因的相對表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.9 Western blot實驗

提取小鼠脂肪組織總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，每個樣品孔按40 μg蛋白總量上樣，隨后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4益孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，最后進行顯色成像。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脂肪組織中血管基質(zhì)成分

收取小鼠scWAT置于1%FBS中，濾紙吸干，充分剪碎組織，移至離心管中。使用Ⅱ型膠原酶消化60 min。200 目篩網(wǎng)過濾至EP 管，離心。加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，離心，PBS洗3遍。加入200 μL PBS重懸，加入相應(yīng)抗體，室溫避光孵育60 min，離心，PBS洗3遍。加入250 μL PBS重懸并上機檢測。

1.2.11 小鼠原代白色前脂肪細(xì)胞分離并誘導(dǎo)分化

小鼠處死后75%乙醇浸泡，收取小鼠scWAT置于預(yù)冷的PBS中。消化、過濾、種板。細(xì)胞生長完全融合后進行誘導(dǎo)分化。

1.2.12 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)

小鼠處死后75%乙醇浸泡，用注射器將含有100 μg/mL 肝素的PBS 注入小鼠腹腔中進行沖洗，將沖洗液吸取入針管內(nèi)，注入離心管中。離心后棄上清，加入培養(yǎng)液重懸，放置在37 益培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示。在統(tǒng)計分析前對數(shù)據(jù)的分布進行假設(shè)檢驗后，對滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)采用兩樣本獨立t檢驗或單因素方差分析，對不滿足正態(tài)性或方差齊性的數(shù)據(jù)采用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清除巨噬細(xì)胞可以抑制低溫刺激誘導(dǎo)的scWAT產(chǎn)熱能力且低溫刺激促進小鼠scWAT中MSR1的表達(dá)

為了研究巨噬細(xì)胞在低溫刺激誘導(dǎo)的脂肪組織產(chǎn)熱中的作用，給予8 周齡雄性野生型小鼠氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理，清除巨噬細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果顯示F4/80+巨噬細(xì)胞清除成功（圖1A）。隨后置于室溫或寒冷條件下處理14 d，期間正常飲食喂養(yǎng)。造模結(jié)束后，提取小鼠scWAT總RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示，野生型小鼠清除巨噬細(xì)胞后scWAT產(chǎn)熱能力標(biāo)志物（UCP1、Cidea、Cox8b）基因的表達(dá)明顯低于對照小鼠（圖1B～D）。為了進一步探究低溫刺激對小鼠脂肪組織MSR1 表達(dá)的影響。將8 周齡雄性野生型小鼠置于室溫或寒冷條件下處理14 d，期間正常飲食喂養(yǎng)。造模結(jié)束后，提取小鼠scWAT 總RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示，小鼠給予寒冷刺激后scWAT中MSR1表達(dá)量明顯高于對照小鼠（圖1E）。

圖1 清除野生型小鼠巨噬細(xì)胞并低溫刺激14 d后小鼠scWAT的產(chǎn)熱能力以及低溫刺激14 d后小鼠scWAT中MSR1的表達(dá)Figure 1 The thermogenic capacity of scWAT of WT mice after macrophages clearance and 14 days of cold exposure，and MSR1 expression in adipose tissue of mice after 14 days of cold exposure

2.2 MSR1不影響急性低溫刺激情況下小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱能力

為了探究MSR1 在小鼠脂肪產(chǎn)熱過程中的作用，使用MSR1-/-小鼠進行研究。首先對MSR1-/-小鼠進行基因型鑒定（圖2A），并通過Western blot 檢測了小鼠脂肪組織中MSR1的表達(dá)情況（圖2B）。將8 周齡雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠置于室溫或寒冷條件下處理1 d（短期急性冷刺激），期間正常飲食喂養(yǎng)。造模結(jié)束后，提取4組小鼠scWAT和BAT總RNA。qRT-PCR 結(jié)果顯示，置于6 益條件下小鼠scWAT 和BAT中產(chǎn)熱指標(biāo)（UCP1、Cidea和Cox8b）表達(dá)量均高于室溫條件下小鼠（部分指標(biāo)未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異）；MSR1表達(dá)缺失小鼠與野生型對照小鼠相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2C～H），說明在短期（1 d）寒冷刺激條件下MSR1不影響脂肪組織產(chǎn)熱能力。

圖2 低溫刺激MSR1+/+和MSR1-/-小鼠1 d后小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱能力Figure 2 The thermogenic capacity of adipose tissue of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 1 day of cold exposure

2.3 低溫刺激14 d 后MSR1-/-小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱能力顯著降低

將8 周齡雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠置于室溫或寒冷條件下處理14 d（長期慢性冷刺激），期間正常飲食喂養(yǎng)。14 d后，提取小鼠scWAT和BAT總RNA以及小鼠scWAT總蛋白。qRT-PCR結(jié)果顯示，置于低溫條件下，小鼠脂肪組織中UCP1、Cidea 和Cox8b表達(dá)量明顯高于室溫條件下小鼠；MSR1-/-小鼠給予6 益處理，scWAT 和BAT 中UCP1、Cidea 和Cox8b 表達(dá)量明顯低于MSR+/+6 益小鼠（圖3A～F）。Western blot 結(jié)果同樣顯示，置于低溫環(huán)境下MSR1+/+和MSR1-/-小鼠脂肪組織中UCP1 表達(dá)水平顯著高于室溫條件下小鼠；與MSR+/+6 益小鼠相比，MSR1-/-6 益小鼠scWAT中UCP1表達(dá)水平明顯降低（圖3G、H），說明MSR1 可以促進慢性冷刺激誘導(dǎo)的脂肪組織產(chǎn)熱。

圖3 低溫刺激MSR1+/+和MSR1-/-小鼠14 d后小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱能力Figure 3 The thermogenic capacity of adipose tissue of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 14 days of cold exposure

2.4 低溫刺激情況下，與對照組相比MSR1-/-小鼠scWAT中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量降低

為了探究低溫刺激下MSR1對小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞極化的影響，進一步檢測了給予小鼠低溫刺激14 d 后，小鼠脂肪組織中M2 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量情況。14 d低溫刺激后，提取小鼠scWAT總RNA和基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF），qRTPCR 結(jié)果顯示，MSR1-/-6 益小鼠scWAT 中Mrc2 和Mgl1 的表達(dá)量均明顯低于MSR+/+6 益小鼠（圖4A、B）。對scWAT中的SVF進行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果同樣顯示，與MSR+/+6 益小鼠相比，MSR1-/-6 益小鼠F4/80+CD11b+CD206+M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯降低，F(xiàn)4/80+CD11b+CD11c+M1 型巨噬細(xì)胞比例增高（圖4C、D）。以上結(jié)果表明，低溫刺激下，MSR1 促進小鼠脂肪組織產(chǎn)熱是通過誘導(dǎo)脂肪組織M2型巨噬細(xì)胞的極化實現(xiàn)的。

圖4 低溫刺激14 d MSR1+/+和MSR1-/-小鼠scWAT中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量Figure 4 The numbers of M2 macrophage in scWAT of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 14 days of cold exposure

2.5 MSR1-/-肥胖小鼠脂肪組織產(chǎn)熱能力顯著降低

為了進一步探究MSR1對肥胖小鼠脂肪組織產(chǎn)熱的影響。給予6 周齡雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠CD 或HFD 連續(xù)喂養(yǎng)12 周，每周監(jiān)測小鼠體重變化。12周后，使用代謝籠法監(jiān)測小鼠耗氧量和產(chǎn)熱量變化。將高脂造模MSR1+/+和MSR1-/-小鼠分別置于常溫或低溫環(huán)境刺激7 d 后，提取小鼠scWAT 和BAT 總RNA。結(jié)果顯示，HFD 12 周后，與野生型對照組相比，MSR1-/-小鼠體重增加更為顯著（圖5A），耗氧量和產(chǎn)熱量降低（圖5B、C）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，低溫刺激情況下，HFD 喂養(yǎng)的MSR1-/-小鼠脂肪組織中產(chǎn)熱標(biāo)記物（UCP1、Cidea和Cox8b）含量明顯低于MSR+/+HFD 6 益小鼠（圖5D～I）。免疫組化結(jié)果顯示，置于6 益條件下小鼠scWAT 中UCP1 表達(dá)量明顯高于室溫條件下小鼠；而MSR1-/-HFD 6 益小鼠scWAT 中UCP1 表達(dá)量明顯低于MSR1+/+HFD 6 益小鼠（圖5J）。結(jié)果表明，MSR1能促進肥胖小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱能力。

2.6 MSR1表達(dá)缺失顯著抑制巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)小鼠前脂肪細(xì)胞分化的脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱能力

為了進一步確認(rèn)MSR1表達(dá)缺失巨噬細(xì)胞可以降低脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱能力，使用了巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（PEM）進行了離體細(xì)胞實驗。應(yīng)用PEM 分別培養(yǎng)3～4 周齡雄性MSR1+/+或MSR1-/-小鼠scWAT 中的前脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，并提取脂肪細(xì)胞總RNA。qRT-PCR 結(jié)果顯示，PEM 誘導(dǎo)的MSR+/+成熟脂肪細(xì)胞中UCP1 和Cox8b 表達(dá)量明顯高于DMEM對照組；PEM誘導(dǎo)的MSR1-/-成熟脂肪細(xì)胞中UCP1 和Cox8b 表達(dá)量明顯低于PEM 誘導(dǎo)的MSR1+/+成熟脂肪細(xì)胞，說明巨噬細(xì)胞MSR1 可以促進脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱能力（圖6A、B）。

圖6 MSR1表達(dá)缺失巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)小鼠前脂肪細(xì)胞分化，檢測脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力Figure 6 MSR1 expression deficient macrophage conditioned medium induced differentiation of mouse preadipocytes and measured the thermogenic capacity of adipocytes

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有許多重要功能。它可以通過吞噬作用清除病原體，還可以通過抗原攝取和處理來調(diào)節(jié)各種病原體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)［9-11］。已有研究指出，巨噬細(xì)胞的這些功能與其極化狀態(tài)密切相關(guān)［12］。巨噬細(xì)胞M1極化的特征是產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-1β等）參與調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)，而巨噬細(xì)胞的M2極化則與免疫抑制、腫瘤發(fā)生、傷口修復(fù)和清除寄生蟲有關(guān)。M1/M2 巨噬細(xì)胞平衡極化決定了器官在炎癥或損傷中的命運［13-14］。因此，巨噬細(xì)胞極化分型的動態(tài)平衡對治療相關(guān)疾病具有重要意義。

巨噬細(xì)胞在脂肪組織產(chǎn)熱過程中起到關(guān)鍵作用。已有研究表明，鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運體（SGLT2）抑制劑通過提高脂肪利用率和促進脂肪棕色化來抑制體重增加，并通過在scWAT 和肝臟中極化M2 型巨噬細(xì)胞來減弱肥胖引起的炎癥和胰島素抵抗［15］。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1/M2極化分型是代謝相關(guān)疾病治療的重要靶點。

在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞進程中，大量清道夫受體得以表達(dá)。其中，MSR1 是一種主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的模式識別受體，參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，如參與巨噬細(xì)胞趨化募集和與其他先天受體的相互作用，以及抗原攝取、處理和呈現(xiàn)，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞激活［16］。本課題組前期研究表明，MSR1 缺失加劇了HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠機體的胰島素抵抗，伴隨有小鼠附睪脂肪組織中F4/80+CD11b+CD11c+的M1 型巨噬細(xì)胞比例明顯增加，F(xiàn)4/80+CD11b+CD206+的M2型巨噬細(xì)胞比例明顯降低，機體炎癥反應(yīng)加重。于是，本研究推測MSR1 可能參與脂肪組織產(chǎn)熱功能，并且這一作用與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)相關(guān)。

本研究應(yīng)用MSR1 全身性敲除小鼠，通過給予小鼠急性和慢性的低溫刺激，觀察脂肪組織產(chǎn)熱情況。結(jié)果顯示在慢性低溫刺激下MSR1-/-小鼠脂肪組織產(chǎn)熱能力明顯低于MSR1+/+小鼠，而在急性低溫刺激下，兩組無明顯差異。進一步在肥胖小鼠模型中觀察到類似結(jié)果。同時，本研究檢測小鼠脂肪組織中不同類型巨噬細(xì)胞的極化情況。結(jié)果顯示，MSR1對脂肪組織產(chǎn)熱能力的作用可能與其促進小鼠白色脂肪組織M2型巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)。

綜上所述，MSR1 在低溫刺激下可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的M2型極化進而增強脂肪組織產(chǎn)熱。