大豆COBRA 基因家族鑒定與分析*

張濱爍，趙婉婷，張嘉嘉，李青峰，張璐璐，梁雪玉，蘇安玉，于振海，李松竹，武小霞，趙瑩**

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省依安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 齊齊哈爾 161500；3.黑龍江省蘿北縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 鶴崗 154100）

大豆作為植物蛋白、食用油脂和蛋白飼料，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。隨著人們生活水平提高和養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，我國豆油和飼料需求量逐年攀升，亟需提高大豆產(chǎn)量滿足需求。傳統(tǒng)育種方法耗時長、改良效果不確定，難以滿足實際生產(chǎn)需求[2]。轉(zhuǎn)基因生物育種技術(shù)可縮短育種年限，實現(xiàn)大豆定向改良，為大豆產(chǎn)量提高提供了新思路[3]。

Sharma 等[4]研究表明，植物再生通過一系列定向細胞的分裂和細胞壁擴張完成。不同大豆品種再生能力與其細胞壁擴張能力和細胞分裂分化密切相關(guān)。因此，深入探究大豆再生分子機制，對實現(xiàn)大豆轉(zhuǎn)基因有效應(yīng)用和大豆定向育種改良，提高大豆產(chǎn)量具有重要意義。

植物細胞壁為動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可為植物提供機械支撐、維持細胞形狀，還可控制細胞擴增[5]。纖維素伸展方向決定細胞形狀和生長方向[6]。Roudier 等[7]研究發(fā)現(xiàn)COBRA 基因在纖維素生物合成中發(fā)揮重要作用，可影響細胞擴展方向。COBRA 基因家族通過編碼糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白參與細胞定向生長和纖維素生物合成[8]。作為GPI 錨定蛋白，COBRA 蛋白除包含CCVS 結(jié)構(gòu)域、N-末端信號肽和纖維素結(jié)合位點外，還含有關(guān)鍵疏水C-末端GPI 錨定位點ω[9]。當GPI 修飾位點被修飾后，GPI 錨定蛋白被分泌至高爾基體囊泡中，后在質(zhì)膜上調(diào)節(jié)纖維素鏈的組裝及合成[5]，一些GPI 錨定蛋白通過蛋白水解酶水解最后被釋放于細胞膜外[10]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，COBRA 家族基因的多個成員參與細胞壁纖維素生物合成，在多種細胞生長發(fā)育過程中起重要調(diào)節(jié)作用。如COBRA 基因參與根的伸長和根毛生長，參與花粉管伸長等過程[11-12]。在玉米中，COBRA 基因參與次級細胞壁生物合成，其缺失可影響細胞壁中纖維素合成，對bk2-Mu7突變體的研究表明，該基因突變可影響纖維素在細胞壁中的沉積，從而影響玉米莖的強度[13]。在水稻中，Bc1 和纖維素合成酶在纖維素合成不同生物過程中均發(fā)揮作用，Bc1 與纖維素合成酶相互作用，共同影響纖維素結(jié)晶度，從而影響纖維素組裝過程[14]。在棉花中，GhCOBL8A 可促進細胞伸長和細胞壁增厚[15]。此外，在番茄中，過表達COBRA 基因可增強果實厚度并延長保鮮期[16]。在楊樹的芽尖器官中發(fā)現(xiàn)COBRA 基因高度表達，表明其可能參與植物細胞擴增[17]。以上研究表明COBRA 基因在不同植物生長發(fā)育過程中具有多種不同功能，為深入研究其作用機制提供了新思路。

最新研究表明，COBRA 基因在植物生長發(fā)育及再生過程中發(fā)揮重要作用。目前已在擬南芥[9]、水稻[18]、玉米[19]等植物中鑒定出一定數(shù)量的COBRA 家族基因成員，但對大豆COBRA 家族成員的研究報道較少。本文利用生物信息學方法對大豆COBRA 家族基因（GmCOBRAs）進行全基因組水平鑒定，對COBRA 家族基因成員理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、保守結(jié)構(gòu)、種內(nèi)共線性及組織表達量等進行分析，以期為深入探究COBRA 基因在大豆生長發(fā)育和再生過程中的作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

大豆東農(nóng)50、Keburi 和煙草（本氏煙草（Nicotiana benthamiana））均由東北農(nóng)業(yè)大學大豆遺傳育種實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）叢生芽誘導培養(yǎng)基（SIM）：3.21 g B5 鹽+0.6 g MES + 30 g 蔗糖，pH 5.6 滅菌后加入0.321 g/L B5 維生素和1.67 mg/L 6-BA；（2）叢生芽伸長培養(yǎng)基（SEM）：4.33 g MS + 0.6 g MES + 30 g 蔗糖，pH 5.6滅菌后加入0.321 g/L B5 維生素、0.1 g/L IAA、0.1 g/L GA3、0.1 g/L Glu 和0.1 g/L Asp。

1.1.3 儀器材料

試劑盒（OMEGAPlantRNAKit（50），R6827-01），上海索萊寶科技有限公司； 超微核酸分析儀（Nanodrop 2000），美國賽默飛世爾科技有限公司；諾唯贊HiScript R II Q RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）試劑盒（R223-01），南京諾唯贊生物科技有限公司；羅氏LightCycler480 實時熒光定量PCR 儀，美國羅氏制藥有限公司；諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（Q711-02），南京諾唯贊生物科技有限公司； KOD One 酶（KMM-101），上海根生生物科技有限公司。

1.1.4 其他材料

試驗中的氨基酸序列、基因組注釋文件和基因組序列分別來自以下網(wǎng)站：大豆基因組數(shù)據(jù)庫（www.soybase.org）；植物基因組學數(shù)據(jù)庫（Phytozome（doe.gov））； NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih .gov）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（SIB Swiss Institute of Bioinformatics|Expasy）；CELLO2.5（www.csbio.sjtu.edu.cn）；Williams 82。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆COBRA 基因家族成員鑒定

（1）以已發(fā)表的擬南芥COBRA 基因氨基酸序列為查詢目標在植物基因組學數(shù)據(jù)庫（Phytozome（doe.gov））和NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST 比對。下載具有高度一致性（＞90%）和最低值（e＜10-10）的大豆COBRA 基因氨基酸序列。（2）進一步確認大豆COBRA 基因家族成員。檢索PFAM 數(shù)據(jù)庫中COBRA 結(jié)構(gòu)域的存在[20]，按照大豆COBRA 家族基因在大豆染色體組上從小到大的位置進行排序。（3）從大豆基因組數(shù)據(jù)庫（www.soybase.org）收集大豆COBRA 基因家族成員所有遺傳信息，包括染色體位置、CDS 長度、蛋白質(zhì)長度。（4）使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（SIB Swiss Institute of Bioinformatics|Expasy）分析大豆COBRA 基因家族成員分子量和等電點大小。（5）采用CELLO2.5（www.csbio.sjtu.edu.cn）對大豆COBRA 蛋白亞細胞位置進行預測。

1.2.2 大豆、水稻、擬南芥和玉米COBRA 基因家族進化樹分析

從植物基因組學數(shù)據(jù)庫（Phytozome（doe.gov））下載大豆、水稻、擬南芥和玉米的COBRA 基因家族氨基酸序列，采用Clustal W 進行氨基酸序列多重比對[21]。采用MEGA5.0 軟件將比對數(shù)據(jù)進行1 000 次重復構(gòu)建無根進化樹，通過iTOL（https://itol.embl.de/）網(wǎng)站進行進化樹美化和保守結(jié)構(gòu)域分布可視化處理。

1.2.3 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序分析

從植物基因組學數(shù)據(jù)庫（Phytozome（doe.gov））下載大豆基因組.gff3 注釋文件，通過基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器對大豆COBRA 外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行分析，使用TBtools 軟件對大豆COBRA 基因家族進行基因結(jié)構(gòu)可視化處理[22]。采用MEME 在線網(wǎng)站對大豆COBRA 基因家族成員蛋白質(zhì)保守基序進行分析（參數(shù)為maximum number of motifs = 10，optimum width = 6～100）[23]，使用TBtools 對其進行可視化處理[22]。

1.2.4 大豆COBRA 基因家族組織表達量分析

從植物基因組學網(wǎng)站（Phytozome（doe.gov））下載大豆COBRA 基因家族成員的根、莖、葉、花、種子和莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Excel 表格進行處理。表達量數(shù)據(jù)使用Log2進行均一化處理，采用TBtools 熱圖軟件進行數(shù)據(jù)可視化處理[22]。

1.2.5 大豆COBRA 基因家族實時熒光定量PCR

以再生能力強的東農(nóng)50 和再生能力弱的Keburi叢生芽誘導第0、3、14 d（SIM-0、SIM-3、SIM-14）和叢生芽伸長第3、5、14 d（SEM-3、SEM-5、SEM-14）為材料，選取6 個在種子中表達量較高的基因進行qRT-PCR 分析。

使用試劑盒（OMEGA Plant RNA Kit（50），R6827-01）進行組織部位RNA 提取，使用超微核酸分析儀（Nanodrop 2000）對提取的RNA 進行濃度和純度測定。對提取的RNA 利用諾唯贊HiScriptRII Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（R223-01）反轉(zhuǎn)錄成cDNA 單鏈。使用Primer 3 Plus（Primer3Plus-Pick Primers）中的Primer-BLAST 工具對大豆COBRA 基因進行特異性引物篩選，隨后使用BLAST 工具驗證序列。采用羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR 儀和諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（Q711-02）對不同時期大豆組織部位COBRA 基因表達水平作相對定量分析。以ACTIN4 為內(nèi)參基因，每個樣品3 次重復，以叢生芽誘導第0 d 為對照，采用2-ΔΔCT方法[24]分析qRT-PCR 結(jié)果。所用引物見表1。

表1 目的基因擴增及實時熒光定量PCR 引物

1.2.6 大豆COBRA 基因家族共線性及染色體位置分析

在大豆基因組網(wǎng)站（Phytozome（doe.gov））獲得大豆全基因組序列文件，使用TBtools 對其進行共線性分析，采用TBtools 進行可視化處理[22]。在Williams 82 大豆參考基因組數(shù)據(jù)庫中確定24 個大豆COBRA 基因在染色體上的位置，采用TBtools進行可視化處理[22]。

1.2.7 GmCOBRA21 基因擴增及煙草亞細胞定位

利用Snapgene 軟件確定EcoRⅠ和BamHⅠ這2 個酶切位點，將目的基因CDS 片段完全連接至Fu28 載體上。去掉目的基因CDS 終止密碼子后利用諾唯贊同源重組網(wǎng)站（入門克隆（vazyme.com））設(shè)計引物（見表1）。以東農(nóng)50 種子cDNA 為模板，使用KOD One 酶（TOYOBO，上海）進行擴增（PCR反應(yīng)條件見表2）。對擴增產(chǎn)物膠回收后同源重組連接至Fu28 線性化入門載體上，使用大腸桿菌DH5α 進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌落PCR 鑒定后選取陽性菌落提取質(zhì)粒。將陽性質(zhì)粒經(jīng)LR 反應(yīng)連接至pSOYⅠ表達載體上，經(jīng)菌落PCR 鑒定將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105 中，將構(gòu)建好的載體命名為pSOYⅠ-GmCOBRA21。

表2 KOD One PCR 反應(yīng)條件

利用農(nóng)桿菌介導法將構(gòu)建好的表達載體pSOYⅠ-GmCOBRA21 轉(zhuǎn)入本氏煙草（Nicotiana benthamiana）進行蛋白表達。在培養(yǎng)箱中對本氏煙草培養(yǎng)2 d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達情況[25]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用T 檢驗進行顯著性分析，其中“**”代表P＜0.01，“*”代表P＜0.05，I-0 時期為試驗對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆COBRA 基因家族鑒定及分析

利用擬南芥COBRA 蛋白氨基酸序列在大豆基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，刪除重復序列后進行Pfam 分析，最終獲得24 個大豆COBRA 基因家族成員。

按照其在染色體上位置從小到大順序分別命名為GmCOBRA1-24（見表3）。

表3 大豆COBRA 基因家族蛋白質(zhì)信息及亞細胞定位預測

24 個GmCOBRAs 序列長度為630～2 016 bp ，編碼氨基酸個數(shù)為210～672，分子質(zhì)量大小為22.7～74.7 ku，蛋白理論等電點為5.56～9.64。其中等電點大于7 的為19 個，等電點小于7 為5 個，表明GmCOBRAs 酸性氨基酸家族成員數(shù)量低于堿性氨基酸家族成員數(shù)量，該基因家族具有多樣性。亞細胞定位預測表明，24 個GmCOBRAs 均定位于細胞膜。

由圖1 可知，COBRA 基因家族的24 個成員不均等地分布在14 條染色體上，分別為Gm01、Gm02、Gm04、Gm05、Gm06、Gm07、Gm08、Gm09、Gm11、Gm12、Gm13、Gm17、Gm18 和Gm19。其中Gm04、Gm05、Gm06、Gm09、Gm11、Gm17 和Gm19 號染色體上的COBRA 基因位于染色體前端，Gm01、Gm07、Gm12、Gm13、Gm18 號染色體上的COBRA 基因位于染色體尾端。Gm18 號染色體上的GmCOBRA20、GmCOBRA21和GmCOBRA22 位置接近；Gm08 號染色體上的GmCOBRA11 和GmCOBRA12 位置接近；Gm06 號染色體上的GmCOBRA8 和GmCOBRA9 位置接近。

2.2 大豆COBRA 基因家族多序列比對分析

由圖2 可知，利用大豆基因組.gff3 文件在大豆中鑒定出的COBRA 基因多數(shù)具有Cys-Cys-Val-Ser保守結(jié)構(gòu)域（CCVS），這一結(jié)構(gòu)域在COBRA 家族蛋白中起關(guān)鍵作用。僅GmCOBRA6 基因無CCVS 結(jié)構(gòu)域，這表明該基因可能與COBRA 基因家族中其他成員功能不同。此外，除GmCOBRA2 外，大豆COBRA 基因含有N 末端信號肽，這表明由這些基因編碼的蛋白質(zhì)可能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入分泌途徑，或者定位于質(zhì)膜。

圖2 大豆COBRA 基因家族氨基酸多序列比對

2.3 大豆COBRA 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖3 可知，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，大豆COBRA蛋白可分為與擬南芥、玉米和水稻的COBRA 家族基因相同的2 個亞家族[11,14,26]。第Ⅰ亞家族（CLUSTERⅠ）共有7 個GmCOBRA 基因，第Ⅱ亞家族（CLUSYER Ⅱ）共有17 個GmCOBRA 基因。其中，第Ⅰ亞家族與AtCOBRA8、AtCOBRA5、AtCOBRA10、AtCOBRA7 和AtCOBRA4 相似度較高； 第Ⅱ亞家族與AtCOBRA9、AtCOBRA11、AtCOBRA2、AtCOBRA6、AtCOBRA12、AtCOBRA1和AtCOBRA3 相似度較高。結(jié)果表明，大豆COBRA家族基因數(shù)目約為擬南芥COBRA 基因的2 倍。

圖3 大豆、擬南芥、玉米和水稻COBRA 蛋白系統(tǒng)進化樹

2.4 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

為深入了解大豆COBRA 基因家族結(jié)構(gòu)多樣性與系統(tǒng)發(fā)育之間關(guān)系，研究采用TBtools 工具繪制GmCOBRAs 基因內(nèi)含子和外顯子模型（見圖4）。由圖4 可知，GmCOBRAs 亞族的外顯子和內(nèi)含子大小和數(shù)量不同。第Ⅱ亞族外顯子平均長度較長，且包含6 個外顯子；第Ⅰ亞族外顯子較短，數(shù)量較少，為2～3 個。同時，同一亞族成員均具有相似外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這種高度保守基因結(jié)構(gòu)影響其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明，COBRA 基因家族在大豆中具有較高的結(jié)構(gòu)多樣性和進化分化，說明這些基因在大豆中具有重要的生物學功能。

圖4 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 大豆COBRA 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

由圖5 可知，大豆COBRA 家族基因包含10 個保守基序，分別為Motif 1-10。24 個大豆COBRA家族基因均包含Motif 2 和Motif 6，其中Motif 2保守基序中含有一個高度保守的CCVS 氨基酸序列。

圖5 大豆COBRA 基因家族蛋白質(zhì)保守基序分析

結(jié)果表明，大豆COBRA 基因家族多樣性與保守基序分布及結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.6 大豆COBRA 基因家族共線性分析

在植物進化過程中，基因復制和現(xiàn)存基因保留使得植物基因組不斷擴大。由圖6 可知，在20 條大豆染色體上，大豆COBRA 家族基因共發(fā)生23 次復制事件。由基因位置分析可知，GmCOBRA21 是由串聯(lián)復制產(chǎn)生的，其中GmCOBRA2 基因未發(fā)生基因復制事件，表明在大豆COBRA 基因擴增中，片段復制比例大于串聯(lián)復制比例。

圖6 大豆COBRA 基因家族共線性分析

2.7 大豆COBRA 基因家族組織表達模式分析

由圖7 可知，GmCOBRAs 具有不同表達模式。例如GmCOBRA7 和GmCOBRA24 在根、莖、葉、花、種子和莢這6 個器官和組織中均有表達。GmCOBRA20、GmCOBRA18 和GmCOBRA10在所分析的組織中表達水平較低。GmCOBRA4、GmCOBRA6 和GmCOBRA13 在種子中高度表達，表明其在種子發(fā)育中具有重要作用。GmCOBRA14、GmCOBRA1 、GmCOBRA13 、GmCOBRA18 、GmCOBRA7 、GmCOBRA22 、GmCOBRA19 、GmCOBRA2、GmCOBRA16 和GmCOBRA23 在根中高度表達，表明其在根的伸長和根毛生長過程中發(fā)揮作用。GmCOBRA12、GmCOBRA22 和GmCOBRA14 在所分析的組織中表達水平較高，表明這些基因在大豆整個發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用。結(jié)果表明，24 個GmCOBRAs 至少在一個組織中表達，表明COBRA 基因家族在不同大豆組織和器官中均發(fā)揮功能。

圖7 大豆COBRA 基因家族表達模式分析

基因調(diào)控對植物再生起關(guān)鍵作用。東農(nóng)50 器官發(fā)生叢生芽誘導和叢生芽伸長表型圖如圖8 所示。由圖9 可知，6 個GmCOBRAs 在叢生芽誘導和伸長不同時期存在表達差異，其中GmCOBRA9、GmCOBRA13 、GmCOBRA4 、GmCOBRA20 和GmCOBRA6 在叢生芽伸長階段的表達量較高，GmCOBRA21 在叢生芽誘導和叢生芽伸長階段顯著表達。在叢生芽誘導第14 d 和叢生芽伸長第14 d時，GmCOBRA21 表達量顯著上調(diào)。結(jié)果表明，大豆COBRA 基因在大豆再生過程中發(fā)揮作用。

圖8 東農(nóng)50 器官發(fā)生叢生芽誘導和叢生芽伸長表型圖

圖9 大豆COBRA 家族基因叢生芽誘導和叢生芽伸長qRT-PCR 結(jié)果

2.8 GmCOBRA21 基因克隆及亞細胞定位分析

通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，GmCOBRA21 基因在叢生芽誘導和伸長階段的表達量顯著上升，因此選擇該基因進行功能驗證。通過對東農(nóng)50 種子cDNA進行克隆，成功獲得預期大小條帶（見圖10（a）），將回收產(chǎn)物連接至Fu28 入門載體中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（見圖10（b））。采用序列比對過濾出比對正確質(zhì)粒，通過LR 反應(yīng)構(gòu)建pSOYⅠ-GmCOBRA21 表達載體，最終將pSOYⅠ-GmCOBRA21 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 中（見圖10（c））。

圖10 GmCOBRA21 基因克隆與PCR 檢測

pSOYⅠ-GmCOBRA21 載體如圖11（a）所示。隨后，在本氏煙草中瞬時表達該載體。通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，GmCOBRA21 定位于植物細胞膜（見圖11（c）），與預測結(jié)果一致。

圖11 pSOYⅠ-GmCOBRA21 載體構(gòu)建及GmCOBRA21 蛋白亞細胞定位

3 結(jié)論與討論

COBRA 基因是細胞擴增和纖維素合成的關(guān)鍵基因，也是植物特有基因家族[27]。前人已對擬南芥、玉米和水稻等作物中的COBRA 基因家族進行深入研究，但在大豆中的研究較少。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系將GmCOBRA 家族基因分為2個亞族，與擬南芥和玉米的COBRA 基因家族分類相似。GmCOBRA 家族基因第Ⅰ亞族成員為7 個，第Ⅱ亞族成員為17 個，類似于擬南芥COBRA 基因家族，說明COBRA 基因在不同作物中的進化相似。第Ⅰ亞族COBRA 基因與第Ⅱ亞族COBRA 基因在進化上不同，其在N 末端增加了170 個氨基酸。在基因結(jié)構(gòu)上，第Ⅰ亞族外顯子數(shù)量少于第Ⅱ亞族，結(jié)果與擬南芥相似[9]。本研究中大豆COBRA基因數(shù)量約為擬南芥COBRA 基因的2 倍（見圖3），該基因在大豆基因組的擴增源于片段復制。在已鑒定的24 個大豆COBRA 基因中，11 個大豆COBRA基因為片段性重復，這一結(jié)果與之前發(fā)現(xiàn)大豆基因組的復制主要為片段性重復一致[28-29]。

目前對于大豆再生基因報道較少，因此篩選提高大豆再生能力基因?qū)ωS富大豆再生基因網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。COBRA 基因編碼糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，在細胞壁擴張和纖維素沉積中發(fā)揮作用。作為模式植物，擬南芥COBRA 家族基因可廣泛調(diào)節(jié)花、葉片和種子的形態(tài)建成。相關(guān)研究表明，AtCOBRA10 基因突變導致花粉管變短，證實COBL10 對花粉管的定向生長具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本研究中，GmCOBRA13 在種子各發(fā)育時期均高度表達，且GmCOBRA13 與AtCOBRA10 在進化上高度同源，這也說明GmCOBRA13 可能與AtCOBRA10具有相似功能。在大豆胚胎發(fā)育過程中，纖維素對細胞擴張起關(guān)鍵作用[30]。本研究中，大豆COBRA基因在種子中表達，表明其在大豆胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮功能。Roudier 等[31]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中COBRA 家族基因通過參與纖維素的纖維取向?qū)毎麛U增產(chǎn)生重要影響，是植物發(fā)育過程中發(fā)生異性膨脹的重要因素之一。在擬南芥中，蛋白突變體植株表現(xiàn)為植株矮小、芽變小和根變粗現(xiàn)象[25]。COBRA 基因突變導致擬南芥縱向細胞伸長和細胞分裂缺陷癥狀[32]，而植物再生主要與芽和根的生長有關(guān)。以上現(xiàn)象印證了本試驗中qRT-PCR 結(jié)果，即COBRA 基因在叢生芽誘導和叢生芽伸長時發(fā)揮作用，在大豆發(fā)育過程中COBRA 基因可能通過促進根和芽的生長影響大豆再生功能。

綜上所述，在大豆基因組中共發(fā)現(xiàn)24 個COBRA 基因，這些基因不均等地分布在大豆的14 條染色體上，其中23 個GmCOBRA 基因由片段復制產(chǎn)生，GmCOBRA21 由串聯(lián)復制產(chǎn)生，表明在GmCOBRA 家族基因擴增中，片段復制比例大于串聯(lián)復制比例。通過對24 個GmCOBRA 基因的大豆基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，GmCOBRA 家族基因在植物生長發(fā)育的各個階段均可表達并發(fā)揮功能。通過大豆在叢生芽誘導和叢生芽伸長階段的qRT-PCR 分析表明，大豆COBRA 家族基因可能參與植物再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中GmCOBRA21 可能為該過程中的核心基因發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過亞細胞定位表明GmCOBRA21 定位于細胞膜。