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    蝦肝腸胞蟲水通道蛋白基因EHP00_492 的克隆與表達特征分析

    2023-10-29 12:54:20李晨曦吳慧欣吳玉嬌孟憲志潘國慶龍夢嫻
    廣東農業(yè)科學 2023年8期
    關鍵詞:對蝦孢子克隆

    李晨曦,吳慧欣,2,吳玉嬌,陳 潔,孟憲志,潘國慶,龍夢嫻

    (1.西南大學資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室/微孢子蟲感染與防控重慶市重點實驗室,重慶 400715;2.西南大學蠶桑紡織與生物質科學學院,重慶 400715)

    【研究意義】凡納濱對蝦原產于太平洋沿岸,目前是我國主要的對蝦養(yǎng)殖品種之一,年產量可高達百萬噸[1]。但凡納濱對蝦常遭受病毒、細菌和真菌等病原感染,給全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[2]。2004 年泰國新發(fā)現(xiàn)了一種對蝦病原,2009 年鑒定為微孢子蟲,命名為蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。EHP 主要感染對蝦肝胰腺,通過影響宿主免疫和代謝,抑制對蝦正常生長發(fā)育甚至危及存活率[3-5]。2013年我國首次檢出EHP,至今已傳播至各大養(yǎng)殖區(qū),極大地威脅國內對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[6-8]。迄今已發(fā)現(xiàn)200 多屬、1 700 多種微孢子蟲[9-11],它們具有相似且特殊的侵染方式,即適宜環(huán)境條件下,刺激微孢子蟲發(fā)芽,極管迅速彈出,病原性孢原質通過此中空管道運輸至宿主細胞內。研究發(fā)現(xiàn),水通道蛋白參與激活微孢子蟲發(fā)芽[12-14]。為有效防控蝦肝腸胞蟲,揭示其侵染機制顯得尤為重要?!厩叭搜芯窟M展】水通道蛋白作為細胞膜上的跨膜蛋白,參與水和小分子溶質跨膜的雙向運輸,幾乎存在于所有生物中。水通道蛋白以四聚體形式存在,每個單體都會形成具有高度選擇性的中空通道以運輸合適分子。目前,已發(fā)現(xiàn)300 多種不同的水通道蛋白,其中人的水通道蛋白有13 種亞型,分別是AQP0~AQP12[15]。水通道蛋白由6 個α-螺旋跨膜結構域組成,具有2 個保守基序NPA(Asn-Pro-Ala)、5 個環(huán)結構(A~E 環(huán)),汞離子通過作用于E 環(huán)上NPA 基序前的半胱氨酸位點可逆地抑制水通道蛋白功能[16-17]。Frixione 等[14]利用HgCl2處理按蚊微孢子蟲(Nosema algerae),發(fā)現(xiàn)HgCl2可顯著抑制按蚊微孢子蟲發(fā)芽,推測水通道蛋白參與按蚊微孢子蟲的發(fā)芽過程。2006 年Ghosh 等[18]從兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozoon cuniculi)中鑒定到首個微孢子蟲水通道蛋白EcAQP,其具有保守的水通道蛋白序列特征,將其編碼基因轉染至非洲爪蟾卵母細胞中異源表達,發(fā)現(xiàn)該卵母細胞的通透性顯著增加,表明EcAQP 具有促進水滲透的功能。Chen 等[19]從家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)基因組中克隆得到NbAQP,發(fā)現(xiàn)NbAQP蛋白定位于成熟孢子的孢壁,并且NbAQP 抗體能有效抑制孢子發(fā)芽率,進一步證實了水通道蛋白在微孢子蟲發(fā)芽中發(fā)揮重要功能。【本研究切入點】目前蝦肝腸胞蟲全基因序列測序分析已經(jīng)完成[20],但有關EHP 水通道蛋白的研究尚未見報道。鑒于此,本研究以蝦肝腸胞蟲水通道蛋白EHP00_492 為試驗對象,對其編碼基因進行克隆,預測其蛋白質的序列與結構特征,分析該蛋白在EHP 成熟孢子中的表達定位特征。【擬解決的關鍵問題】本研究從蝦肝腸胞蟲EHP 的cDNA 中克隆EHP00_492基因;通過生物信息學方法分析其編碼蛋白的序列特征、三維結構特征及其與同源蛋白間的親緣關系;構建重組表達載體pCold-TF-EHP00_492,轉化大腸桿菌異源表達,純化重組蛋白并制備多克隆抗體;分析EHP00_492在EHP 成熟孢子中的表達及亞細胞定位特征,以期為EHP 水通道蛋白的功能研究奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗于2021—2022 年在西南大學資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點實驗室開展。供試的感染EHP 與未感染EHP 的凡納濱對蝦均購自重慶市合川區(qū)和銅梁區(qū)的養(yǎng)殖池塘,新西蘭實驗兔購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司;大腸桿菌Escherichia coliDH5α 和Rosetta 感受態(tài)細胞購自重慶靈精生物科技有限公司,pCold-TF 表達質粒由本實驗室保存;PrimeSTAR DNA 聚合酶、XhoI 和PstI 限制性內切酶、IPTG、脫脂奶粉購自Takara Bio 公司,425-600 μm 玻璃珠、弗氏佐劑、DAPI 細胞核染料、HRP 標記山羊抗兔IgG、Triton X-100購自Sigma-Aldrich公司,Alexa Fluor?594 山羊抗兔熒光二抗購自Invitrogen 公司,TF-tag 兔多克隆抗體購自迅檢(重慶)生命科技有限責任公司;DNA 膠回收試劑盒、Total RNA提取試劑盒、質粒抽提試劑盒購自Omega Bio-Tek 公司,一步法快速克隆試劑盒購自上海翊圣生物公司;PMSF、考馬斯亮藍染色液、Wheat Germ Agglutinin(WGA-488)購自碧云天生物技術有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)蝦肝腸胞蟲水通道蛋白編碼基因EHP00_492序列(GenBank No.MNPJ01000023.1: 89 904~90 632,729 bp),使用Primer 5.0 軟件設計特異性引物。用于RT-PCR 的引物對,EHP00_492-F1序列:5′-ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′,EHP00_492-R1 序列:5′-TTATTTAAACAACAAAA ATACTTG-3′;用于克隆的引物對,EHP00_492-F2 序列:5′-GGCATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′(下劃線為XhoI 酶切位點),EHP00_492-R2序列:5′-GCAGAGATTACCTATCTAGACTGCAGTTATTT AAACAACAAAAATACTTG-3′(下劃線為PstI 酶切位點)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2.2 RNA 提取和RT-PCR 采用RT-PCR 方法克 隆EHP00_492基因。取 約1×106個EHP 孢子,按照RNA 提取試劑盒說明書提取RNA,并利用逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板、EHP00_492-F1/R1 為引物,通過PCR 擴增EHP00_492基因。PCR 反應體系:PrimerSTAR DNA(2×)聚合酶 25 μL,引物 0.2 μmol/L,cDNA 1 μL,ddH2O 補足至50 μL。PCR反應條件:98 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產物,并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

    1.2.3 生物信息學分析 通過NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)完成序列檢索并利用微孢子蟲數(shù)據(jù)庫(https://microsporidiadb.org/micro/app/)進行基因座位分析;利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)進行分子量、氨基酸數(shù)量和等電點等特征預測;利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白信號肽預測;利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行蛋白潛在磷酸化位點預測;利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進行蛋白二級結構預測;利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質功能域預測;利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進 行跨膜結構域預測;利用MAFFT(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)進行微孢子蟲與不同物種之間水通道蛋白的多重序列比對;利用AlphaFold 軟件進行蛋白質三維結構預測與比對;利用MEGA 7.0 軟件基于Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.4EHP00_492重組質粒構建 將pCold-TF載體質粒進行XhoI 和PstI 雙酶切,酶切反應體系:限制性內切酶各3.5 μL,CutSmart buffer 5 μL,模板1~5 μg,ddH2O 補足至50 μL。酶切反應條件:37 ℃下孵育20 min。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收。使用EHP00_492-F2/R2 引物擴增EHP00_492片段,反應體系:PrimerSTAR DNA 聚合酶 25 μL,引物 0.2 μmol/L,模板1 μL,ddH2O 補足至50 μL。反應條件:98 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min,擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收。根據(jù)一步法克隆試劑盒的操作說明將4 μL 載體與6 μL 外源片段進行連接,連接酶10 μL,50 ℃孵育20 min。將連接產物轉化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞中,并涂布于含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。挑取單菌落提取質粒進行PCR 和雙酶切驗證,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    1.2.5 EHP00_492 異源蛋白表達、純化及其兔多克隆抗體制備 將測序正確的pCold-TFEHP00_492重組質粒轉化至表達菌株E.coliRosetta 中,添 加0.5 mmol/L IPTG誘導,收 集菌體進行破碎,使用Ni-NTA 親和層析柱純化rEHP00_492 重組蛋白。純化后的rEHP00_492 蛋白與佐劑混合后免疫新西蘭實驗兔,制備兔多克隆抗體。

    1.2.6 EHP 孢子總蛋白提取 取約1×106個EHP成熟孢子,加入1×PBS 300 μL、PMSF 20 μL 和425~600 μm玻璃珠0.4 g混合進行破碎,破碎條件:6 m/s,30 s/輪,6 輪/次,每輪間歇10 s,共破碎3 次。離心后的上清即為EHP 孢子總蛋白。

    1.2.7 蛋白免疫印記(Western blot)將EHP 孢子總蛋白進行SDS-PAGE 電泳后,電轉至PVDF膜。將PVDF 膜于37 ℃下封閉1~2 h;分別利用EHP00_492 兔多克隆抗體和TF-tag 兔多克隆抗體室溫下孵育PVDF 膜1 h,利用羊抗兔IgG 二抗室溫下孵育PVDF 膜45 min。采用化學發(fā)光成像儀(Azure Biosystems C300)對PVDF膜進行曝光、成像。

    1.2.8 間接免疫熒光實驗(Indirect immunofluorescence assay,IFA)將EHP 孢子涂布于包被0.01%(V/V)多聚賴氨酸的載玻片上,滴加4%(V/V)多聚甲醛固定樣品,加入1%(V/V)Triton X-100 處理20 min;加入IFA 封閉液于室溫下孵育1 h,分別加入EHP00_492 兔多克隆抗體和TF-tag 兔多克隆抗體于室溫下孵育1 h,加入Alexa Fluor?594山羊抗兔熒光二抗于室溫下避光孵育1 h;加入DAPI 和Wheat Germ Agglutinin(WGA-488)于室溫下避光染色20 min,使用激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS FV1000)觀察結果。

    2 結果與分析

    2.1 EHP00_492 基因座位保守性分析

    通過6 種微孢子蟲同源基因座位保守性分析發(fā)現(xiàn),蝦肝腸胞蟲EHP00_492與畢氏腸胞蟲EBI_27080、黃道蟹微孢子蟲ECANGBI_2177、兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740、腸腦炎微孢子蟲Eint_070680和海倫腦炎微孢子蟲EHEL_070710同源基因及其鄰近基因座位相當保守(圖1),推測這些基因行使相似且保守的功能。兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740 已被鑒定具有水通道蛋白的功能[18],推測EHP00_492是蝦肝腸胞蟲水通道蛋白編碼基因。

    圖1 EHP00_492 同源基因座位保守性分析Fig. 1 Conservation analysis of EHP00_492 homologous gene locus

    2.2 EHP00_492 基因克隆

    提取EHP 總RNA,反轉錄cDNA,以cDNA為模板,采用EHP00_492-F1/R1 引物進行RTPCR 擴增。電泳結果(圖2)顯示,約750 bp 處有1 條特異性擴增條帶;經(jīng)測序可知,RT-PCR擴增條帶的序列與EHP00_492全長序列一致,表明該基因無內含子。

    2.3 EHP00_492 序列特征

    EHP00_492 含有242 個氨基酸,預測分子量為25 kD。經(jīng)預測EHP00_492 無信號肽,但具有多個絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾位點。利用PSIPRED 對EHP00_492 的二級結構進行分析,結果(圖3)表明該蛋白具有8 個α 螺旋和多個無規(guī)則卷曲。TMHMM 分析發(fā)現(xiàn),EHP00_492 中12~31 aa、41~60 aa、91~113 aa、133~155 aa、176~198 aa、218~240 aa 的位置存在6 個跨膜結構域(圖4)。SMART 預測結果(圖5)顯示,EHP00_492 含有1 個保守的水通道蛋白家族結構域(2~236 aa)。比較EHP00_492 與不同微孢子蟲同源蛋白發(fā)現(xiàn),它們都富含亮氨酸,等電點偏酸性,均含有6~8 個跨膜結構域(表1)。

    表1 EHP00_492 同源蛋白序列特征比較Table 1 Comparison sequence characteristics of EHP00_492 and homologous proteins

    圖3 EHP00_492 二級結構特征分析Fig. 3 Analysis of the secondary structure of EHP00_492

    圖4 EHP00_492 跨膜域預測Fig. 4 Prediction for the transmembrane domain of EHP00_492

    圖5 EHP00_492 功能結構域分析Fig. 5 Analysis of the function domain of EHP00_492

    2.4 EHP00_492 序列保守性與同源蛋白親緣進化關系分析

    BlastP 比對結果(圖6)發(fā)現(xiàn),EHP00_492與畢氏腸胞蟲EBI_27080 序列相似性最高,為74%;與兔腦炎微孢子蟲ECU07_0740、海倫腦炎微孢子蟲EHEL_070710、腸腦炎微孢子蟲Eint_070680 序列相似性介于46%~48%之間;多重序列比對發(fā)現(xiàn),EHP00_492 與其他同源蛋白均存在2 個水通道蛋白的保守基序NPA/G,分別位于69~71 aa 和201~203 aa 處,且呈對稱分布。系統(tǒng)進化樹分析結果(圖7)發(fā)現(xiàn),EHP00_492 與畢氏腸胞蟲水通道蛋白EBI_27080 聚為一支;相比于人水通道蛋白NP932766.1 和對蝦水通道蛋白ROT75608.1,微孢子蟲來源的水通道蛋白與酵母水通道蛋白ADC55558.1 的進化關系更近。

    圖6 EHP00_492 同源序列比對Fig. 6 Alignment analysis of EHP00_492 and homologous sequences

    圖7 EHP00_492 系統(tǒng)進化樹分析Fig. 7 Phylogenetic tree analysis of EHP00_492

    2.5 EHP00_492 蛋白三維結構預測

    利用AlphaFold 軟件預測EHP00_492 蛋白的三維結構(圖8),并與已完成功能鑒定的

    圖8 EHP00_492 與NbAQP 和EcAQP 三維結構比對Fig. 8 Comparison the three-dimensional structure of EHP00_492,NbAQP and EcAQP

    家蠶微粒子蟲水通道蛋白NbAQP(GenBank No.NBO_16g0013)和兔腦炎微孢子蟲水通道蛋白EcAQP(GenBank No.ECU07_0740)的三維結構比對,發(fā)現(xiàn)3 個蛋白質在10~32 aa、42~126 aa、129~160 aa、172~242 aa 處存在重疊,暗示其蛋白功能的保守性。

    2.6 EHP00_492 蛋白的表達特征

    將pCold-TF-EHP00_492重組表達質粒轉化E.coliRosetta 菌株中,IPTG 誘導后獲得大量rEHP00_492 重組蛋白,利用Ni-NTA 親和層析柱純化后,SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)100 mmol/L 咪唑能純化出質量較高的rEHP00_492 重組蛋白,分子量大小約為75 kD,與預測分子量大小一致(圖9 A)。將rEHP00_492 重組蛋白免疫新西蘭實驗兔制備EHP00_492 兔多克隆抗體。通過蛋白免疫印記分析EHP00_492 在EHP 中的表達特征,結果(圖9 B)顯示,與陰性對照pCold-TF 抗體相比,EHP00_492 兔多克隆抗體可在EHP 天然總蛋白中識別1 條大小約21 kD 的條帶,表明EHP00_492在EHP 中能表達,其分子量大小為21 kD。

    圖9 EHP00_492 蛋白的純化與表達特征Fig. 9 Purification and expression characteristics of EHP00_492

    2.7 EHP00_492 亞細胞定位特征

    為進一步分析EHP00_492 的亞細胞定位特征,利用麥胚芽凝集素WGA-488 特異性標記EHP 成熟孢子孢壁上的幾丁質,結果(圖10)發(fā)現(xiàn),與對照組相比,紅色熒光標記的EHP00_492兔多克隆抗體能特異性識別EHP 成熟孢子中的EHP00_492 蛋白,并且紅色熒光信號與綠色熒光標記的WGA-488 信號存在共定位現(xiàn)象,表明EHP00_492 蛋白定位于EHP 成熟孢子的孢壁上。

    圖10 IFA 分析EHP00_492 在EHP 成熟孢子中的亞細胞定位特征Fig. 10 Subcellular location characteristics of EHP00_492 in EHP mature spores by IFA

    3 討論

    2004 年以來,EHP 相繼在泰國、中國、印度、印度尼西亞和委內瑞拉等對蝦養(yǎng)殖大國被發(fā)現(xiàn),由于其具有快速水平傳播和垂直傳播的能力,給全球對蝦養(yǎng)殖生產造成了嚴重經(jīng)濟損失[21]。微孢子蟲具有一個特殊的侵染裝置,由極管、極膜層和后極泡3 部分組成[22-23]。特定環(huán)境刺激孢子發(fā)芽,極管從成熟孢子內部迅速彈出并刺入宿主細胞,將具有病原性的孢原質運送至宿主細胞完成侵染[24-25]。因此,發(fā)芽是微孢子蟲成功感染宿主的關鍵。

    研究發(fā)現(xiàn),微孢子蟲內外滲透壓的瞬間變化激活了孢子發(fā)芽,在此過程中,水通道蛋白發(fā)揮重要作用[26]。水通道蛋白屬于MIP 蛋白超家族,可選擇性地將水、中性小分子和離子進行跨膜運輸。MIP 超家族分為水通道蛋白(AQPs)和甘油攝取促進劑(GlpFs)兩大類,前者存在于所有生命,后者多來源于微生物[27]。作為第一亞家族,AQPs 是水選擇透性的水通道蛋白,包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5 和AQP6。第二亞家族GlpFs 既能滲透水,也能運輸其他不帶電的小分子(如氨、尿素和甘油等)。根據(jù)氨基酸序列特征,AQP3、AQP7、AQP9 和AQP10 歸屬于這一家族[28-29]。原核生物的水通道蛋白首次發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌,水通道蛋白AqpZ 介導水的快速流入或流出以應對大腸桿菌細胞外滲透壓變化,此外,AqpZ 還有助于大腸桿菌細胞體積的增長[27]。釀酒酵母含有4 個水通道蛋白基因,分別為AQY1、AQY2、AQY3和Fps1。低溫使釀酒酵母細胞膜的流動性和滲透性降低,但水通道蛋白AQY1 能加速胞內水的流出,避免細胞死亡[30]。水通道蛋白參與了細胞膜的滲透調節(jié)。微孢子蟲也具有水通道蛋白,當其發(fā)芽激活時,水通道蛋白促進水分子迅速流入孢子內部,造成后極泡和極膜層瞬間膨脹,直至孢子前端破裂,極管被膨脹的后極泡推動并外翻彈出。此外,氯化汞能抑制水通道蛋白功能,但無法抑制EcAQP 對水的滲透,推測EcAQP 缺乏位于NPA 保守基序旁對汞敏感的半胱氨酸位點。蝦肝腸胞蟲作為養(yǎng)殖對蝦檢出率最高的病原之一,目前暫無有效防治藥物。因此,后續(xù)研究工作可探索靶向EHP00_492 的抑制劑降低孢子發(fā)芽,以期有效控制EHP 傳播。

    4 結論

    本研究從蝦肝腸胞蟲基因組中篩選到水通道蛋白編碼基因EHP00_492,序列分析發(fā)現(xiàn)EHP00_492 符合水通道蛋白保守的序列特征。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),EHP00_492 與畢氏腸胞蟲水通道蛋白EBI_27080 親緣關系最近,并且與已鑒定的家蠶微孢子蟲水通道蛋白NbAQP、兔腦炎微孢子蟲水通道蛋白EcAQP 的三維結構高度相似。EHP00_492 能表達定位于蝦肝腸胞蟲成熟孢子的孢壁上,推測其在EHP 發(fā)芽過程中發(fā)揮重要功能。本研究初步明確了EHP00_492 蛋白的序列特征、結構特征和表達定位特征,對進一步探究EHP 水通道蛋白的功能具有重要意義。

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