哈薩克羊雜交群體多胎基因檢測分析

張 愷，瑪爾孜婭·亞森，阿米妮古麗·阿不來孜，買坎·沙力，周喜榮，于麗娟，3，白 鋒，羅春彥，奴麗曼古麗·阿不拉，邸全文，張艷花，3*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830026；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽資源（羊）評價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830026 4.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，烏魯木齊 830026；5.哈密市伊州區(qū)柳樹溝鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)（畜牧業(yè)）發(fā)展服務(wù)中心，新疆 哈密 839003；6.新疆伊犁特克斯縣喬拉克鐵熱克鎮(zhèn)，新疆 特克斯 835500）

隨著我國肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及人們對肉產(chǎn)品需求量的增加，提高肉羊生產(chǎn)繁殖率是當(dāng)前產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。為提高哈薩克羊的產(chǎn)羔率，新疆特克斯縣哈薩克羊養(yǎng)殖戶于1990 年引進(jìn)小尾寒羊公羊與本地哈薩克羊生產(chǎn)母羊雜交，經(jīng)過30年的導(dǎo)入多胎基因進(jìn)行雜交及選育，雜交群體的多胎率達(dá)90%以上。實(shí)踐證明，通過這種生產(chǎn)方式，既提高了雜交群體的多胎率又保留了原有哈薩克羊群體的適應(yīng)性。本研究旨在通過檢測該群體FecB基因，找到影響該群體產(chǎn)羔率的因素，為利用小尾寒羊改良哈薩克羊繁殖性能提供依據(jù)，為哈薩克羊高繁品系的培育提供借鑒[1，2]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)所需主要試劑有Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號：B518253）；引物[3]（上游引物：5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’，下游引物：5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGT-3’）；2X San Taq Fast PCR MiX 預(yù)混液（含藍(lán)染料）（生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號：B532062）；Ava Ⅱ內(nèi)切酶。主要儀器有低溫離心機(jī)priao-R、PCR擴(kuò)增儀-VeritiM 96-Well Thermal Cycler、水浴鍋、電泳儀DYY-6C。

實(shí)驗(yàn)羊群來自特克斯縣哈薩克羊雜交改良群體，每間隔4年導(dǎo)入一次小尾寒羊多胎基因。為防止近親交配，公羊使用1～2 年淘汰，然后使用哈薩克公羊配種，如此交替延續(xù)近30 年。飼養(yǎng)方式為半舍飼，每年5月到10月在夏牧場放牧，11月至次年4月底為舍飼。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集本實(shí)驗(yàn)使用羊側(cè)頸靜脈采血，選擇59 只健康的哈薩克羊雜交群體生產(chǎn)母羊，每只采集3 mL 靜脈血樣本，并將血液樣本保存在抗凝管中，冷凍貯存，用于提取DNA。

1.2.2 DNA提取

使用Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒，首先取200 μL 的血液樣品加入到1.5 mL 離心管中，再加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS Solution）使總體積達(dá)到200 μL，混勻。然后加入20 μL 蛋白酶K（Proteinase K）和200 μL 緩沖溶液DL（Buffer DL），混勻后在56 ℃水浴中加熱10 min，再向離心管中加入200 μL的無水乙醇，混勻。將吸附柱放入收集管中，把溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min后再以10 000 r/min的速度，室溫離心1 min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL GW Solution 和700 μL Wash Solution，分別離心后倒掉廢液。再將吸附柱重新放回收集管中，離心去除殘留的Wash Solution。最后取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，加入50 μL CE 緩沖液（CE Buffer）靜置3 min 后離心，收集DNA 溶液。提取的DNA在-20 ℃保存?zhèn)溆?，以備后續(xù)PCR擴(kuò)增使用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)小尾寒羊的基因組序列信息，使用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出上下引物的序列用于擴(kuò)增FecB 基因的DNA 片段。PCR 反應(yīng)體系包括PCR Mix、DNA 模板、上下引物和ddH2O。其中PCR Mix 包含了反應(yīng)所需的各種物質(zhì)，而DNA 模板則是PCR 反應(yīng)的DNA 樣本。上下游引物是用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增FecB基因的DNA片段的引物序列。

上游引物：5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’

下游引物：5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGT-3’

PCR 反應(yīng)程序包括預(yù)變性、變性、退火和延伸等步驟，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。預(yù)變性階段將反應(yīng)體系加熱至94 ℃，使DNA 解旋成單鏈；變性階段溫度94 ℃，持續(xù)30 s，使DNA 變性成單鏈；退火階段將溫度降至62 ℃，持續(xù)30 s，使引物與目標(biāo)DNA 互補(bǔ)配對；延伸階段將溫度升至72 ℃，持續(xù)30 s，聚合酶開始合成新的DNA 鏈。最后溫度保持在72 ℃，持續(xù)6 min 的延伸步驟，以確保DNA 鏈的完全合成[4]。

PCR 反應(yīng)產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以將不同大小的DNA 片段分離出來，驗(yàn)證PCR反應(yīng)是否成功擴(kuò)增出目標(biāo)片段。在本次實(shí)驗(yàn)中，目的條帶預(yù)計(jì)約在140 bp 左右，通過檢測結(jié)果確認(rèn)是否擴(kuò)增成功。

1.2.4 PCR-RFLP

本實(shí)驗(yàn)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA 片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理。酶切反應(yīng)采用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切割，以產(chǎn)生不同長度的DNA 片段。根據(jù)所設(shè)計(jì)的位點(diǎn)，會出現(xiàn)三種基因型，分別為BB、B+、++，它們的長度分別為110 bp、30 bp 和140 bp、110 bp、30 bp 以及140 bp。由于30 bp 較短，因此在電泳成像圖中可能不易辨認(rèn)，但并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。酶切反應(yīng)的體系包括3 μL ddH2O、1.5 μL 緩沖液、0.5 μL AvaII 內(nèi)切酶和5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)條件為在37 ℃水浴中加熱4 h，然后在2%濃度的瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳，并使用成像儀檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳圖結(jié)果

2.2 PCR-RFLP分析

當(dāng)FecB 基因的746 bp 處發(fā)生突變時(shí)，便會產(chǎn)生AvaⅡ酶的酶切位點(diǎn)，這在李東紅[5]的研究中提到。在我們樣本中有少部分血樣保存不佳，DNA出現(xiàn)降解，無條帶顯示，不計(jì)入總數(shù)。

圖1 中第M 泳道是2 000 bp 的marker，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在140 bp 左右，符合預(yù)期結(jié)果。圖2 中第M泳道是50 bp 的marker，第1、5、6、8、9、11 泳道出現(xiàn)140 bp 和110 bp 兩條條帶，為B+（突變雜合型）；第3、7、13 泳道出現(xiàn)140 bp 條帶，為++（不含多胎主效基因）；第12 泳道出現(xiàn)110 bp 條帶，為BB（突變純合型），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 多胎基因檢測結(jié)果

圖1 FecB基因PCR產(chǎn)物電泳分析

圖2 PCR產(chǎn)物酶切產(chǎn)物電泳分析

3 討 論

目前在提高綿羊產(chǎn)羔率的育種工作中，采用較多的是導(dǎo)入小尾寒羊或者湖羊多胎基因，提高原有品種的產(chǎn)羔率。

3.1 雜交導(dǎo)入小尾寒羊提高多胎率的效果

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用雜交小尾寒羊可以有效地將FecB 基因?qū)牍_克羊群體，該實(shí)驗(yàn)群體的實(shí)際多胎率高達(dá)90%，大大高于檢測結(jié)果，可能是導(dǎo)入群體的多胎率除FecB 主效基因外，還有其他微效多基因影響；另外可能是實(shí)驗(yàn)群體的多胎率統(tǒng)計(jì)不準(zhǔn)確，后續(xù)將進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。

李彬[6]在甘肅省景泰縣進(jìn)行灘羊?qū)胄∥埠虻幕蛐Ч^察，試驗(yàn)組灘×寒灘F1 產(chǎn)羔率達(dá)184.38%，對照組灘母羊產(chǎn)羔率為103.3%。試驗(yàn)組比對照組的產(chǎn)羔率提高了80%有余。羅生金[7]在研究培育有多胎基因的哈薩克羊時(shí)將小尾寒羊作為父本或母本，并對F1代羊進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果為野生雜合性B+的比例比野生型++提高了63%，有效提高F1 代母羊的產(chǎn)羔數(shù)。呂彥慶[8]在新疆瑪納斯縣羊場針對小尾寒羊的雜交做了更加仔細(xì)的記錄，將黑頭杜泊羊與小尾寒羊雜交，F(xiàn)1代母羊的單羔率為43%，產(chǎn)雙羔率41.2%，產(chǎn)三羔率15.8%，群體產(chǎn)羔率172.8%。雜交后代的產(chǎn)羔率顯著上升，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

以上案例都是導(dǎo)入小尾寒羊雜交1 代和雜交2 代的實(shí)驗(yàn)分析，本實(shí)驗(yàn)研究群體為間隔4 年雜交小尾寒羊?qū)攵嗵セ?，陸續(xù)導(dǎo)入7次，多胎率達(dá)到90%，除雙羔外還有三羔四羔出現(xiàn)。實(shí)踐證明通過雜交導(dǎo)入小尾寒羊多胎基因提高哈薩克羊多胎率效果顯著。

3.2 雜交導(dǎo)入湖羊提高多胎率的效果

在伊利[9]等人的研究中提到，在新疆石河子、哈密、昌吉、阿克蘇、喀什、博爾塔拉蒙古自治州等地，采用湖羊與哈薩克羊雜交培育的新類型具有較高繁殖力，在舍飼條件下各項(xiàng)生理指標(biāo)正常，發(fā)病率低，能很好地適應(yīng)本地氣候環(huán)境。王偉萍[10]選擇來自江蘇西來原生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司養(yǎng)殖的湖羊與烏骨羊的雜交后代作為研究對象，得出與湖羊雜交后的后代顯著提升了繁殖率，并且在抗病性能和生長性能方面有顯著的雜種優(yōu)勢。李丹妮[11]在西北農(nóng)林科技大學(xué)金昌奶綿羊試驗(yàn)示范基地進(jìn)行東佛里生羊和湖羊雜交實(shí)驗(yàn)，根據(jù)F2 代產(chǎn)羔數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，東湖雜二代羊（F2）的產(chǎn)羔率為189.51%，產(chǎn)單羔的母羊約占群體總數(shù)的42%。導(dǎo)入湖羊的多胎基因是作為其他肉羊品種提升產(chǎn)羔率的主流趨勢。

綜上所述，利用雜交導(dǎo)入小尾寒羊多胎基因在甘肅省景泰縣、新疆瑪納斯縣等地，對提高灘羊、黑頭杜泊羊、哈薩克羊等品種的產(chǎn)羔率效果顯著，試驗(yàn)組的產(chǎn)羔率達(dá)到184.38%。利用雜交導(dǎo)入湖羊多胎基因在新疆石河子、哈密、昌吉、阿克蘇、喀什、博爾塔拉等地，對提高哈薩克羊、烏骨羊、東佛里生羊等品種的產(chǎn)羔率也有顯著的效果，F(xiàn)2代產(chǎn)羔率為189.51%。

3.3 雜交導(dǎo)入小尾寒羊?qū)Ξa(chǎn)肉性狀的影響

在苗玉華[12]所做的小尾寒羊與杜泊羊雜交實(shí)驗(yàn)中得出，杜寒雜交羊結(jié)合了小尾寒羊高產(chǎn)羔率的繁殖優(yōu)勢和杜泊父本快速生長、出色的產(chǎn)肉性能。與小尾寒羊羔羊相比，杜寒雜交羊一代肉羊的生產(chǎn)性能顯著提高，具有明顯的雜交優(yōu)勢和強(qiáng)大的適應(yīng)性。

雜交后代天生具有優(yōu)勢，因?yàn)樵谶z傳變異過程中，它們更好地保留了父代的優(yōu)良基因。因此，杜寒雜交后代在生長發(fā)育性能、繁殖性能、育肥羊屠宰性能等方面都有所提高，肉質(zhì)也得到了改善[12]。四子王旗嘗試以東佛里生羊作為父本，小尾寒羊作為母本，培育出一種適合圈養(yǎng)、生長速度快、產(chǎn)肉率高且具有多胎性能的乳肉兼用品種。苗海芬[13]等人用雜交后代進(jìn)行屠宰實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，“東寒”雜交F1 代與小尾寒羊在宰前體尺和產(chǎn)肉性能方面差異不顯著，但尾部重量占比和尾脂率顯著減少。通過實(shí)現(xiàn)小尾化改良，本地肉羊產(chǎn)業(yè)的綜合養(yǎng)殖效益得到了顯著提升。這一舉措不僅促進(jìn)了當(dāng)?shù)厝庋虍a(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也為當(dāng)?shù)厣鐣?jīng)濟(jì)的繁榮做出了巨大貢獻(xiàn)。

綜上所述，導(dǎo)入小尾寒羊多胎基因?qū)Ω纳飘a(chǎn)肉性狀有顯著影響。雜交后代在生長發(fā)育性能、繁殖性能、育肥羊屠宰性能等方面都有所提高，肉質(zhì)也得到了改善。齊明[14]的實(shí)驗(yàn)也表明，杜×寒F1代和薩×寒F1代羔羊在6月齡時(shí)的體高、體長、胸圍和產(chǎn)肉性能也均顯著高于純繁。

3.4 利用基因檢測技術(shù)加快育種遺傳進(jìn)展

在荷斯坦牛的育種工作中，運(yùn)用基因定位和分子檢測等技術(shù)，為奶牛遺傳進(jìn)展帶來前所未有的提升[15]，規(guī)模化使用基因組選擇技術(shù)進(jìn)行育種工作是主流趨勢[16]。

早在1994年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的魏慶信[17]等人將PMHR 抗豬瘟病毒核酶基因?qū)牒卑棕i，實(shí)驗(yàn)完成后四頭仔豬檢測出PMHR基因，成功地減緩了當(dāng)時(shí)的豬瘟流行。

在羊的育種中應(yīng)用較多的有OarJMP29基因，與綿羊體重、周長和角長有關(guān)；EDG1基因，與脂尾性狀顯著相關(guān)；ZEB1和DEPDC7基因可以篩選綿羊四乳頭性狀等[18]。通過對多胎基因型的選擇，從數(shù)量遺傳學(xué)的角度來看，采用基因檢測技術(shù)和基因型選擇技術(shù)，提高了選種的準(zhǔn)確度，增強(qiáng)了選擇強(qiáng)度，大大加快了遺傳研究進(jìn)程。

目前利用檢測FecB 基因選擇多胎性狀已經(jīng)是一個(gè)較為成熟的技術(shù)。本研究項(xiàng)目中，通過檢測FecB 基因，選擇多胎基因型的哈薩克羊留種，可以有效提高選擇強(qiáng)度，加快繁殖率這一低遺傳力性狀的選育速度，這為地方品種多胎育種提供了有效的技術(shù)支持。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過采用基因檢測技術(shù)和基因型選擇技術(shù)，為綿羊育種提供了有效的技術(shù)支持，為利用小尾寒羊多胎基因改良哈薩克羊繁殖性能提供依據(jù)，為哈薩克羊高繁品系的培育提供借鑒。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過雜交導(dǎo)入高繁殖性狀的小尾寒羊多胎基因改良哈薩克羊，可以有效提高群體的繁殖率，利用基因檢測技術(shù)，篩選出具有多胎基因的個(gè)體留種，對育種群體種羊進(jìn)行精準(zhǔn)選擇，為地方多胎品種（系）的培育提供技術(shù)支撐。利用雜交導(dǎo)入小尾寒羊多胎基因培育哈薩克羊多胎品系，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值，可以有效提高地方品種肉羊的產(chǎn)羔率，是培育哈薩克羊多胎品系的途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在哈薩克羊群體中通過交替使用小尾寒羊公羊、哈薩克公羊配種，不但保證了群體的產(chǎn)羔率，而且保留了哈薩克羊原有的適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、耐粗飼等特點(diǎn)，這種雜交方式不僅能夠提高生產(chǎn)效率，還能夠保證羊群的健康成長。通過不斷引進(jìn)新鮮血液，可以有效防止近親繁殖導(dǎo)致的遺傳缺陷。這種雜交模式可以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中加以推廣。