慢性乙型肝炎患者血清病毒載量與炎癥因子、T 淋巴細胞亞群及肝臟酶的關系

陳自喜 李錦澎 鄭 瑾 相芬芬 康向東 吳 蓉

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院檢驗科，上海 200062

慢性乙型肝炎是常見的感染性疾病，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在體內(nèi)長期持續(xù)復制導致疾病慢性化，從而嚴重危害患者的健康[1-2]。免疫反應介導細胞因子活化、增殖在HBV DNA 長期復制中發(fā)揮重要作用[3]。機體T 淋巴細胞亞群失衡，免疫功能發(fā)生紊亂，不能及時有效地識別、清除入侵的HBV 可導致疾病的長期化、慢性化[4-6]。目前臨床有效診斷肝細胞損傷的金標準主要借助肝臟酶等，通過對肝臟酶檢測及時有效地評估肝細胞損傷程度并改善乙型肝炎患者的治療及預后。本研究通過檢測慢性乙型肝炎患者血清HBV 載量、炎癥因子、外周血T 淋巴細胞亞群、肝臟酶的表達，進一步探究機體感染HBV 后患者血清病毒載量與機體免疫功能變化關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年3 月至2022 年8 月上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的經(jīng)臨床確診為慢性乙型肝炎的患者85 例。根據(jù)HBV 載量，將其分為HBVDNA 陰性組（HBVDNA＜103IU/ml）（29例），HBV DNA 低載量組（HBV DNA 103～105IU/ml）（28 例）和HBV DNA 高載量組（HBV DNA＞105IU/ml）（28例）。納入標準：經(jīng)臨床診斷為慢性乙型肝炎患者。排除標準：患有自身免疫系統(tǒng)性疾病、代謝性疾病、急性藥物肝損傷。本研究通過我院倫理委員會批準（PTEC-A-2021-28-1）。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR 擴增儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司（SLAN-96P）；HBV DNA 檢測試劑盒（22028-2）購自湖南圣湘生物醫(yī)學科技有限公司。具體操作流程按試劑說明書進行，正常的HBV DNA 病毒載量參考范圍＜1 000 IU/ml。淋巴細胞亞群檢測抗體（89173）和BD Trucount 絕對計數(shù)管（2236937）購自美國BD 公司上海有限公司。流式細胞儀購自美國BD 公司上海有限公司（BD FACSCanto2）。白細胞介素（interleukin，IL）-6（C22050118）、IL-8（C22010111）、IL-10（C22010118）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）（C22010119）試劑均購自熱景（廊坊）生物技術有限公司，細胞因子測定儀器為熱景C2000。應用BECKMAN COULTER 全自動生化儀（AU5831）檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（AUZ 0960）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）（AUZ0157），具體操作流程按說明書進行。

1.3 檢測方法

1.3.1 HBV DNA 載量 所有研究對象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，室溫靜止后，于4℃，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min。反應體系：標本+49 μl PCR 擴增液+1 μl 反應酶；反應條件：50℃UNG 酶反應2 min,95℃Taq 酶活化2 min，95℃變性15 s，58℃退火延伸30 s，共45 個循環(huán)。

1.3.2 外周血淋巴細胞亞群細胞數(shù) 所有研究對象于清晨空腹抽取5 ml 外周靜脈血，吸取50 μl 全血，加入絕對計數(shù)管中，并加入20 μl 熒光素標記的鼠抗人單克隆抗體CD45/CD3/CD4/CD8 混勻，室溫避光20 min，加入450 μl 1×BD 溶血素混勻，于1 h 內(nèi)采用流式細胞儀檢測。

1.3.3 血清中炎癥因子和GPT、GOT 水平 所有研究對象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，室溫靜止后，于4℃，轉(zhuǎn)速500 r/min，離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min，按照試劑盒說明書操作，檢測血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF 表達，另采用全自動生化儀酶學法檢測GPT、GOT 水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。采用Pearson 相關數(shù)分析相關性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較

HBV DNA 陰性組男16 例，女13 例；年齡50～62歲，平均（56.59±2.70）歲；HBV DNA 低載量組男19 例，女9 例；年齡41～74 歲，平均（56.43±10.66）歲；HBV DNA 高載量組男22 例，女6 例；年齡43～74歲，平均（59.62±9.38）歲。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 三組炎癥因子水平比較

HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF水平高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見表1。

表1 三組炎癥因子水平比較（pg/ml，）

表1 三組炎癥因子水平比較（pg/ml，）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子。

2.3 三組T 淋巴細胞亞群比較

HBV DNA 低、高載量組CD4+百分率、CD4+絕對計數(shù)、CD3+絕對計數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 陰性組，CD8+百分率及其絕對計數(shù)高于HBV DNA 陰性組（P＜0.05）。HBV DNA 高載量組CD4+百分率、CD3+絕對計數(shù)、CD4+絕對計數(shù)、CD8+絕對計數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 低載量組，CD8+百分率高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組T 淋巴細胞亞群比較（）

表2 三組T 淋巴細胞亞群比較（）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒。

2.4 三組血清肝臟酶水平比較

HBV DNA 低、高載量組的GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組血清肝臟酶水平比較（U/L，）

表3 三組血清肝臟酶水平比較（U/L，）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶。

2.5 慢性乙型肝炎患者血清炎癥因子和肝臟酶指標的相關性分析

慢性乙型肝炎患者血清IL-6、IL-10、TNF 水平與GPT 水平呈正相關（r=0.63、0.45、0.61，P＜0.001），IL-8與GPT 無相關性（r=0.17，P=0.120）。IL-6、IL-10、TNF水平與GOT 水平呈正相關（r=0.48、0.40、0.49，P＜0.001），IL-8 與GOT 無相關性（r=0.08，P=0.440）。

3 討論

慢性乙型肝炎機制是指機體受到HBV 侵襲、感染不能及時有效清除HBV，使機體長期陷入免疫耐受狀態(tài)，造成患者肝細胞、肝組織等的慢性破壞、損傷。研究證實，是由于機體免疫損傷造成[7-9]。慢性乙型肝炎發(fā)病機制與患者遺傳、年齡、肝組織及細胞內(nèi)炎癥因子活化有關，而機體炎癥因子在免疫系統(tǒng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10-12]。肝臟含豐富的肝巨噬細胞，病原體攻擊肝細胞后，肝細胞內(nèi)炎癥級聯(lián)反應被激活，促使機體釋放大量炎癥因子如IL-6、TNF 等[13-16]，誘導機體產(chǎn)生一連串的免疫級聯(lián)反應，TNF 加劇肝星狀細胞增殖，使肝巨噬細胞釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β、血小板生長因子等，同時TNF 刺激產(chǎn)生大量IL-6 促使中性粒細胞聚集、活化，誘發(fā)肝纖維化和腎小管壞死等[17-19]，釋放的IL-8 等趨化中性粒細胞進入炎癥組織，產(chǎn)生超氧陰離子，激活炎癥細胞，參與炎癥反應發(fā)生，促進肝纖維細胞增殖分化，進一步導致慢性乙型肝炎發(fā)生[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組，提示機體受到HBV DNA 病毒復制增多，機體免疫炎癥因子的活化增強，進一步提示肝臟器官已經(jīng)損傷。目前臨床評估肝細胞受損程度的金標準是肝臟酶GPT、GOT 等的水平，本研究結(jié)果顯示，HBV DNA 低、高載量組GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組。相關性結(jié)果顯示，炎癥因子IL-6、IL-10、TNF 與肝臟酶GPT、GOT 呈正相關，可能是隨著HBV DNA 不斷復制，病毒載量升高，肝細胞受損，細胞通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶和釋放的炎癥細胞因子相互反應促使機體出現(xiàn)免疫級聯(lián)反應。因此，慢性HBV 病情評估應結(jié)合肝功能酶、炎癥因子綜合分析，獲得更為準確且客觀的參考依據(jù)。

外周血T 淋巴亞群在機體特異性免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，是慢性乙型肝炎患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測指標之一。T 淋巴亞群中CD4+T 細胞促進免疫細胞增殖和分化，調(diào)節(jié)機體細胞和體液免疫[23-25]。CD8+T 具有很強的殺傷能力，是機體清除細胞內(nèi)病毒的重要免疫細胞[26]。本研究結(jié)果顯示，與HBV DNA 陰性組比較，HBV DNA 低、高載量組CD4+T 細胞百分率和絕對計數(shù)減少，CD8+T 細胞百分率和絕對計數(shù)增加，CD4+/CD8+降低，提示機體產(chǎn)生的特異性抗體不足，不能及時有效地清除HBV，造成HBV DNA 在機體內(nèi)不斷復制。CD4+/CD8+是監(jiān)測機體細胞免疫功能、反映機體免疫狀態(tài)的重要指標，隨著復制的HBV DNA 載量升高，CD4+/CD8+失衡，提示HBV DNA 不斷復制導致機體免疫系統(tǒng)發(fā)生嚴重紊亂。

綜上，診治慢性乙型肝炎應結(jié)合肝臟酶、炎癥因子和外周血T 淋巴細胞亞群等指標分析，獲得更為準確且客觀的參考依據(jù)，為患者制訂更為有效的治療方案改善預后。