牛源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

梁纖纖，李 威，鄭啟銘，李曉卓，張 凌，劉文鍇，韓翔舒，蘇戰(zhàn)強，夏 俊*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，烏魯木齊 830000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動物疫病防控重點實驗室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832061）

犢牛腹瀉一般包括病毒性腹瀉、細菌性腹瀉、寄生蟲性腹瀉。病毒性腹瀉主要由輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒導致；細菌性腹瀉主要由沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌等病毒導致，其中大腸桿菌是導致7日齡以下犢牛腹瀉的主要原因，占發(fā)病原因的90%[1]。主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、體溫升高、排淡黃色稀糞、精神沉郁、脫水消瘦等，由于發(fā)病日齡過小，機體免疫力低，導致犢牛病死率很高，會給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌是一種條件性致病菌，可引起犢牛腹瀉、出血性腸炎等癥狀[2]。目前認為，大腸桿菌主要的黏附因子有K88、K99、F41等，其中F41菌毛是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）主要的黏附因子[3]。2023 年3 月新疆某牛場犢牛發(fā)生嚴重腹瀉，導致7 日齡以下犢牛死亡率達70%，本試驗無菌采集犢牛腹瀉糞便，采用分離鑒定、致病性檢測和耐藥性試驗等方式對病原進行鑒定，以期為該牛場犢牛腹瀉防治及給藥方案提供理論依據(jù)，為新疆地區(qū)大腸桿菌病的拓展研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

采自新疆石河子市周邊某牛場腹瀉犢牛糞樣，共20份。

1.1.2 主要材料

BHI 液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、藥敏紙片。

1.1.3 試驗動物

18～22 g健康雌性BALB/c小鼠8只。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

無菌采集2 g糞便，將糞便樣品接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。

1.2.2 細菌分離

菌液過夜培養(yǎng)后，運用劃線法將菌液接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)過37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，挑取粉紅色單菌落接種于6 mL BHI液體培養(yǎng)基進行純化，置于37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)18 h并觀察細菌生長情況。

1.2.3 染色鑒定

移液器取適量混勻的細菌培養(yǎng)液，按照革蘭氏染色試劑盒的方法進行革蘭氏染色，染色完成后鏡檢觀察其形態(tài)。

1.2.4 細菌及毒力基因鑒定

使用大腸桿菌鑒定引物進行PCR 鑒定，經(jīng)鑒定為大腸桿菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物進行PCR 鑒定，引物序列見表1。反應體系為常規(guī)的50 μL 體系，瞬離后混合均勻置PCR 擴增儀中。反應條件為：95 ℃預變性3 min，然后94 ℃循環(huán)變性30 s，退火溫度為58 ℃復性20 s，72 ℃延伸1 min，共進行30 個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。配制1%瓊脂糖凝膠進行電泳，參照DNA 2 000 Marker，判斷產(chǎn)物的序列大小是否與目標值一致。PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果于NCBI進行BLAST。

表1 引物序列

1.2.5 藥敏試驗

采用K-B 紙片法對分離株進行藥敏試驗。移液器吸取200 μL 細菌培養(yǎng)液，均勻涂布于BHI 培養(yǎng)基上，待吸收10 min后，將藥敏片（1μg/片）等距放置于培養(yǎng)基上進行藥敏試驗。于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后判定結果，藥敏結果判定按CLSI標準。

1.2.6 致病性實驗

試驗組和對照組小鼠各4只，將細菌培養(yǎng)液濃度調(diào)整到8.86×109CFU/mL，試驗組每只小鼠腹腔注射200 μL細菌培養(yǎng)液，對照組小鼠腹腔注射200 μL無菌PBS。

2 結果與分析

2.1 細菌分離

細菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊，表面光滑的圓形或橢圓形粉紅色菌落，見圖1。革蘭氏染色鏡檢可見單個存在的紅色革蘭氏陰性短桿菌，見圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結果

圖2 革蘭氏染色鏡檢結果

2.2 細菌與毒力基因鑒定

進行大腸桿菌及毒力基因的PCR 檢測后，結果顯示有效擴增出大小為200 bp 和543 bp 的目的條帶，見圖3、圖4，分離菌株為攜帶毒力基因F41的大腸桿菌。

圖3 細菌大腸桿菌PCR鑒定結果

圖4 細菌毒力基因PCR鑒定結果

2.3 致病性試驗

試驗組小鼠腹腔注射菌液4 h后，陸續(xù)開始出現(xiàn)精神沉郁、排黏液性糞便、被毛粗亂等癥狀，12 h后開始陸續(xù)死亡。對照組4只全程健康狀況良好，無死亡現(xiàn)象。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，該分離株對多黏菌素B、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢哌酮、卡那霉素敏感；對青霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素耐藥，見圖5、圖6。

圖5 藥敏試驗1

圖6 藥敏試驗2

3 討 論

犢牛腹瀉可根據(jù)發(fā)病情況不同，分為消化不良性腹瀉以及傳染性腹瀉[4]。消化不良性腹瀉一般病程短，防治有效且愈后良好，不會對養(yǎng)殖業(yè)造成太大經(jīng)濟損失。傳染性腹瀉是造成規(guī)?；鼋?jīng)濟損失的主要疾病。傳染性腹瀉根據(jù)病原不同可分為病毒性腹瀉、細菌性腹瀉以及寄生蟲性腹瀉，其中細菌性腹瀉的病原包括大腸桿菌、沙門氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等[5]。根據(jù)毒力因子、致病機理可以將致病性大腸桿菌分為五類，分別是產(chǎn)腸毒素性、腸出血性、腸致病性、腸侵襲性以及腸粘附性[6]。其中攜帶K88、K99、F41 以及F17 毒力基因的E.coli在患病動物中經(jīng)常被分離出來[7]。本次試驗從犢牛糞便中分離出的E.coli攜帶的毒力因子為F41，致病性試驗顯示該菌株對小鼠有一定的致病力。

本次試驗檢測到的E.coli對多黏菌素B、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢哌酮、卡那霉素敏感，對青霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素耐藥。楊艷麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛源E.coli對喹諾酮類藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。許淑蕓等[9]的研究顯示石河子地區(qū)牛源E.coli對β-內(nèi)酰胺類藥物頭孢唑林、阿莫西林、青霉素、頭孢拉定等抗生素耐藥性較高。郭慶勇等[10]的研究顯示伊犁某牛場的糞源大腸桿菌不同生長階段均對氨基糖苷類及β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。本試驗分離到的E.coli對喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗生素也表現(xiàn)為耐藥，可能是由于該牛場疫病防治工作中抗生素的不合理使用導致細菌產(chǎn)生了耐藥性?？筛鶕?jù)本試驗的結果改進抗生素使用策略，適量使用合適的抗生素來進行防治。

綜上所述，致病性大腸桿菌是導致犢牛細菌性腹瀉的主要病原，過去常使用抗生素來防治細菌性疾病，導致目前大腸桿菌對多種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。應當根據(jù)發(fā)病情況改進抗生素的用藥策略，不能盲目使用抗生素進行治療，防治過程中盡量選擇使用對菌株較敏感的抗生素，避免濫用抗生素。目前國內(nèi)已研發(fā)出的疫苗有大腸桿菌滅活疫苗和大腸桿菌K99 滅活疫苗，通過注射大腸桿菌滅活疫苗以及大腸桿菌K99滅活疫苗，可以對大腸桿菌病進行有效防控。另外，換季時要注意畜舍通風，保持良好的衛(wèi)生環(huán)境，出現(xiàn)腹瀉病情時及時治療并注意畜舍消毒。要始終堅持防大于治的原則。

4 結 論

此次從該牛場分離到一株攜帶F41毒力基因的大腸桿菌菌株，對小鼠有一定的致病力。通過耐藥性分析得知該菌株對多黏菌素B、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢哌酮、卡那霉素敏感，對青霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素耐藥。建議該牛場通過本試驗改進抗生素使用策略，合理用藥防治犢牛腹瀉。