浙貝母灰霉病病原菌的生物學(xué)特性及田間生物農(nóng)藥篩選

何曉嬋, 周小軍, 龍安琪, 謝海鵬, 李玲, 朱浩, 朱麗燕*

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 浙江 金華 321000; 2.浙江農(nóng)林大學(xué), 浙江 杭州 311300)

浙貝母為百合科植物, 是浙江地道藥材 “浙八味” 之一, 在國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)[1]。浙貝母的栽培歷史至今已有300 多年, 最早記載于東漢 《神農(nóng)本草經(jīng)》。目前主要種植在浙江、湖南、江蘇和安徽一帶[2], 其中浙江產(chǎn)區(qū)主要以鄞州、磐安、東陽(yáng)為主,種植面積和產(chǎn)量占全國(guó)的90%左右, 常年種植面積約20 hm2, 年產(chǎn)商品產(chǎn)量約9 000 t[3]。

然而, 隨著浙貝母的種植栽培面積不斷增大,浙貝母的病害問(wèn)題也日漸突出。浙貝母主要病害有灰霉病、黑斑病、炭疽病、干腐病等, 其中以灰霉病最為嚴(yán)重[4-5]。每年浙貝母灰霉病發(fā)病率都能達(dá)到82%以上[6], 對(duì)農(nóng)戶造成近30%的效益損失。浙貝母灰霉病也叫 “眼圈病” “早枯病” 等[7],2017—2022 年浙江省磐安縣浙貝母灰霉病危害最為嚴(yán)重, 藥農(nóng)對(duì)于浙貝母灰霉病普遍稱為 “難治之癥”。莖稈感染灰霉病后, 首先出現(xiàn)水浸狀斑塊, 表面逐漸褐變濕腐, 病情隨著濕度增大加重,開(kāi)始出現(xiàn)灰色霉層, 天氣干燥時(shí)病莖呈現(xiàn)干腐狀態(tài)[3]。李吉二等[8]利用分子生物學(xué)技術(shù)將該病病原菌鑒定為灰葡萄孢菌 (Botrytiscinerea), 而非被認(rèn)為的橢圓葡萄孢 [Botrytiselliptica( Berk.)Cooke]。李云山等[9]于1984 年對(duì)浙貝母灰霉病病原菌橢圓葡萄孢的生物學(xué)特性進(jìn)行了探索, 分析了分生孢子形成與萌發(fā)、菌核萌發(fā)的最適溫度。但截至目前, 尚未見(jiàn)灰葡萄孢菌的生物學(xué)特性研究。劉玉紅等[5]調(diào)研發(fā)現(xiàn), 浙貝母種植戶用于防治灰霉病的農(nóng)藥種類繁多, 嘧霉胺、百菌清、腐霉利、異菌脲、多菌靈及代森錳鋅等農(nóng)藥最為常見(jiàn)。朱麗燕建議, 在灰霉病未發(fā)生前或發(fā)生初期, 用嘧霉胺懸浮劑防治貝母灰霉病, 3 次藥后14 d 防治效果可達(dá)82.9%。鄧曹仁等[6]研究表明, 氟菌·肟菌酯、唑醚·氟酰胺這兩種殺菌劑對(duì)浙貝母灰霉病有較好的防治效果。蔡嘉慧首次報(bào)道了芽孢桿菌對(duì)浙貝母灰霉病有抑制作用。浙貝母能清熱散結(jié), 化痰止咳, 是一味中藥材, 盲目和過(guò)度使用農(nóng)藥可能會(huì)造成產(chǎn)品藥物殘留過(guò)高, 從而對(duì)浙貝母的質(zhì)量安全造成隱患[7,11]?；诖? 本研究從不同溫度、pH 值、光照條件、碳氮源4 個(gè)方面, 探究不同條件下該病原菌的生物學(xué)特性, 并在浙貝母主產(chǎn)區(qū)開(kāi)展浙貝母灰霉病生物農(nóng)藥的篩選, 為日后浙貝母灰霉病病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌的分離純化

2020 年5 月在浙江省金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院基地采集浙貝母發(fā)病植株, 裝入樣品收集袋帶回實(shí)驗(yàn)室, 采用組織分離法進(jìn)行分離及純化獲得菌株[12]。

1.2 病原菌的生物學(xué)特性

1.2.1 不同光照對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)共設(shè)完全光照 (光照 ∶ 黑暗= 24 h ∶0 h)、光暗交替 (光照∶黑暗=12 h ∶12 h) 和完全黑暗 (光照∶黑暗= 0 h ∶24 h) 3 個(gè)處理。將5 mm 菌絲塊接至PDA 培養(yǎng)基上, 每個(gè)處理4 皿,分別置于不同光照條件下培養(yǎng)4 d, 用十字交叉法測(cè)定菌落直徑后, 采用 Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 不同溫度對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將直徑5 mm 的供試菌株菌絲塊接種至PDA平板上, 分別放置在溫度為7、22、25、28、30 和33 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每個(gè)處理4 皿。用十字交叉法測(cè)定菌落直徑, 采用 Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 不同pH 對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將做好的PDA 分裝到10 個(gè)三角瓶中, 每瓶150 mL, 高溫高壓滅菌晾涼后, 后用HCl 和NaOH將其pH 值分別調(diào)成4、5、6、7、8、9、10、11,將直徑為5 mm 的菌絲塊接入到上述培養(yǎng)基中, 置于22 ℃下培養(yǎng), 每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù), 用十字交叉法測(cè)定菌落直徑后, 采用Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 不同碳氮源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek, 不同碳源以相當(dāng)于1 L Czapek 培養(yǎng)基中30 g 蔗糖含碳量取代其中的蔗糖而試驗(yàn), 以麥芽糖、葡萄糖、纖維素、木糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉作為碳源替換基本培養(yǎng)基中的蔗糖。不同氮源分別以尿素、硫酸銨、硝酸鈉、牛肉浸膏、甘氨酸、脯氨酸、氯化銨、胰蛋白胨為氮源。將直徑為5 mm 的菌絲塊接入到用以上培養(yǎng)基制作的平板中, 置于22 ℃下培養(yǎng), 每個(gè)處理4個(gè)重復(fù), 用十字交叉法測(cè)定菌落直徑后, 采用Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 田間藥劑防治試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置7 個(gè)處理, 3 次重復(fù), 共21 個(gè)小區(qū),每個(gè)小區(qū)面積20 m2, 采用隨機(jī)區(qū)組排列。處理如下: (1) 16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍液 (興農(nóng)藥業(yè) (中國(guó)) 有限公司); (2) 20%丁子香酚水乳劑1 500 倍 (江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司);(3) 哈茨木霉菌3 億CFU·g-1可濕性粉劑300 倍(美國(guó)拜沃股份有限公司); (4) 1%蛇床子素水乳劑750 倍 (內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司);(5) 1 000 億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑750 倍 (武漢科諾生物科技股份有限公司);(6) 500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍 (美國(guó)富美實(shí)公司); (7) 清水對(duì)照。

試驗(yàn)在浙江省磐安縣冷水鎮(zhèn)進(jìn)行, 試驗(yàn)品種為浙貝1 號(hào), 本試驗(yàn)共計(jì)施藥3 次, 分別在2021 年3月10 日、2021 年3 月17 日、2021 年3 月25 日施藥。采用美豐農(nóng)化背負(fù)式WS-16 型手動(dòng)壓縮噴霧器。每667 m2用水量50 L。噴藥時(shí)以葉片正反面充分著藥又不滴液為準(zhǔn), 全株均勻噴霧。

1.3.2 調(diào)查與統(tǒng)計(jì)

于施藥期間目測(cè)觀察施藥后貝母的安全性。藥前對(duì)未發(fā)病的植株進(jìn)行定點(diǎn), 于末次施藥后20 d對(duì)每個(gè)小區(qū)定點(diǎn)植株進(jìn)行藥效調(diào)查, 采用分級(jí)計(jì)數(shù)法, 調(diào)查全部葉片, 以每一葉片上病斑面積占整個(gè)葉面積的百分率分級(jí)。

葉片分級(jí)方法: 0 級(jí): 無(wú)病; 1 級(jí): 病斑較少,占葉面積5%以下; 3 級(jí): 病斑較多, 占葉面積5%～30%; 5 級(jí): 病斑較多, 占葉面積31%～50%;7 級(jí): 病斑較多, 占葉面積50%以上; 9 級(jí): 全葉枯死。

計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。防治效果為空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)與處理區(qū)病情指數(shù)之差除以空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)再乘以100。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007 和SPSS 25.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并采用LSD 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株的采集及病原菌的分離

在自然發(fā)病的浙貝母植株上, 發(fā)病部位主要出現(xiàn)在浙貝母葉片和莖上, 發(fā)病部位有褐色病斑, 葉片有腐爛狀且附有白色霉層; 莖部嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)腐爛狀, 發(fā)病后期可見(jiàn)整株植株枯死。

發(fā)病初期, 葉片上首先出現(xiàn)淡褐色病斑, 呈水漬狀, 后逐漸擴(kuò)大成橢圓形或不規(guī)則的黃褐色病斑, 葉片邊緣極易感病 (圖1 中A)。隨著病情的發(fā)展, 灰色病斑不斷擴(kuò)大, 病株葉片發(fā)黃且變黑,整個(gè)葉片腐爛。濕度增大后, 病葉正反面均滋生灰色霉層 (圖1 中B)。最后, 整個(gè)植株倒伏并枯死(圖1 中C)。一般田塊發(fā)病率在20%, 嚴(yán)重田塊發(fā)病率達(dá)70%。

2.2 不同光照時(shí)間對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

為探索光照對(duì)浙貝母灰霉病病原菌生長(zhǎng)的影響, 筆者測(cè)定了該病原菌在不同光照時(shí)間下的生長(zhǎng)直徑。在12 h ∶12 h、0 h ∶24 h、24 h ∶0 h 下菌落生長(zhǎng)直徑分別為7.90、8.07、5.50 cm (表1)。在0 h ∶24 h 與12 h ∶12 h 條件下, 病原菌菌落直徑生長(zhǎng)差異不顯著 (P<0.05), 光照條件下, 病原菌菌落受到顯著抑制, 菌絲稀疏且菌落生長(zhǎng)直徑慢(圖2)。結(jié)果表明, 適合浙貝母灰霉病病原菌的光照條件為全黑暗或光照∶黑暗=12 h ∶12 h。

圖2 不同光照對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 不同溫度對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

為了探索不同溫度對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響, 筆者對(duì)病原菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察。病菌菌絲在7～28 ℃條件下均能生長(zhǎng), 超過(guò)28 ℃生長(zhǎng)非常緩慢 (圖3)。在7、22、25、28 ℃溫度下培養(yǎng)5 d 后菌落直徑分別為1.83、3.93、2.68、0.83 cm。隨著溫度的升高, 病原菌菌絲生長(zhǎng)速度加快, 22 ℃最利于菌絲生長(zhǎng), 其菌落平均直徑為3.93 cm, 極顯著高于其他溫度下的菌落直徑 (P<0.01) (表2)。結(jié)果表明, 22 ℃最利于菌絲生長(zhǎng)。

表2 不同溫度對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖3 不同溫度對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同pH 值對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

為了探索不同pH 值對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響, 筆者對(duì)病原菌在不同pH 值下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察。病原菌在pH 值 4～11 均能生長(zhǎng), 如表3 所示, 在同樣的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi), pH 值為4～11 時(shí)菌落生長(zhǎng)直徑分別為1.80、2.27、4.15、5.10、5.18、4.98、4.48、1.07 cm。其中, 當(dāng)pH為7～9 時(shí), 菌絲濃厚且菌落直徑最大, 菌落生長(zhǎng)直徑顯著高于其他處理 (圖4)。

表3 不同pH 對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖4 不同pH 值對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 不同碳氮源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

為了探索不同碳、氮源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響, 筆者對(duì)病原菌在不同碳、氮源下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察 (圖5、6)。從表4 可以看出, 在供試碳源中, 葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖作為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基較適合病原菌菌絲的生長(zhǎng), 菌落生長(zhǎng)直徑分別為5.18、5.10、4.93 cm。而在以尿素為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基最不適合菌絲生長(zhǎng), 以硫酸銨、牛肉浸膏、脯氨酸、氯化銨、硝酸鈉和胰蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基最適合病菌菌絲生長(zhǎng), 菌落 生 長(zhǎng) 直 徑 分 別 為 5.40、5.40、5.40、5.10、4.73、5.40 cm, 顯著高于以甘氨酸、尿素為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (表5)。

表4 不同碳源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表5 不同氮源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖5 不同碳源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖6 不同氮源對(duì)浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.6 田間藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可以看出, 各藥劑處理區(qū)產(chǎn)量均顯著優(yōu)于空白對(duì)照處理; 化學(xué)藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理產(chǎn)量較高, 顯著優(yōu)于其他生物農(nóng)藥處理及空白對(duì)照處理, 但與生物農(nóng)藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理產(chǎn)量無(wú)極顯著差異。

表6 試驗(yàn)測(cè)產(chǎn)結(jié)果

由表7 可以看出, 4 次藥后14 d 化學(xué)藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍防治浙貝母灰霉病效果最好, 防治效果達(dá)74.0%, 生物農(nóng)藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理防治效果次之, 防治效果為60.0%, 極顯著低于化學(xué)藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理, 與20%丁子香酚水乳劑1 500 倍防治效果無(wú)顯著性差異; 生物農(nóng)藥哈茨木霉菌3 億CFU·g-1可濕性粉劑300 倍、1%蛇床子素水乳劑750 倍、1 000 億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑750 倍處理防治效果顯著低于生物農(nóng)藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍、20%丁子香酚水乳劑1 500 倍處理。

表7 不同生物農(nóng)藥防治浙貝母灰霉病田間試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

筆者發(fā)現(xiàn), 灰霉病病原菌生長(zhǎng)受環(huán)境條件影響較大, 病原菌不宜受光照, 與白曉的報(bào)道一致, 在連續(xù)黑暗的條件下適宜菌絲生長(zhǎng)。其最適溫度在22 ℃, 與陳長(zhǎng)卿等[14]的報(bào)道一致, 15～25 ℃適宜菌絲生長(zhǎng)。最適合菌絲生長(zhǎng)的pH 值在7～9。而從病原菌的碳氮源中發(fā)現(xiàn), 最適宜菌絲生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖, 氮源為硫酸銨、脯氨酸、氯化銨、硝酸鈉和胰蛋白胨, 以尿素為氮源的培養(yǎng)基最不適合菌絲生長(zhǎng), 與岳海梅等[15]的報(bào)道碳源為葡萄糖或果糖, 氮源為蛋白胨適宜菌絲生長(zhǎng)一致。

浙貝母灰霉病通常在3 月開(kāi)始發(fā)病, 4 月上旬至4 月下旬為發(fā)病高峰期[2], 與測(cè)得的生長(zhǎng)條件一致, 通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以更好地確定防治適期, 進(jìn)一步有效抑制其生長(zhǎng)。通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 供試的6 種藥劑對(duì)浙貝母灰霉病均有一定的防治效果?；瘜W(xué)藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理產(chǎn)量最高, 防治效果最好, 顯著優(yōu)于其他生物農(nóng)藥處理。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出, 各生物農(nóng)藥對(duì)浙貝母灰霉病均有一定防治效果, 但防治效果有限, 16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理、20%丁子香酚水乳劑1 500 倍防治效果分別為60.0%、57.8%, 顯著低于化學(xué)藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理,但顯著優(yōu)于其他生物農(nóng)藥。因此, 16%多抗霉素可溶粒劑、20%丁子香酚水乳劑可作為防治浙貝母灰霉病的備選生物農(nóng)藥。