染發(fā)劑對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的遺傳毒性研究

＊張樂 胡瀅 宋家璇 左晨陽 劉羽

（延安大學(xué)石油工程與環(huán)境工程學(xué)院 陜西 716000）

染發(fā)劑是常見的能改變頭發(fā)顏色的日用化妝品，染發(fā)劑是否具有致突、致癌和致突變作用，已成為人們普遍關(guān)注的問題[1]。目前，市面上的染發(fā)劑大多是氧化型染發(fā)劑，其主要成分是對(duì)苯二胺、間苯二胺等小分子苯胺染料顯色劑H2O2等，雙氧水和對(duì)苯二胺均在3類致癌物清單中，易在使用者中引發(fā)過敏、皮膚損害及眼損害[2-3]等問題。

微核是真核生物細(xì)胞染色體一種異常結(jié)構(gòu)，微核的形成能用來反映環(huán)境誘變因子對(duì)染色體造成的損傷情況，是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一[4]。蠶豆的染色體分布均勻、有絲分裂清晰易察，蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)常被作為研究遺傳毒性的有效實(shí)驗(yàn)，它成本低、周期短、操作簡(jiǎn)易、可靠性和靈敏性較高，對(duì)于致突變性的檢測(cè)十分有效[5]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)染發(fā)劑中的對(duì)苯二胺和雙氧水的蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)，以探討其對(duì)植物遺傳毒性的影響，并對(duì)實(shí)際染發(fā)劑產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，為減少環(huán)境污染、保護(hù)人群健康提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1.材料與方法

(1)材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)材料：青皮蠶豆。

實(shí)驗(yàn)試劑：對(duì)苯二胺、偏重亞硫酸鈉、鹽酸、活性炭、堿性品紅、無水乙醇、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、冰醋酸、四種市售染發(fā)劑。

實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱；紫外分光光度計(jì)；奧林巴斯顯微鏡；電熱鼓風(fēng)干燥箱；臺(tái)式高速離心機(jī)；水浴鍋；震蕩器。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用青皮蠶豆為原料，對(duì)苯二胺實(shí)驗(yàn)是使用質(zhì)量濃度為3mg/L～1700mg/L的對(duì)苯二胺來對(duì)蠶豆根尖進(jìn)行染毒處理；雙氧水實(shí)驗(yàn)是使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～12.5%的雙氧水來對(duì)蠶豆根尖進(jìn)行染毒處理；蒸餾水作為對(duì)照組進(jìn)行的蠶豆根尖染毒處理。

①蠶豆根尖的浸種、催根及染毒

浸種、催根過程：青皮蠶豆種子在25℃環(huán)境下濕潤(rùn)的脫脂棉中浸種、催芽，直到蠶豆根尖長(zhǎng)到2.00～3.00cm為止。分別配置好不同濃度的對(duì)苯二胺和雙氧水溶液置于三角瓶中，選取3～6粒蠶豆幼苗浸染5h。四種染發(fā)劑按照配方進(jìn)行均勻混合，對(duì)四組真發(fā)進(jìn)行染色處理，頭發(fā)長(zhǎng)度約為30cm，質(zhì)量20g，染發(fā)操作后用水沖洗，清洗后置入三角瓶中加水至250mL，取3～6粒根尖生長(zhǎng)狀況大致相同的蠶豆幼苗置于其中。

②根尖細(xì)胞的恢復(fù)培養(yǎng)及固定

染毒后的種子清洗后重新置于濕潤(rùn)的脫脂棉中恢復(fù)培養(yǎng)24h左右，從根尖頂端切取1cm長(zhǎng)的幼根，加卡諾氏固定液固定24h。

③孚爾根染色、制片和鏡檢

將固定好的幼根分別用蒸餾水浸洗，HCl溶液水浴，使蠶豆根尖軟化后再次清洗，利用席夫試劑染色，再用SO2洗滌液浸洗根尖，清洗后4℃保存。取2mm左右的根尖搗碎制片，找到細(xì)胞分散均勻、清晰的部位，400倍觀察，在不同部位數(shù)出根尖有絲分裂數(shù)、微核數(shù)[6]。

④脂質(zhì)過氧化（MDA）的檢測(cè)

蠶豆根尖細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化丙二醛的測(cè)定采用分光光度法進(jìn)行[6]。

(3)分析方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組至少觀察3個(gè)制片，每個(gè)制片觀察1000個(gè)細(xì)胞，觀察微核形成及有絲分裂情況，統(tǒng)計(jì)微核數(shù)目，計(jì)算微核率（MCN‰）、微核指數(shù)和有絲分裂指數(shù)（MI%）。MCN為觀測(cè)到的含微核細(xì)胞數(shù)占觀察到的細(xì)胞總數(shù)（1000個(gè)）的比例；微核指數(shù)為試驗(yàn)樣本的微核率與對(duì)照樣本的微核率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為蒸餾水；有絲分裂指數(shù)（MI）為100個(gè)細(xì)胞中含有的有絲分裂數(shù)目；MDA為蠶豆根尖細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物丙二醛的含量。

計(jì)算方法如下：

MCN‰=（某測(cè)試樣片的MCN數(shù)÷某測(cè)試樣品觀察到的細(xì)胞總數(shù)）×1000‰

MI%=（某測(cè)試樣片的有絲分裂發(fā)生數(shù)÷某測(cè)試樣片觀察到的細(xì)胞總數(shù)）×100%

MDA的含量（μmol/g）=C×V×10-3/W

C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用EXCEL計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制曲線圖，采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2.結(jié)果與討論

(1)四種市售染發(fā)劑蠶豆根尖細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選擇市售不同價(jià)位的四種染發(fā)劑對(duì)真發(fā)進(jìn)行染色處理，選取處理后的頭發(fā)放入到培養(yǎng)蠶豆根尖細(xì)胞的水溶液中，考察對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的影響。

從表1中可以看出四種染發(fā)劑處理后的頭發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核指數(shù)分別為3.12、2.83、1.13和1.39，微核形態(tài)如圖1所示，同時(shí)有絲分裂指數(shù)明顯下降。細(xì)胞內(nèi)活性氧含量迅速增加，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物水平迅速提高，對(duì)生物體的正常生理功能造成影響。染發(fā)劑的脂質(zhì)過氧化物含量也比對(duì)照組明顯提高，說明因?yàn)槿景l(fā)劑中存在大量化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生毒性作用，細(xì)胞機(jī)體正常形成受到影響。實(shí)驗(yàn)中選用的四種染發(fā)劑存在價(jià)格梯度為A＞C＞D＞B，而毒性效果由強(qiáng)到弱為A＞B＞D＞C，可見染發(fā)劑植物毒性與其售價(jià)關(guān)系不大，許多研究也表明染發(fā)劑會(huì)誘發(fā)頭皮毛囊退化或其他皮膚問題。

圖1 細(xì)胞微核形態(tài)

表1 4種染發(fā)劑誘導(dǎo)下蠶豆根尖細(xì)胞的MI、MCN及MDA的變化

(2)雙氧水處理分析

雙氧水是染發(fā)劑中的主要成分，觀察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雙氧水對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞毒性的影響。由圖2可知，空白對(duì)照的MCN在（6.07±1.74）‰，雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～3%的范圍內(nèi)的蠶豆MCN呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，MCN為（16.83±2.4）‰，達(dá)到峰值，當(dāng)雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%之后，MCN明顯下跌后趨于平緩。雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于3%時(shí)蠶豆根尖經(jīng)過染毒后顏色赤紅，并隨著濃度的增加而加深，但是整個(gè)根尖仍存在韌性和柔軟性，恢復(fù)培養(yǎng)后有白色嫩芽長(zhǎng)出，雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%之后的根尖明顯發(fā)黑變硬，恢復(fù)培養(yǎng)后根尖生長(zhǎng)扭曲，且短小，出現(xiàn)部分壞種。雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12.5%以后根尖完全變黑變硬。MCN在雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～12.5%范圍內(nèi)和空白對(duì)照組沒有顯著性差異，是因?yàn)檫^高濃度的雙氧水對(duì)蠶豆根尖起到的嚴(yán)重抑制和損害作用已經(jīng)完全大于植物本身的生長(zhǎng)的能力，因此MCN因?yàn)樯L(zhǎng)抑制而變小。

圖2 雙氧水對(duì)蠶豆根尖MCN和MDA的影響

圖中MDA隨著雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的曲線，也表現(xiàn)出3%為峰值的前漲后跌，峰值為（3.87±0.37）μmol/g。實(shí)驗(yàn)中蠶豆生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)應(yīng)，數(shù)值變化趨勢(shì)也可以看出MCN與MDA存在著一定的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS的雙尾分析可知皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.868**.在0.01級(jí)別（雙尾），相關(guān)性顯著。

(3)對(duì)苯二胺數(shù)據(jù)分析

對(duì)苯二胺是染發(fā)劑中最常添加的物質(zhì)之一，本實(shí)驗(yàn)觀察不同質(zhì)量濃度的對(duì)苯二胺對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞毒性的影響。

由圖3可知，蠶豆根尖的MCN值隨著對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度的增大先增大再減小，150mg/L時(shí)MCN達(dá)到最大值17.74±2.71‰，對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度小于46mg/L時(shí)，蠶豆經(jīng)過染毒之后根尖發(fā)灰，但是恢復(fù)培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好，當(dāng)對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度大于75mg/L時(shí)，濃度增大根尖顏色逐漸變黑變硬，恢復(fù)培養(yǎng)后生長(zhǎng)扭曲，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1700mg/L時(shí)有一半的根尖細(xì)胞死亡。數(shù)據(jù)顯示對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度在1200mg/L～1700mg/L時(shí)MCN值與空白和低濃度的差異顯著性不大，其原因與雙氧水染毒過程相同，均為蠶豆根尖產(chǎn)生的嚴(yán)重生長(zhǎng)抑制使微核率明顯減少，而非毒性降低所致。

圖3 對(duì)苯二胺對(duì)蠶豆根尖MCN和MDA的影響

MDA數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)與MCN相似，最大值出現(xiàn)在對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度為150mg/L時(shí)，此時(shí)MDA濃度為（3.68±0.42）μmol/g，MDA與MCN二者之間進(jìn)行雙尾分析后發(fā)現(xiàn)兩者同樣有0.01級(jí)別的顯著的相關(guān)性。研究表明當(dāng)環(huán)境中存在誘變劑時(shí)，逆境會(huì)對(duì)植物造成明顯損傷，而植物也會(huì)同時(shí)形成對(duì)逆境的適應(yīng)性，并產(chǎn)生抵抗力[7]。

3.結(jié)論

（1）市售四種染發(fā)劑蠶豆根尖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，染發(fā)劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照的差異存在顯著性，說明染發(fā)劑具有一定的植物毒性。

（2）在對(duì)苯二胺質(zhì)量濃度和雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為150mg/L和3%時(shí)，MCN達(dá)到最高,對(duì)應(yīng)值為（16.83±2.4）‰和（17.74±2.71）‰，MDA也達(dá)到峰值，分別為（3.68±0.42）μmol/g和（3.87±0.37）μmol/g，并且和空白對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異，MDA與MCN存在顯著相關(guān)性。

（3）隨著污染物濃度的增大，MDA與MCN均因?yàn)槎拘晕镔|(zhì)嚴(yán)重的生物抑制而導(dǎo)致數(shù)值下降，可結(jié)合蠶豆根尖細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及硬化、死亡率最終判斷毒性大小。