正交試驗(yàn)法優(yōu)選蜜枇杷葉炮制工藝

胡 雨，麻雨樂(lè)，郭志俊，高 波

（華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷［Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.］的干燥葉，始載于《名醫(yī)別錄》，具有清肺止咳、降逆止嘔的作用，可用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等病癥［1］。熊果酸和總?cè)扑崾瞧渲饕目寡缀椭箍茸饔贸煞郑?］。枇杷葉主要有蜜炙、姜炙等炮制方法，臨床常用的炮制品為蜜枇杷葉，其采用蜜炙法進(jìn)行加工炮制［3］。枇杷葉蜜炙以后清肺止咳、降逆止嘔功能增強(qiáng)［4］?！吨腥A人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》描述的蜜枇杷葉炮制工藝缺少可控的工藝參數(shù)［1］，關(guān)于蜜枇杷葉炮制工藝研究的文獻(xiàn)較少［5，6］，且主要以熊果酸、齊墩果酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，缺少對(duì)蜜枇杷葉的浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究以齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)［7］，考察悶潤(rùn)時(shí)間、蜜水比、炒制溫度及炒制時(shí)間4 個(gè)因素，優(yōu)選蜜枇杷葉的加工炮制工藝，以期為蜜枇杷葉的擴(kuò)大生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀色譜系統(tǒng)，包括四元梯度輸液泵、色譜柱溫箱、二極管陣列紫外檢測(cè)器、Chromeleon 7 色譜管理系統(tǒng)；C18 色譜柱、超聲清洗儀、粉碎機(jī)等。

1.2 試劑

枇杷葉（批號(hào)：2009001）購(gòu)于亳州某飲片公司；齊墩果酸（批號(hào)：110709-201206，純度為94.9%）、熊果酸（批號(hào)：110742-201823，純度為99.9%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈飲料科技有限公司）。

試驗(yàn)所用枇杷葉飲片，經(jīng)鑒定為薔薇科植物枇杷的干燥葉［1］。

1.3 方法

1.3.1 齊墩果酸和熊果酸總量測(cè)定 色譜條件：C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為1.0 mL/min ，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)應(yīng)≥5 000（以熊果酸峰計(jì)算），色譜峰對(duì)稱性較好［1］。齊墩果酸對(duì)照品、熊果酸對(duì)照品的高效液相色譜見(jiàn)圖1。

圖1 蜜枇杷葉高效液相色譜

1.3.2 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備 取齊墩果酸對(duì)照品、熊果酸對(duì)照品適量，參照《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》枇杷葉藥材標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)對(duì)照品溶液、供試品溶液的方法制備［1］。

1.3.3 浸出物含量的測(cè)定 依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》四部通則“2201 浸出物測(cè)定法”測(cè)定［1］。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的測(cè)定 根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中關(guān)于“標(biāo)準(zhǔn)煎液”的制備制定蜜枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑試驗(yàn)方案。按照蜜枇杷葉的藥性及用藥部位（葉類）選擇煎煮參數(shù)，對(duì)加水量（倍數(shù)）的要求“煎煮開(kāi)始時(shí)的用水量一般以浸過(guò)藥面2～5 cm 為宜”進(jìn)行考察，確定了蜜枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑加水量及煎煮參數(shù)，藥性及飲片種類為一般類/葉類，飲片量為100 g，無(wú)前處理，浸泡30 min，煎煮次數(shù)2 次，一煎加水量為飲片重量的12 倍，一煎時(shí)間30 min，二煎加水量為飲片重量的10 倍，二煎時(shí)間25 min。

1.4 正交試驗(yàn)

1.4.1 蜜枇杷葉工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于蜜枇杷葉炮制工藝文獻(xiàn)［5，6］檢索及單因素試驗(yàn)考察，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，考察悶潤(rùn)時(shí)間（A）、蜜水比（B）、炒制溫度（C）、炒制時(shí)間（D）4 個(gè)因素，以齊墩果酸和熊果酸總量、醇溶性浸出物、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選蜜枇杷葉的炮制工藝。各因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素和水平

1.4.2 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 為了更客觀地評(píng)價(jià)蜜枇杷葉的質(zhì)量，以蜜枇杷葉齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用綜合評(píng)分法評(píng)定試驗(yàn)［8］。齊墩果酸和熊果酸總量是《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》規(guī)定的指標(biāo)性成分，所以其權(quán)重系數(shù)擬定為0.5；醇溶性浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率權(quán)重系數(shù)分別為0.3 及0.2。浸出物評(píng)分=（浸出物的評(píng)分/9 個(gè)樣品中最高浸出物的評(píng)分）×30；齊墩果酸和熊果酸總量的加權(quán)評(píng)分=（齊墩果酸和熊果酸總量/ 9 個(gè)樣品中齊墩果酸和熊果酸總量的最高含量）×50；出膏率含量的加權(quán)評(píng)分=（出膏率含量/9 個(gè)樣品中出膏率的最高含量）×20。綜合評(píng)分=浸出物加權(quán)評(píng)分+齊墩果酸和熊果酸總量的加權(quán)評(píng)分+出膏率的加權(quán)評(píng)分。

1.4.3 不同工藝蜜枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取正交試驗(yàn)各工藝組合蜜枇杷葉樣品約100 g，置于圓底燒瓶中，加入12 倍量水浸泡30 min，加熱回流30 min，濾過(guò)；藥渣再加10 倍量水，加熱回流25 min，濾過(guò)，合并兩次濾液，稱定濾液重量［9］。

1.4.4 出膏率測(cè)定 取合并水煎液50 g，精密稱定，放于已恒定重量的蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上蒸干，放在105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，稱重，計(jì)算水煎液含固量，并根據(jù)水煎液總重量和飲片重量換算出膏率。

出膏率=固體重（g）×水煎液總重量（g）/［取樣量（g）×飲片重量（g）］×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試蜜枇杷葉的高效液相色譜

由圖2 可知，供試蜜枇杷葉的高效液相色譜中，齊墩果酸和熊果酸的出峰時(shí)間分別為21.133、22.120 min，與對(duì)照樣品的出峰時(shí)間相近，說(shuō)明蜜枇杷葉中含有齊墩果酸和熊果酸。

圖2 供試蜜枇杷葉的高效液相色譜

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

蜜枇杷葉炮制工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［10，11］及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由直觀分析可知，各因素對(duì)蜜枇杷葉炮制工藝的影響大小順序?yàn)镃＞A＞B＞D。方差分析結(jié)果表明，炒制溫度（C）對(duì)炮制工藝有顯著影響。A、B、D因素對(duì)蜜枇杷葉炮制工藝無(wú)顯著影響。因此，從直觀和方差分析結(jié)果并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整得到，蜜枇杷葉的最佳炮制工藝為A2B1C2D1，即取凈枇杷葉300 g，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌勻，悶潤(rùn)1.0 h，置于140 ℃的炒藥機(jī)中炒制15 min，取出，晾涼篩去碎屑，即可。

表2 蜜枇杷葉炮制工藝的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

取枇杷葉絲500 g，按優(yōu)選的蜜炙工藝制備蜜枇杷葉樣品3 份，測(cè)定其齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率［12］，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，采用該優(yōu)選工藝蜜枇杷葉齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均較穩(wěn)定，表明該蜜炙工藝較穩(wěn)定、可控。即蜜枇杷葉的最佳工藝為取干凈枇杷葉絲，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌勻，悶潤(rùn)1.0 h，置于140 ℃的炒藥機(jī)中炒制15 min，取出，晾涼篩去碎屑，即可。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

李煥平［5］優(yōu)選的蜜枇杷葉工藝為取枇杷葉，加入40%煉蜜，悶潤(rùn)0.5 h，炒制溫度（150±5）℃，炒制時(shí)間10 min。李文兵等［6］優(yōu)選的工藝為取煉蜜，按1∶1的比例加入沸水稀釋，加入枇杷葉絲悶潤(rùn)1.0 h，220 ℃炒制15 min 即可。這兩種優(yōu)選的工藝各不相同，本研究以齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率綜合指標(biāo)代替單一指標(biāo)來(lái)考察和優(yōu)選蜜枇杷葉的炮制工藝，結(jié)果更科學(xué)和客觀。

該試驗(yàn)以浸出物、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及齊墩果酸和熊果酸總量為綜合優(yōu)選評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出的蜜枇杷葉炮制工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，可在一定程度上為蜜枇杷葉的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。此外，僅從浸出物、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率和指標(biāo)性成分角度來(lái)優(yōu)選蜜枇杷葉的工藝尚且不足，還應(yīng)結(jié)合藥理藥效優(yōu)選蜜枇杷葉工藝［13］。