黃芩苷抑制Panx-1 和P2X7 的激活減輕副豬嗜血桿菌病血管內(nèi)皮細胞損傷

周靈露，付書林，袁昱珍，邱銀生

（武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，武漢 430023）

副豬嗜血桿菌（Glaesserellaparasuis，GPS）是一種嗜血桿菌科巴氏桿菌屬的革蘭氏陰性菌，纖維素性炎是其在臨床上的重要病理特征，引起的炎癥反應(yīng)重且死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失［1，2］。黃芩苷（Baicalin，BA）是具有清熱解毒的天然藥物黃芩的主要成分，因其具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等多種生物活性而成為研究熱點［3］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能抑制脂多糖和副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)的豬單核細胞和血管內(nèi)皮細胞NF-κB、NLRP3 和MAPK 等信號分子的激活［4-7］，具有抗炎和抗凋亡作用，研究其對副豬嗜血桿菌血管屏障損傷的保護作用，對于挖掘黃芩苷在緩解副豬嗜血桿菌病的用途十分重要。本試驗采取體外方法，研究副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)對Panx-1 與P2X7 相關(guān)信號通路表達等的影響及黃芩苷的干預(yù)作用，以期探明Panx-1 與P2X7 在黃芩苷抗副豬嗜血桿菌病血管內(nèi)皮屏障功能損傷的作用，為黃芩苷治療副豬嗜血桿菌引起的炎癥反應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞及細菌

副豬嗜血桿菌菌株為強毒型SH0165，血清型為5 型，細胞為豬髖血管主動脈細胞（PIVEC），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

1.2 試驗設(shè)計

采用細胞培養(yǎng)模型，選取P2X7 特異性抑制劑BBG（亮藍）為對照藥劑。①篩選BBG 最適濃度，抑制劑組試驗設(shè)空白對照組、GPS 造模組和4 個不同濃度抑制劑組（1、5、10、20 μmol/L BBG）；②為探尋Panx-1 和P2X7 調(diào)控副豬嗜血桿菌損傷血管內(nèi)皮細胞功能的分子機制以及黃芩苷的干預(yù)作用，試驗分為6 個組，即空白對照組、GPS 造模組、GPS+低劑量黃芩苷處理組（終濃度為25 μg/mL）、GPS+中劑量黃芩苷處理組（終濃度為50 μg/mL）、GPS+高劑量黃芩苷處理組（終濃度為100 μg/mL）、BBG 處理組（終濃度為10 μmol/L）。初始細胞約為106個/mL，感染復(fù)數(shù)MOI均為1∶1，細胞先加入藥物預(yù)處理2 h，再加入細菌共培養(yǎng)12 h。通過以上處理分析黃芩苷對GPS誘導(dǎo)PIVEC 后Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1基因以及細胞因子IL-1β、IL-18基因表達的變化，再分析黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后P2X7、NLRP3、IL-1β、IL-18 蛋白表達的變化。

1.3 細胞培養(yǎng)方法

提前準備好37 ℃水浴鍋，于液氮中取出細胞凍存管后快速置于水浴鍋中解凍。遵循無菌操作原則，吸取至EP 管中，1 200 r/min 離心7 min，棄掉上清液。取5 mL 10% RPMI1640 細胞完全培養(yǎng)基輕輕吹打重懸后轉(zhuǎn)移至25 mL 細胞培養(yǎng)瓶中，靜置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜或大于10 h 后換液。當顯微鏡下觀察到細胞在瓶底覆蓋率大于85%左右，無菌操作原則下，吸取并棄掉培養(yǎng)基，加入1～2 mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS），輕晃瓶身潤洗細胞。每瓶細胞加入1.5 mL 胰酶，輕晃瓶身，細胞培養(yǎng)箱中靜置30 s 后加入1 mL 培養(yǎng)基，無菌臺中吸取并棄掉胰酶培養(yǎng)基混合液。每瓶用10 mL 10% RPMI1640 細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞后分裝至2 個新的25 mL 細胞培養(yǎng)瓶中。

1.4 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

使用RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑，TAKARA 公司，批號為AKG0730A）充分裂解細胞。在每個樣品管中加入5∶1 的三氯甲烷。離心取上清液，加入等體積異丙醇。離心取沉淀即為RNA。利用Nanodrop 2000 型（Thermo Fisher Scientific 公司）核酸蛋白紫外分光光度儀測定RNA 濃度和純度，根據(jù)濃度測定值調(diào)平各樣品的RNA 濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)試劑盒說明書（HiScript 1ststrand cDNA Synthesis kit，諾唯贊生物科技股份有限公司，批號為027E2231EA）配制RNA 反轉(zhuǎn)體系，加入配置的溶液1 后，輕輕吹打混勻，42 ℃反應(yīng)2 min；加入溶液2 后，50 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)2 min，后4 ℃保溫；產(chǎn)物可立即使用或者分裝后保存于-80 ℃。

1.5 Q-RT PCR 分析

按TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物科技股份有限公司），批號為7E68212）試劑盒使用說明配制Mix，然在96 孔板上點樣，上機定量檢測。每個待測樣品都設(shè)置對應(yīng)的β-actin 作為內(nèi)參，基因表達的相對含量用2-△△Ct法分析計算。最終結(jié)果使用歸一化法，把GPS 造模組歸一，其他處理組與其進行比較。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Log Rank 檢驗，比較空白對照組與GPS 模型組之間的差異，藥物處理組（包括不同濃度抑制劑）與GPS 模型組之間的差異。βactin、Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA 引物序列采用引物設(shè)計軟件Primer 5 進行設(shè)計，并用NCBI 中Primer-BLAST 進行驗證。引物序列如表1 所示。

表1 用于Q-RT PCR 分析的引物序列

1.6 細胞蛋白質(zhì)提取

使用KGP2100 型凱基全蛋白質(zhì)提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），按照說明書和細胞量配置蛋白質(zhì)裂解液，淹沒并平鋪于細胞上，放置冰上10 min 充分裂解各組細胞，使用細胞刮刀同方向刮下貼壁細胞，待無明顯細胞印跡后，收集液體于預(yù)冷的1.5 mL EP 管中，4 ℃15 000 r/min 離心15 min，小心吸取上清液于新的預(yù)冷EP 管后渦旋離心；按照BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度［P0010 型BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（增強型），上海碧云天生物技術(shù)有限公司］，并將各組樣品蛋白質(zhì)濃度按照最低樣品濃度調(diào)整至統(tǒng)一濃度，按比例加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液（武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號為CR2202160），100 ℃金屬浴8～10 min，待冷卻至常溫后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Westernblot測定

將制膠模具裝配好，根據(jù)不同目的蛋白質(zhì)分子量選擇不同濃度的膠，制膠流程參考SDS-PAGE 彩色變性凝膠快速制備試劑盒說明書。每次向制膠器中加液時注意緩慢，切勿引入氣泡；為了保證蛋白質(zhì)條帶清晰，電泳條件設(shè)置為60 V 50 min；120 V 40 min；采用半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)印方法，轉(zhuǎn)印程序依據(jù)目的蛋白質(zhì)分子量大小設(shè)置；5%BSA 溶液搖床孵育條帶3 h；根據(jù)目的蛋白質(zhì)選擇不同的一抗，4 ℃冰箱內(nèi)搖床孵育過夜；次日TBST 搖床漂洗3 次，每次8 min。加入一抗對應(yīng)二抗，搖床孵育3 h；TBST 搖床漂洗3 遍，濾紙吸干后，浸泡顯色液后可顯色。使用Image J 軟件分析各條帶灰度值，得到蛋白質(zhì)相對表達量并進行歸一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 P2X7 抑制劑BBG 的最適濃度篩選

如圖1 所示，在GPS 的誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中P2X7基因的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），當抑制劑BBG 的終濃度分別為5、10、20 μmol/L 時，P2X7基因的表達極顯著下調(diào)（P＜0.01）；當抑制劑終濃度為1 μmol/L 時，與GPS 模型組相比，P2X7基因的表達顯著下調(diào)；為篩選黃芩苷最合適濃度下抑制劑達到最佳效果，故試驗后續(xù)選擇BBG濃度為10 μmol/L。

圖1 亮藍對GPS 誘導(dǎo)后豬血管內(nèi)皮細胞中P2X7 基因表達的影響

2.2 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后Panx-1、P2X7基因表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后Panx-1、P2X7基因表達的變化如圖2 所示。結(jié)果表明，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中Panx-1、P2X7基因的表達極顯著上調(diào)（P＜0.01），各梯度黃芩苷作用后，Panx-1、P2X7基因的表達極顯著下調(diào)（P＜0.01），且隨著黃芩苷濃度的增大，下調(diào)幅度增大。

圖2 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后Panx-1（a）、P2X7（b）基因表達的變化

2.3 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3、Caspase-1 基因表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3、Caspase-1基因表達的變化如圖3 所示。結(jié)果表明，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中NLRP3基因的表達極顯著上調(diào)（P＜0.01），而Caspase-1基因的表達顯著上調(diào)（P＜0.05），各濃度梯度黃芩苷作用后，NLRP3、Caspase-1基因的表達極顯著下調(diào)（P＜0.01），且隨著黃芩苷濃度的增大，下調(diào)幅度逐漸增大。

圖3 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3（a）、Caspase-1（b）基因表達的變化

2.4 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后細胞因子IL-1β、IL-18 基因表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后細胞因子IL-1β、IL-18基因表達的變化如圖4 所示。結(jié)果表明，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中IL-1β、IL-18基因的表達極顯著上調(diào)（P＜0.01），不同濃度黃芩苷作用后，IL-1β、IL-18基因的表達極顯著下調(diào)（P＜0.01）。隨著黃芩苷濃度的增大，2 個基因表達下調(diào)幅度增大。

圖4 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后IL-18（a）、IL-1β（b）基因表達的變化

2.5 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后P2X7 蛋白質(zhì)表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后P2X7 蛋白質(zhì)表達的變化如圖5 所示。結(jié)果表明，模型組與對照組相比，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中P2X7 蛋白質(zhì)的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明GPS 可以顯著激活P2X7 靶點；各藥物組與模型組相比，各濃度梯度黃芩苷及抑制劑BBG 作用后，P2X7 蛋白質(zhì)表達量極顯著下調(diào)（P＜0.01），說明黃芩苷對P2X7 靶點具有調(diào)控作用，可以抑制P2X7 靶點過度激活，從而抑制炎癥。黃芩苷組與BBG 組相比，BBG 組處理的P2X7蛋白質(zhì)表達量下調(diào)幅度最大，說明BBG 作為P2X7靶點特異性抑制劑，功能優(yōu)于黃芩苷。

圖5 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后P2X7 蛋白質(zhì)電泳圖譜（a）和表達量（b）的變化

2.6 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3 蛋白質(zhì)表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3 蛋白質(zhì)表達的變化如圖6 所示。結(jié)果表明，模型組與對照組相比，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中NLRP3 蛋白質(zhì)的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明下游NLRP3 炎癥小體被顯著激活；GPS+50 μg/mL 黃芩苷處理能極顯著下調(diào)NLRP3 蛋白質(zhì)的表達量（P＜0.01），GPS+100 μg/mL 黃芩苷和GPS+BBG 組抑制劑處理能顯著下調(diào)NLRP3 蛋白質(zhì)的表達量（P＜0.05），說明黃芩苷對NLRP3 炎癥小體具有調(diào)控作用，可以抑制NLRP3 炎癥小體過度激活，從而抑制炎癥。黃芩苷組與BBG 組相比，黃芩苷組對NLRP3 的抑制作用優(yōu)于BBG，表明黃芩苷可以通過其他途徑調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體，實行多途徑抗炎。

圖6 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后NLRP3 蛋白質(zhì)電泳圖譜（a）和表達量（b）的變化

2.7 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后IL-1β 蛋白質(zhì)表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后IL-1β 蛋白質(zhì)表達的變化如圖7 所示。結(jié)果表明，模型組與對照組相比，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中IL-1β 蛋白質(zhì)的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明GPS 誘導(dǎo)炎性因子大量釋放，引起炎癥反應(yīng)；各藥物組與模型組相比，GPS+50 μg/mL 黃芩苷、GPS+100 μg/mL 黃芩苷處理及GPS+BBG 組抑制劑處理能極顯著下調(diào)IL-1β 蛋白質(zhì)的表達量（P＜0.01），GPS+25 μg/mL 黃芩苷處理能顯著下調(diào)IL-1β 蛋白的表達量（P＜0.05），說明黃芩苷與BBG 可以抑制炎性因子釋放，從而抑制炎癥，表明了P2X7 靶點的關(guān)鍵作用。

圖7 黃芩苷對GPS誘導(dǎo)PIVEC后IL-1β蛋白質(zhì)表達的變化

2.8 黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后IL-18 蛋白質(zhì)表達的變化

黃芩苷對GPS 誘導(dǎo)PIVEC 后IL-18 蛋白質(zhì)表達的變化如圖8 所示。結(jié)果表明，模型組與對照組相比，在GPS 誘導(dǎo)下，豬血管內(nèi)皮細胞中IL-18 蛋白質(zhì)的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明GPS 誘導(dǎo)炎性因子大量釋放，引起炎癥反應(yīng)；各藥物組與模型組相比，GPS+100 μg/mL 黃芩苷處理及BBG 抑制劑處理能極顯著下調(diào)IL-18 蛋白質(zhì)的表達量（P＜0.01），GPS+25 μg/mL 黃芩苷、GPS+50 μg/mL 黃芩苷處理能顯著下調(diào)IL-18 蛋白質(zhì)的表達量（P＜0.05）。說明黃芩苷與BBG 可以抑制炎性因子釋放，從而抑制炎癥，表明了P2X7 靶點的關(guān)鍵作用。

圖8 黃芩苷對GPS誘導(dǎo)PIVEC 后IL-18蛋白質(zhì)表達的變化

3 討論

黃芩苷是從黃芩根中提取分離的黃酮類化合物，原產(chǎn)于中國、韓國、蒙古以及俄羅斯等地，具有很強的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等藥理功能，已成為研究熱點。Panx-1 作為大孔膜通道，對ATP 和其他信號分子具有高度滲透作用［8］，其重要作用已在多項研究中被證明。2021 年新型冠狀病毒感染在全球范圍內(nèi)迅速傳播，導(dǎo)致的大流行給世界人民帶來嚴重傷害。Luu 等［9］通過純化SARS-CoV-2 關(guān)鍵刺突蛋白質(zhì)誘導(dǎo)人肺上皮細胞，證明Panx-1 通道是SARS-CoV-2 感染的關(guān)鍵因素，應(yīng)被重視為治療的潛在靶點。選擇黃芩苷為天然藥物研究對象，進一步探明干預(yù)Panx-1、P2X7 信號通路對控制GPS 在血管內(nèi)皮細胞損傷的重要性，明確黃芩苷在該通路的調(diào)控作用，為進一步動物試驗提供可能。

4 小結(jié)

該研究結(jié)果表明，GPS 能夠激活Panx-1 通道和P2X7，黃芩苷可以通過抑制Panx-1 和P2X7 的激活從而減輕副豬嗜血桿菌病血管內(nèi)皮細胞的損傷。