單細胞轉錄組測序技術在動物生產中的應用

文│詹湉湉（福建省莆田市荔城區(qū)畜牧站）

單細胞轉錄組測序技術是對單細胞mRNA進行測序的技術，自2009年首次問世，期間不斷發(fā)展，由于其能彌補傳統(tǒng)高通量測序的局限性，對單個細胞進行無偏倚、高通量和高分辨率的轉錄組分析，逐漸成為測序領域最為關注的新技術之一。近幾年，隨著科技的發(fā)展和人們認識水平的不斷提高，測序成本不斷降低，測序技術的穩(wěn)定性和測序通量持續(xù)提高，單細胞轉錄組測序技術被廣泛用于解析腫瘤異質性、免疫微環(huán)境、神經系統(tǒng)及發(fā)育系統(tǒng)等復雜環(huán)境的研究，但在動物生產研究中的應用較少。

一、單細胞測序技術的優(yōu)勢

細胞是人體和其他生物體形態(tài)結構、生理功能和生長發(fā)育的基本單位，在生物體中起著極其重要的作用。Robert Hooke在1665年第一次使用“細胞”這個詞來形容機體組成以后，細胞就成為大家關注的“焦點”。在二代測序（next-generation sequencing，NGS）還未興起之前，人們一直使用傳統(tǒng)的測序方法，這種傳統(tǒng)的測序方法由于只能得到許多細胞的平均值，無法對少量細胞進行分析，它不能反映樣品中所有細胞或者某群細胞特有的狀態(tài)。但對于多細胞生物來說，細胞與細胞之間也存在差異，同一個體細胞雖然具有基本相同的基因組，但其中每種細胞類型和細胞所表達的RNA卻具有惟一性。往往會因為基因組或者轉錄組上的細微差異導致機體功能上的較大差別。而單細胞測序可以完美地解決這個問題，它可以檢測單個細胞間異質性。也正是因為有了單細胞測序技術的出現，人們才能對組織中的單個細胞進行測序，獲得單細胞水平的轉錄組或基因組圖譜，對不同物種的細胞組成結構、細胞相似程度、標記基因的特異性和保守性等進行比較，解析單細胞的生物特性。

二、單細胞分離技術

從微生物培養(yǎng)菌落或病原微生物所感染的組織中分離出單個細胞是單細胞測序（Single Cell Sequencing，SCS）的第一步，是試驗中極為重要的一個步驟。由于不同組織或者同一組織不同時期，其解離動力存在差異，因此，要成功獲取細胞懸液并不是一項容易的工作，要根據不同的情況選擇合適的獲取技術，下面介紹一下目前常用的單細胞分離技術。

1.高通量分離技術。

（1）微流控技術（microfluidics）。微流控技術是指把生物學、化學等試驗的基本操作過程集成到一塊芯片上，該技術被人們形象地稱為“芯片上的實驗室”，其細胞培養(yǎng)方式分為“二維”和“三維”兩種培養(yǎng)方式。微流控技術可以精確篩選細胞，具有高靈敏度、高通量等特點，為單細胞的研究開辟了新道路。

（2）熒光激活細胞分選術（Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS）。熒光激活細胞分選法是依據細胞表面特異性分子標志或細胞光散射的特性，通過流式細胞儀分選出單個細胞或某些特殊細胞群的技術。熒光激活細胞分選技術能特異性地分選細胞，具有精確度高、通量高、操作靈活等優(yōu)點，是目前較為有效且經濟的方法。

（3）免疫磁珠分離法（magnetic activated cell sorting，MACS）。免疫磁珠分離技術是利用磁珠將細胞表面抗原與特定的單克隆抗體結合來快速分離目標細胞，這一技術廣泛運用于分離基因、靶細胞及造血干細胞等。

2.低通量分離技術。

（1）有限稀釋法技術（Limiting dilution）。有限稀釋法技術也被稱為連續(xù)稀釋法，是根據細胞培養(yǎng)原理，將單細胞樣本通過倍比稀釋制成濃度不同的細胞懸液，是最簡單、最粗糙的分離方式。該方法無需特殊裝置，擁有相對獨立性，操作簡單方便、成本低等優(yōu)點，但操作較為費時，容易丟失細胞，難以控制分離質量，不適合用于分離復雜的細胞樣本。目前主要應用于不同組織的細胞克隆形成分析。

（ 2 ） 顯 微 操 作 法 技 術（Micromanipulation）。顯微操作法是結合高倍倒置顯微鏡，采用機械顯微操作儀直接分離單個細胞的技術。該方法具有操作簡單靈活、成本低等優(yōu)點，但對操作人員的技術要求較高，且耗時長。一般適合少量樣品的分離，如從造血干細胞、胚胎細胞或微生物中提取所需要的單細胞。

（3）激光捕獲顯微切割法技術（Laser Capture Microdissection，LCM）。激光捕獲顯微切割法是借助顯微鏡，利用激光從固定組織切片中準確分離、提取單個細胞的技術。該技術具有獲取速度快、準確性高等優(yōu)點，目前此技術較多應用于疾病研究、診斷中。

三、單細胞測序在動物生產中的應用

隨著單細胞轉錄組測序技術的發(fā)展，越來越多的研究者開始將這一技術引入到動物生產研究中。

1.動物繁殖性能。動物繁殖力是指動物繁衍后代的能力，動物繁殖能力是衡量動物生產性能的重要指標之一，在動物生產經濟效益中起主導地位，種畜的繁殖力直接影響生產力水平。睪丸發(fā)育、精子生成極大影響了雄性動物的繁殖能力，卵細胞的形成也是雌性動物繁殖的關鍵過程之一。利用單細胞轉錄組測序技術，通過特定基因從杜洛克公豬睪丸細胞中鑒定了20個細胞類群，發(fā)現一個未確定過的細胞類群，這一研究揭示了豬睪丸與細胞類型之間的相關性。通過分析鑒定了綿羊生殖細胞幾個階段特異性標記基因的研究，從4個不同的精原細胞亞群中分離、鑒定了未分化和分化精原細胞新的細胞表面標記物，分別是CD99和PODXL2。利用單細胞轉錄組測序技術從小鼠新生卵巢中分離提取出單個生殖細胞，經測序，將生殖細胞囊腫、卵泡、囊腫破裂等3種細胞狀態(tài)分成3個細胞類群，這一發(fā)現為后續(xù)研究鑒定影響卵泡形成和發(fā)育的相關基因以及分子通路奠定了良好的基礎。利用單細胞轉錄組測序技術從牦牛卵母細胞中識別鑒定出差異性標記基因，揭示了代謝通路在卵母細胞成熟過程中發(fā)揮著關鍵調控作用。單細胞轉錄組測序技術的出現與發(fā)展可以更精準地從精子發(fā)生和卵母細胞形成等過程中獲得異質性細胞，可以對細胞參與的相關進程機制進行更加準確的解讀，同時對其細胞不同發(fā)育階段和動態(tài)變化有了更好地把握，也為提高動物繁殖力和治療動物或人類的生殖疾病提供了參考。

2.動物生長性能。動物生長性能直接影響畜牧業(yè)的經濟效益。由于單細胞轉錄組測序技術能解構復雜組織內的細胞異質性，對揭示器官、組織及胚胎發(fā)育過程的異質性具有很好的優(yōu)勢，現在越來越多的研究人員開始利用scRNA-seq對動物生長性能進行研究。人采用單細胞測序技術從絨山羊毛乳頭細胞中成功獲得17個主要細胞類群信息，經過基因差異表達分析，篩選獲得SOX2、FGF7、APOD等絨山羊毛乳頭細胞特異性標記基因，該研究不僅證實了單細胞測序技術能準確、高效地鑒定出特異性基因，還為未來研究影響毛囊發(fā)育的相關基因及調控機制提供了更多可能，且對培育畜禽品種具有很好的理論指導作用。通過單細胞測序技術對天祝白牦牛生長期毛囊進行研究，成功從天祝白牦牛中鑒定出其生長期毛囊發(fā)育過程中涉及的表皮細胞、毛干細胞、角質細胞、真皮細胞、DP細胞、內根鞘細胞及伴隨層細胞，并詳細描述了毛囊發(fā)育的分化軌跡，揭示了天祝白牦牛生長期毛囊發(fā)育的異質性。何亭漪利用單細胞轉錄組測序技術對呼倫貝爾短尾羊和烏珠穆沁羊16天胚胎進行研究發(fā)現，呼倫貝爾草原短尾16天胚胎發(fā)育的細胞類群有8種，烏珠穆沁羊16天胚胎發(fā)育的細胞類群有13種?？蒲姓哌€在短尾羊發(fā)育過程中篩選出TGF、Hippo、WNT等多信號通路共同協(xié)作調控尾部發(fā)育，并首次發(fā)現間充質細胞向脊索細胞轉化是參與尾部形成的重要發(fā)育過程。

3.人畜共患病。因單細胞測序技術可以研究細胞特異性，能精準檢測出原蟲胞間的微小變異情況，該技術在寄生蟲領域中也逐漸普及。借助scRNA-seq，通過數據集成、聚類和軌跡分析篩選出與蚊子中腸和唾液腺中瘧原蟲子孢子化過程密切相關的差異性基因。通過單細胞轉錄組測序技術對37和40℃條件下培養(yǎng)的瘧原蟲進行研究，揭示了瘧原蟲群體內部和細胞間異質性的變化，為深入研究致病機理和耐藥性的出現機制提供了理論依據。

四、展望

隨著單細胞轉錄組測序技術的發(fā)展，該技術已在人和動物為主的醫(yī)學領域得到了廣泛應用，相信越來越多的科研人員將利用單細胞轉錄組測序技術對動物生長和生產性能進行更深入的研究，篩選出控制優(yōu)良性狀的特異性基因，縮短育種進程，提高育種繁殖效率，實現DNA水平上的品種選育，為提高動物生長性能，增強機體免疫力，改善肉質品質，促進畜牧業(yè)高質量發(fā)展提供新思路、新技術。