青海藜麥總黃酮及多酚共提工藝及其抗氧化活性

楊 敏，周 蕊，奚軍偉

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，西安 712046；2.陜西省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，西安 710000）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）為雙子葉草本植物，屬藜科［1］，具有悠久的栽培歷史。藜麥對(duì)鹽堿、干旱、霜凍、病蟲(chóng)害等生物、非生物脅迫具有良好的適應(yīng)性，被許多國(guó)家推廣種植［2］。中國(guó)藜麥種植仍處于初始階段，主要分布于青海省、甘肅省和山西省等地，面積約1 萬(wàn)hm2。藜麥具有較高的綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值和多種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能夠同時(shí)滿足各類人體所需的8 種基本必需營(yíng)養(yǎng)元素，被稱作是全高營(yíng)養(yǎng)作物，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸、纖維素等微量元素，其含量均高于其他糧食作物［3］。藜麥種子不僅具有大量的營(yíng)養(yǎng)，還富含多酚、皂甙、黃酮等生物活性成分，并具有強(qiáng)抗氧化能力，在抗氧化、降血脂、增強(qiáng)免疫力等生理上起重要作用，作為功能性食品食用能夠降低慢性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［4］。

本研究以青海格爾木藜麥為原料，采用超聲波輔助法（超聲功率為120 W），通過(guò)滿意度-響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究其抗氧化活性，為藜麥資源的利用和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與藥劑

藥材：青海藜麥。

藥劑：蒸餾水；無(wú)水乙醇；5% NaNO2溶液；10%Al（NO3）3溶液；4% NaOH 溶液；磷鉬鎢酸試劑；5%碳酸鈉溶液；蘆丁對(duì)照品；沒(méi)食子酸對(duì)照品；維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品；抗氧化試劑盒（總抗氧化、羥自由基清除能力，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)儀器

AUW120 型電子天平，艾德姆衡器有限公司；DP-360 型超聲波提取器，北京亞歐德鵬科技有限公司；KDC-40 型低速離心機(jī)，江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司；RE-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上?？怖x器設(shè)備有限公司；TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥總黃酮及多酚的共提工藝 粉碎、稱量→加入適量乙醇溶液→超聲提取→過(guò)濾→回收濾液→測(cè)定（總黃酮及多酚）。

1.3.2 藜麥總黃酮及多酚的含量測(cè)定

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［5］。稱取蘆丁對(duì)照品50 mg，定容至25 mL 容量瓶，再精密量取10 mL，置于100 mL容量瓶中，定容，得到l mL中含蘆丁0.2 mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取1、2、3、4、5、6 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL 容量瓶中定容，得到不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，向蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入適量的NaNO2溶液、Al（NO3）3溶液、NaOH 溶液，放置15 min，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm 處進(jìn)行吸光值測(cè)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6］。稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品50 mg，定容至100 mL 容量瓶中，再精密量取5 mL，置于50 mL 容量瓶中，定容，得到1.00 mL 中含沒(méi)食子酸0.05 mg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在6 個(gè)10 mL 容量瓶中吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 溶液并定容，即得到不同梯度濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，向不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入適量的磷鉬鎢酸試劑、5%碳酸鈉溶液，放置一定時(shí)間，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)760 nm 處進(jìn)行吸光度測(cè)量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

1.3.3 提取率計(jì)算及滿意度評(píng)價(jià) 根據(jù)“1.3.2”的方法對(duì)藜麥總黃酮及多酚含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其提取率。

利用復(fù)合滿意度函數(shù)［7］將多響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為綜合單響應(yīng)值，計(jì)算式如下。

式中，ωi為第i個(gè)響應(yīng)滿意度函數(shù)的權(quán)重，i=1，2，3，…，n，ω1、ω2分別為總黃酮和多酚的權(quán)重，ω1=0.6，ω2=0.4，∑ωi為各響應(yīng)值占權(quán)重的總和，x為考察對(duì)象，y為x所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 將藜麥料液比設(shè)為1∶10（g∶mL，下同），超聲提取溫度設(shè)置為50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，將超聲提取時(shí)間因素設(shè)定為5 個(gè)水平，分別為10、20、30、40、50 min，考察不同超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮及多酚提取率的影響；將藜麥料液比設(shè)置為1∶10，超聲提取時(shí)間設(shè)為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，將超聲提取溫度因素設(shè)定為30、40、50、60、70 ℃，研究超聲提取溫度變化對(duì)藜麥總黃酮和多酚提取率的影響；在超聲提取50 ℃、30 min、30%乙醇溶液條件下進(jìn)行提取，選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，觀察不同料液比對(duì)2 種物質(zhì)提取率的影響；將藜麥料液比設(shè)定為1∶30，超聲提取溫度設(shè)定為50 ℃，超聲提取時(shí)間為30 min，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮及多酚提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)4 因素3 水平試驗(yàn)方案，對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行滿意度評(píng)價(jià)，以滿意度為試驗(yàn)方案的響應(yīng)值。

1.3.6 藜麥總黃酮及多酚提取物抗氧化活性測(cè)定 依據(jù)“1.3.1”的工藝進(jìn)行提取，將藜麥總黃酮及多酚提取物配制成不同濃度溶液，以維生素C 為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)抗氧化試劑盒測(cè)定樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力［8，9］。計(jì)算樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力，計(jì)算式如下。

式中，V反總為反應(yīng)總體積，1.02 mL；V樣為反應(yīng)中樣品體積，0.03 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 如圖3所示，當(dāng)超聲提取時(shí)間為10、20、30 min時(shí)，藜麥總黃酮及多酚提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，在超聲提取時(shí)間為30 min 時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)超聲提取時(shí)間大于30 min 時(shí)，藜麥總黃酮及多酚類物質(zhì)的含量均未見(jiàn)明顯提高，故可將超聲提取時(shí)間考察中心點(diǎn)選擇為30 min。

2.1.2 超聲提取溫度對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 如圖4 所示，當(dāng)超聲提取溫度上升至50 ℃的過(guò)程中，藜麥總黃酮及多酚提取率與提取溫度成正比，隨著提取溫度繼續(xù)上升，藜麥總黃酮及多酚提取率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。綜上分析，可將超聲提取溫度考察中心點(diǎn)選擇為50 ℃。

2.1.3 料液比對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 由5可知，當(dāng)料液比在1∶10、1∶20、1∶30 時(shí)，藜麥總黃酮及多酚提取率均隨著料液比增大出現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比在1∶40、1∶50 時(shí)，藜麥中總黃酮及多酚的提取率隨料液比的增大而下降，故可將1∶30 作為料液比的考察中心點(diǎn)。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 由圖6 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%以內(nèi)時(shí)，藜麥總黃酮及多酚的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%時(shí)，藜麥總黃酮及多酚的提取率呈下降趨勢(shì)，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察中心點(diǎn)為30%。

圖6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法對(duì)藜麥總黃酮及多酚提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)Design-Expert 8. 0. 6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)置5 個(gè)中心點(diǎn)，共29 組試驗(yàn)（表1、表2）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸方程為Y= 0.55 - 0.11A+0.045B-0.021C- 0.12D- 0.17AB+0.079AC+ 0.17AD+ 0.095BC+ 0.067BD- 0.045CD-0.11A2+0.13B2+0.056C2+0.080D2。方差分析（表3）中，模型的P＜0.000 1，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明模型擬合程度高、可信度高［10］。確定系數(shù)R2為0.951 4，調(diào)整系數(shù)為0.902 8，二者相差較小，說(shuō)明試驗(yàn)精確度較高［11］。從F可以得到4 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，即提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

表1 試驗(yàn)因素和水平

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 各因素交互作用分析 各因素交互作用通過(guò)二者等高線及三維曲面（圖7）進(jìn)行分析。從等高線的橢圓程度和三維圖曲面的陡峭程度分析，料液比與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度，提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度，各因素之間交互作用顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度之間交互作用不明顯。料液比的最佳取值范圍為1∶25～1∶35，提取時(shí)間的最佳范圍為30～40 min，最佳提取溫度在40～50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)的最佳取值范圍為30%～40%。試驗(yàn)通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件得到藜麥總黃酮及多酚提取的最佳共提工藝為料液比1.00∶26.25，提取時(shí)間35.64 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)37.95%，提取溫度41.09 ℃，滿意度為0.948 2%。根據(jù)實(shí)際可操作性，將工藝調(diào)整為料液比1∶25，提取時(shí)間35 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度40 ℃，此條件下藜麥總黃酮的提取率為10.075%，多酚的提取率為2.033%，滿意度為0.936 2%，滿意度與預(yù)測(cè)滿意度值僅差0.012 個(gè)百分點(diǎn)，表明工藝準(zhǔn)確可行，模型精確度高。

圖7 各因素的等高線及三維曲面

2.2.3 藜麥總黃酮及多酚提取物抗氧化活性測(cè)定結(jié)果 通過(guò)試劑盒測(cè)定藜麥總黃酮及多酚提取物的羥自由基清除率和總抗氧化活性，從結(jié)果（圖8）可知，隨著提取物濃度的增大，提取物的羥自由基清除率和總抗氧化活性逐漸增大，藜麥總黃酮及多酚提取物濃度在1.2 mg/mL 時(shí)，其羥自由基清除率為89.32%，總抗氧化能力為88.8 U/mL，與同濃度維生素C 對(duì)照品的抗氧化活性差距不大。

圖8 藜麥總黃酮及多酚提取物的羥自由基清除率（a）和總抗氧化活性（b）

3 小結(jié)與討論

以兩種指標(biāo)優(yōu)化青海藜麥的提取工藝，以滿意度為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，選用超聲波輔助法（超聲功率為120 W）提取藜麥中的總黃酮及多酚類化合物，最佳工藝為料液比1∶25（g∶mL），提取時(shí)間35 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度40 ℃，此條件下藜麥總黃酮的提取率為10.075%，多酚的提取率為2.033%，滿意度為0.936 2%?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，藜麥總黃酮及多酚提取物具有明顯的抗氧化活性。

藜麥總黃酮和多酚為其主要活性成分，具有抗氧化［12］、抗癌、降糖［13］等藥理作用，對(duì)這兩種物質(zhì)的共提工藝研究較少，試驗(yàn)通過(guò)滿意度函數(shù)評(píng)價(jià)其提取工藝，結(jié)果精確度高、易于操作且成本低廉，為青海藜麥總黃酮及多酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論支持。