塔什庫爾干羊FecB 基因非探針法高分辨率熔解曲線分型方法的研究

李 浩，郭 濤，陳 童,2，張 璐，張?jiān)粕?2，鄭新寶,2，阿依努爾·亞森,2*

[1.新疆畜牧科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽資源（羊）評價利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830026]

多胎性狀是綿羊繁殖率的重要指標(biāo)，多胎基因作為控制綿羊產(chǎn)羔數(shù)量的主效基因，發(fā)揮了重要作用。影響綿羊多胎性狀的候選基因主要有骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-1B（BMPR-1B）、形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）、生長分化因子9（GDF9）、親吻素（KISS-1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）、視黃酸受體γ（RARG）、視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）等。其中，BMPR-1B 基因的FecB突變型對綿羊的排卵數(shù)具有累加效應(yīng)，即每增加一個拷貝將額外多排卵1.5～3.0 枚，已成為綿羊高繁殖力標(biāo)記基因之一[1]。

綿羊多胎性狀由多基因調(diào)控。BMPR-1B 基因的突變體FecB基因是一個常染色體基因，可通過共顯性效應(yīng)和部分顯性效應(yīng)提高排卵率，在提高綿羊排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)等方面發(fā)揮了重要作用。FecB基因作為綿羊多胎性狀的主效基因，具有豐富的遺傳多樣性[2]，不同品種的綿羊廣泛地存在FecB基因，可以作為選育肉用綿羊多胎類型的有效候選基因。我國的湖羊、小尾寒羊、多浪羊、策勒黑羊和巴音布魯克羊等優(yōu)良綿羊品種均攜帶有FecB基因，其中湖羊攜帶的B 等位基因頻率高達(dá)0.83[3]，產(chǎn)羔率能達(dá)到250%，其攜帶的多胎FecB 基因是決定湖羊個體多胎性狀的主要因素。

由于繁殖性狀的遺傳力普遍較低，因此，如果能確定與繁殖有關(guān)的主效基因，即可通過分子標(biāo)記輔助選擇將其引入育種中，從而快速將優(yōu)良基因型導(dǎo)入育種群體[4]。通過雜交等方式將FecB基因?qū)敕敝沉^低的羊群，以期提高綿羊群體的繁殖性能，從而提高經(jīng)濟(jì)效益，成為綿羊雜交改良的重要途徑之一。羅生金[5]用含有BB 型的湖羊公羊與當(dāng)?shù)氐墓_克母羊進(jìn)行雜交，將FecB基因?qū)牍_克羊中并進(jìn)行檢測，初步培育出哈薩克羊多胎類型，建立了新的育種群。于振興等[6]從湖羊上提取FecB突變利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功導(dǎo)入新疆細(xì)毛羊體內(nèi)，為培育高繁殖率的新疆細(xì)毛羊奠定基礎(chǔ)，這些研究都為眾多地方綿羊品種的多胎類型（品系）選育工作提供了思路。

塔什庫爾干羊主要生活于帕米爾高原3000～5000m 的東坡，是區(qū)別于其他脂臀羊的高山放牧品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、適宜放牧、產(chǎn)肉性能好等特點(diǎn)。但由于受高寒干旱生態(tài)環(huán)境的限制，飼養(yǎng)管理粗放，特別是在秋冬季節(jié)飼草短缺，嚴(yán)重制約著塔什庫爾干羊繁殖性能的發(fā)揮，產(chǎn)羔率僅有105%左右。因此，建立塔什庫爾干羊多胎類型（品系），提高塔什庫爾干羊群體的繁殖性能，可以大幅提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，增加農(nóng)牧民收入。

綿羊的多胎類型（品系）選育離不開準(zhǔn)確地對多胎性狀進(jìn)行基因檢測。綿羊基因多態(tài)性檢測可分為限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）及高分辨率熔解曲線（High resolution melting analysis,HRM）等幾種方法。但前兩種基因檢測技術(shù)普遍存在成本高、操作技術(shù)繁瑣，不能滿足綿羊生產(chǎn)中對FecB基因快速、低成本、高通量檢測的需求。HRM 可以通過目的基因片段PCR 擴(kuò)增之后進(jìn)行產(chǎn)物的熔解曲線分析來區(qū)分目的片段的微小序列差異，在基因突變、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）、甲基化和人類白細(xì)胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）配型等多個方面具有較大優(yōu)勢[7]。因此，本試驗(yàn)利用HRM 對塔什庫爾干羊基因組中FecB基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，建立快速、高靈敏度和特異性強(qiáng)的基因分型方法，為塔什庫爾干羊多胎新品系培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

查閱塔什庫爾干縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)塔什庫爾干羊產(chǎn)羔記錄，篩選出塔什庫爾干羊產(chǎn)雙羔（多羔）母羊67 只，雙羔（多羔）羔羊136 只。用ACD 抗凝采血管頸靜脈采血3mL，-20℃凍存。

1.2 主要試劑及儀器

HRM 平臺熒光定量PCR 儀（型號為Light Cycler 480），購自羅氏公司；血液基因組提取試劑盒（上海生工）；TaqDNA 聚合酶、10×PCR Buffer、Mgcl2（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（上海生工）；引物由上海生工公司提供。

1.3 DNA 的提取

采用常規(guī)酚－氯仿抽提法提取血樣中基因組DNA。利 用NanoDrop2000（Thermo Scientific，USA）測定提取DNA 樣品的完整性和濃度，將所有樣品的濃度調(diào)整為50ng/μL 左右。

1.4 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR 擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性3min；95℃30s，55℃60s，循環(huán)數(shù)為35 次。HRM 分析程序：95℃變性5min，40°C 冷卻2min；75～95℃收集熒光信號，每秒鐘收集25 次信號。利用LightCycler 480 自帶軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 不同長度引物篩選

根據(jù)FecB 基因的序列（GenBank 登錄號：AF357007.1），應(yīng)用Oligo 軟件由上海生工公司分別合成2 對引物，將引物稀釋成10mmoL/L 的濃度-20℃保存。引物信息詳情見表1。

表1 擴(kuò)增引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度

1.6 不同引物濃度的影響

對比了不同引物濃度下的HRM 分析，以確定最適合基因分型的引物濃度。引物稀釋后的工作濃度為10mmol/L，詳見表2。

表2 擴(kuò)增引物濃度

1.7 不同鎂離子濃度的影響

鎂離子是影響PCR 的關(guān)鍵因素。通過對比不同濃度鎂離子，可以確定最適合的FecB 基因分型PCR 體系中Mg2+的濃度（表3）。

表3 鎂離子濃度

1.8 不同模板濃度的影響

在反應(yīng)過程中不同的模板濃度與熒光染料的結(jié)合量不同，會導(dǎo)致信號強(qiáng)度差異變大，造成分型不準(zhǔn)確。通過對不同模板濃度的影響進(jìn)行HRM 分析，可以分析出最適合塔什庫爾干羊FecB 基因突變分型的模板濃度。本試驗(yàn)采用的模板濃度分別為：500pg、5ng、50ng、500ng。

1.9 HRM 分析

每個優(yōu)化的HRM 分析體系在反應(yīng)過程中包括PCR 擴(kuò)增階段和HRM 分析兩個階段，其中第一階段為40 個循環(huán)，第二階段為1 個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增片段的HRM 優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)前期試驗(yàn)，本試驗(yàn)設(shè)計了115bp、140bp 2 對不同片段大小的擴(kuò)增引物，PCR 擴(kuò)增之后進(jìn)行HRM 分析。結(jié)果表明，115bp 擴(kuò)增引物聚合性以及溫度的一致性較好，適合SNP 位點(diǎn)的分型。140bp 的效果較差，不適合塔什庫爾干羊FecB 基因的SNP 位點(diǎn)分型。

2.2 不同引物濃度對HRM 分析的影響

通過HRM 反應(yīng)后分析，結(jié)果表明，在所設(shè)的梯度中添加量太大或太小時，擴(kuò)增效率較差，熒光信號提前減弱，熔解溫度偏移。本試驗(yàn)中引物添加量為0.6μL 時擴(kuò)增效率較好，可以確定為較優(yōu)添加量。

2.3 不同鎂離子濃度對HRM 分析的影響

通過HRM 反應(yīng)后分析，結(jié)果表明，鎂離子濃度在低于1.6mmol/L 或高于4mmol/L 時，擴(kuò)增反應(yīng)達(dá)不到平臺期，擴(kuò)增曲線散亂，熔解曲線中熒光信號下降。鎂離子濃度在2.4～3.2mmol/L時，擴(kuò)增曲線和熔解曲線聚合性較好，熔解溫度差異分辨率清楚。

2.4 不同模板濃度對HRM 分析的影響

通過HRM 反應(yīng)后分析，結(jié)果表明，模板濃度在設(shè)計范圍內(nèi)時，擴(kuò)增曲線均達(dá)到了平臺期。但是在500pg 以下或500ng 以上時，反應(yīng)不穩(wěn)定，效率較低。當(dāng)反應(yīng)模板濃度在50ng 時，擴(kuò)增曲線、熔解曲線和熔解溫度差異曲線較符合塔什庫爾干羊FecB 基因分型的要求。

2.5 優(yōu)化后的HRM 體系對塔什庫爾干羊FecB 基因SNP 位點(diǎn)分型結(jié)果

利用優(yōu)化后的HRM 體系對塔什庫爾干羊多胎候選基因FecB進(jìn)行分型分析，通過對高分辨率溶解數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和溫度平移處理得到的溶解曲線圖（圖1），結(jié)合溶解溫度差異顯示圖（圖2）可以清楚地區(qū)分出塔什庫爾干羊FecB基因不同堿基變異的差異。檢測結(jié)果表明，該基因多態(tài)性表現(xiàn)為一個單堿基位點(diǎn)突變，可以利用HRM體系實(shí)現(xiàn)FecB基因檢測的高通量、高準(zhǔn)確率等實(shí)際需求。

圖1 熔解曲線圖

圖2 熔解溫度差異圖

2.6 塔什庫爾干羊FecB 基因檢測結(jié)果

由表4 可知，母羊和羔羊不攜帶純合型（BB），攜帶雜合型（B+）母羊占31.3%，羔羊占25.7%；攜帶野生型的母羊占68.7%，羔羊占74.3%。

表4 塔什庫爾干羊FecB 基因檢測結(jié)果

3 討論

綿羊的多胎基因FceB 被定位在第6 號染色體上，具有提高排卵和產(chǎn)羔的生物學(xué)作用[8]，是目前已知的綿羊高繁殖力主效基因。一些綿羊品種如湖羊、小尾寒羊等攜帶的多胎FecB 基因是其產(chǎn)羔率能達(dá)到200%、250%的主要原因。在湖羊、小尾寒羊的雜交后代群體中，均能檢測到攜帶多胎FecB 基因的個體，其中，純合型（BB）母羊個體產(chǎn)羔率可達(dá)到250%，雜合型（B+）母羊個體產(chǎn)羔率可達(dá)到200%。因此，通過多胎基因檢測鑒定，可以區(qū)分純合型（BB）、雜合型（B+）以及野生型的母羊個體[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)含有一個FecB基因B 等位基因的母羊（B+）排卵數(shù)增多1.50～1.65 個，產(chǎn)羔數(shù)增加0.9～1.2 個；含有兩個FecB 基因B 等位基因的母羊（BB）排卵數(shù)增多2.7～3.0 個，產(chǎn)羔數(shù)增加1.1～1.7 個；含有FecB 基因的母羊平均每胎產(chǎn)羔超過1 只，而野生型母羊產(chǎn)羔均為單胎[10]，這說明FecB 基因確實(shí)能夠控制綿羊的多羔性狀。對杜泊羊與湖羊雜交后代羊羔的FecB 基因進(jìn)行檢測分析后，發(fā)現(xiàn)隨著雜交代數(shù)增加，B 等位基因頻率逐漸降低，產(chǎn)羔率也隨之降低，且與基因型相關(guān)。

塔什庫爾干羊是經(jīng)過長期封閉選育形成的適應(yīng)高海拔、高寒條件的高原綿羊品種，但其繁殖率低，生產(chǎn)性能不高。由于塔什庫爾干羊存在FecB基因，但雙羔率較低，可以應(yīng)用綿羊多胎基因檢測技術(shù)和精準(zhǔn)選配技術(shù)，選擇純合型（BB）湖羊或小尾寒羊同塔什庫爾干羊雜交，在母羔出生后1月齡以內(nèi)，就可采血鑒定多胎FecB基因，提前2 年完成對生產(chǎn)母羊個體的多胎性選留。也可以利用塔什庫爾干羊攜帶有FecB基因雜合型（B+）的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)公、母羊多胎基因雜合型（B+）的精準(zhǔn)選配，從而大量、穩(wěn)定地生產(chǎn)攜帶有多胎FecB 基因的雜交后代，組建塔什庫爾干羊多胎類型核心群，提高群體產(chǎn)羔率30%～50%[10]，可以有效提高塔什庫爾干羊養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益。

飼養(yǎng)管理粗放、營養(yǎng)狀況不佳是塔什庫爾干羊雙胎率低的重要原因。因此，塔什庫爾干母羊在配種前要保證足夠的營養(yǎng)供給，維持良好的體況，以此來提高母羊受胎率。在塔什庫爾干羊母羊妊娠期和產(chǎn)羔后需要加強(qiáng)營養(yǎng)，以滿足母羊妊娠及哺乳雙羔的營養(yǎng)需要，提高羔羊成活率。

綿羊FecB基因分型多采用SSCP 和PCRRLFP 分析，HRM 是近些年興起的用于擴(kuò)增子的特異性研究的新技術(shù)。利用HRM 和PCR-RLFP對綿羊多胎主效基因FecB基因進(jìn)行檢測，具有準(zhǔn)確、高效、自動化程度高等特點(diǎn)，可以在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模群體多胎基因檢測[11]。引物的不同長度、不同濃度以及不同鎂離子濃度、不同模板濃度都會對HRM 分型產(chǎn)生影響。本研究中，最佳的HRM 分型條件為PCR 擴(kuò)增片段在115bp、引物添加量為0.6μL、鎂離子濃度的最佳添加量在2.4～3.2mmol/L 和反應(yīng)模板濃度50ng，這與蔣立斌等[11]研究相符，能夠準(zhǔn)確地檢測FecB基因突變的不同類型，滿足高靈敏度、高通量、高準(zhǔn)確性的要求。

4 結(jié)論

利用HRM 和PCR-RLFP 技術(shù)可以在塔什庫爾干羊群體中檢測到FecB基因，雖未發(fā)現(xiàn)純合型基因，但也可以利用FecB基因檢測技術(shù)對塔什庫爾干羊進(jìn)行早期選種，縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，培育塔什庫爾干羊多胎類型。還可以選擇多胎性好的種公羊個體，通過多胎性狀雜交導(dǎo)入，提高塔什庫爾干羊群體中多胎FecB基因的比例，使群體的多羔率增加。此外，要加強(qiáng)母羊在配種與妊娠期間的營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理，克服高寒高海拔生態(tài)環(huán)境的影響，提高受胎率和羔羊成活率，有效增加塔什庫爾干羊的繁殖性能。