基于TLR4/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路探討桑杏湯對(duì)急性肺損傷作用機(jī)制

程 慧,宋 僑

(襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 襄陽(yáng) 441000)

機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激失衡是造成急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)的主要原因,臨床表現(xiàn)為肺水腫、咳嗽咳痰、胸悶[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中急性肺損傷以對(duì)癥治療為主,如予以氨溴索注射液祛痰止咳,糖皮質(zhì)激素抗炎[3]。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療肺部疾病經(jīng)驗(yàn)豐富,可以通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)發(fā)揮療效[4]。

桑杏湯由桑葉、貝母、杏仁等8味中藥組成,常用于治療肺部疾病,具有潤(rùn)肺止咳,清宣溫燥等功效。主要有效成分為苦杏仁苷、綠原酸、貝母素A、貝母素B、蘆丁等[5]。本研究以桑杏湯組方為基礎(chǔ),結(jié)合其有效成分,以細(xì)胞因子釋放為切入點(diǎn),以急性肺損傷大鼠的炎性介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路的影響為研究對(duì)象,探討該組方對(duì)ALI的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品

桑杏湯組成:桑葉3g,梔子皮3g,梨皮3g,香豉3g,浙貝母3g,沙參6g,杏仁6g。除梨皮外所有飲片購(gòu)自襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院,經(jīng)專(zhuān)家鑒定為正品,正常煎煮濃縮至50mL,相當(dāng)于生藥0.54g/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥:甲潑尼龍片(批號(hào):202603,天津天藥藥業(yè)有限公司)。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠40只,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SYXK(鄂)2019-0009。

1.3 儀器與試劑

離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南御華科技公司),顯微鏡(梅特勒中國(guó)公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)BeckmanCourt公司),脂多糖(LPS)液(美國(guó)艾斯本技術(shù)有限公司,批號(hào):AS1044),白細(xì)胞介素-6(IL-6),大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β),蘇木素-伊紅HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)G1220);腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào):080831,091071,080621),兔抗NF-κB,TLR4,ICAM-1(美國(guó)ABCAM公司,貨號(hào):AB29849,AB17191,MRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR試劑盒(上海生工生物科技有限公司);由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成的ICAM-1、TLR4、NF-κB引物。

2 方法與給藥

2.1 動(dòng)物造模與評(píng)價(jià)

2.1.1 動(dòng)物分組與 ALI模型 40只雄性大鼠進(jìn)行7天適應(yīng)性喂養(yǎng),共分為4組,每組10只,分別為空白對(duì)照組、模型組、桑杏湯組和甲潑尼龍組。各組大鼠除空白對(duì)照組外,均采用LPS的腹腔注射方法建立ALI模型[6-7]?？瞻讓?duì)照組和模型組給予0.9%生理鹽水,甲潑尼龍溶液濃度配置為0.4mg/mL,每組大鼠用1mL/100g的給藥容積進(jìn)行灌胃。

2.1.2 支氣管黏膜病理學(xué)檢查 4組每組隨機(jī)抽取3只鼠類(lèi)處死,取出支氣管黏膜,生理鹽水沖洗干凈,擦干后固定在10%福爾馬林溶液中,浸蠟脫水,包埋脫蠟切片,洗脫不同梯度乙醇,染色脫水封片,對(duì)氣管支氣管黏膜病理學(xué)變化進(jìn)行顯微鏡下觀(guān)察。

2.2 血清炎癥因子檢測(cè)

白細(xì)胞介素-6(IL-6),白細(xì)胞介素-1β (IL-1β),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,按ELISA法在血清中檢測(cè)。

2.3 Western Blot法定量檢測(cè)TLR4/NF-κB/ICAM-1蛋白的表達(dá)方法

將肺組織切碎,勻漿,裂解,離心,電泳,加一抗4℃隔夜孵育,然后用TBST緩沖液洗凈,再加相應(yīng)的二抗,然后再用TBST洗滌洗凈。利用化學(xué)發(fā)光法顯色,用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值,以各樣品與對(duì)應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值來(lái)表示蛋白質(zhì)相對(duì)含量。

2.4 PCR法檢測(cè)TLR4/NF-κB/ICAM-1mRNA水平

采用TRIzol法先提取出大鼠肺部細(xì)胞中總RNA,并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA,再以cDNA為模板,利用RT-qPCR法進(jìn)行DNA擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件設(shè)置為50℃ 1min,95℃ 8min,95℃ 10s,60℃ 33s,40個(gè)循環(huán)。繪制溶解曲線(xiàn),用2-△△Ct法繪制溶解曲線(xiàn)并進(jìn)行資料分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 各組鼠肺組織HE染色結(jié)果

在空白對(duì)照組中觀(guān)察大鼠支氣管黏膜病理形態(tài)學(xué)變化,可發(fā)現(xiàn)大鼠支氣管上皮細(xì)胞完整,各層結(jié)構(gòu)清楚,沒(méi)有炎癥細(xì)胞;炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可見(jiàn)于模型組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞周?chē)?大鼠氣管支氣管黏膜炎癥浸潤(rùn)桑杏湯組和甲潑尼龍組,上皮細(xì)胞病變較模型組明顯減輕,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠氣管支氣管黏膜組織發(fā)生的病理改變

3.2 支氣管炎大鼠血清炎性因子受桑杏湯影響

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)(P<0.05,P<0.01)含量均有明顯增加;桑杏湯組和甲潑尼龍組與模型組相比,大鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(P<0.05,P<0.01)的含量均有明顯下降,具體情況見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

3.3 桑杏湯對(duì)各組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響(TLR4,NF-κB,ICAM-1)

與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB和ICAM-1的蛋白質(zhì)灰度值和陽(yáng)性表達(dá)率均有較大幅度上升(P<0.05,P<0.01);桑杏湯組、甲潑尼龍組大鼠肺組織與模型組相比,TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽(yáng)性表達(dá)率均有較大幅度的降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 各組大鼠肺組織的水平比較(TLR4、NF-κB和ICAM-1)

3.4 桑杏湯對(duì)各組大鼠肺組織(TLR4,NF-κB和ICAM-1)mRNA的表達(dá)

與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織中的NF-κB、TLR4和ICAM-1三種mRNA表達(dá)方式有顯著提高(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,NF-κB、TLR4和ICAM-1三種mRNA表達(dá)方式在甲潑尼龍組和桑杏湯組的大鼠肺組織中明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 大鼠肺組織中的TLR4、NF-κB和ICAM-1mRNA在各組的表達(dá)

4 討論

中醫(yī)治療肺病經(jīng)驗(yàn)豐富,源遠(yuǎn)流長(zhǎng),如張仲景創(chuàng)制的射干麻黃湯、小青龍湯、麥門(mén)冬湯等[8],起源于清代吳鞠通所著《溫病條辨》的桑杏湯,具有止咳平喘、輕宣溫燥等功效,是治療溫燥病證的經(jīng)典方。臨床中多用于治療肺燥咳嗽、脈浮數(shù)、舌紅少津等證。方劑由桑葉、杏仁、香豉、沙參、梔子、象貝、梨皮組成,其中桑葉、杏仁為主藥,有效成分為苦杏仁苷、蘆丁、貝母素甲、貝母素乙、綠原酸等,具有鎮(zhèn)咳平喘、抗菌、消炎、抗氧化等功效[9-10]。

TLRS受體與I型白細(xì)胞介素受體結(jié)構(gòu)同源,同時(shí)具有相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,因此在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中具有極其重要的作用[11]。TLR4是TLRs受體之一,為識(shí)別脂多糖主要受體[12]。當(dāng)TLR4受到LPS的持續(xù)刺激而激活下游的NF-κB信號(hào)通路樞紐位置時(shí)[13],NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,而細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員,有研究表明ICAM-1的表達(dá)受NF-κB調(diào)控。故當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥感染后,NF-κB 調(diào)控相關(guān)炎性因子并使其誘導(dǎo)、活化,促使相關(guān)抗原陽(yáng)性白細(xì)胞黏附于ICAM-1 陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞表面,進(jìn)一步到達(dá)炎癥組織,促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移和趨化進(jìn)而導(dǎo)致 IL-1β、IL-6、 TNF-α等炎癥因子過(guò)度表達(dá)與分泌[14]。

本研究中,大鼠經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,大鼠的炎癥因子 IL-1β 和 IL-6、TNF-α的明顯過(guò)度分泌。研究發(fā)現(xiàn),IL-1β通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[15],而 IL-6 是一種促炎細(xì)胞因子,能夠直接參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),TNF-α是炎癥啟動(dòng)因子,能夠誘導(dǎo)、上調(diào)炎癥細(xì)胞因子與趨化因子,促使炎癥細(xì)胞侵入感染部位。

本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)法對(duì)大鼠外周血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量進(jìn)行LPS誘導(dǎo)支氣管炎模型檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑杏湯組能有效降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。采用Western Blot 和定量考察炎性介質(zhì) TLR4、NF-κB 和 ICAM-1等蛋白在模型大鼠肺組織中的表達(dá)情況,桑杏湯組肺組織中TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白和mRNA表達(dá)水平與模型組相比明顯減少。同時(shí)HE染色結(jié)果也表明桑杏湯組可以減少肺組織的炎性浸潤(rùn),緩解氣道和肺部炎癥癥狀。