豬圓環(huán)病毒3型近五年的研究進(jìn)展

王晶晶 王麗萍 譯自Virus Research，Vol.314（2022）：198764

唐芬蘭 校 張配配 審 孟祥光 制圖

摘 要：豬圓環(huán)病毒3型（porcine circovirus type 3，PCV3）屬于圓環(huán)病毒科，是一種無包膜、環(huán)狀、單鏈DNA病毒。豬圓環(huán)病毒屬成員最初于2016年被報道，能夠感染豬，其結(jié)構(gòu)特征、臨床癥狀、發(fā)病機(jī)制和豬感染后的免疫反應(yīng)在之后的研究中得到了進(jìn)一步的闡述。本綜述旨在總結(jié)PCV3相關(guān)研究在病毒基因組特征、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、免疫應(yīng)答和診斷方法方面的進(jìn)展。PCV3在全球各年齡段的豬上均有檢出，并與一系列臨床癥狀相關(guān)，包括多系統(tǒng)炎癥綜合征、繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征以及亞臨床感染。實驗性研究發(fā)現(xiàn)豬感染PCV3后成功地再現(xiàn)了多系統(tǒng)炎癥，但并未暴發(fā)臨床疾病。這些發(fā)現(xiàn)，再加上大量關(guān)于PCV3并發(fā)感染的報道，表明僅感染PCV3可能不足以導(dǎo)致豬出現(xiàn)明顯的臨床疾病。

目前尚未充分闡明PCV3的發(fā)病機(jī)制，也未能確定促進(jìn)病毒入侵細(xì)胞的受體，但已證實PCV3可在受感染豬的滋養(yǎng)層細(xì)胞、心肌細(xì)胞、皮膚脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元等多種類型的細(xì)胞中復(fù)制。PCV3似乎可以逃避宿主的免疫反應(yīng)，在實驗性和田間研究中，豬感染病毒42 d后會出現(xiàn)持續(xù)性毒血癥就證明了這一現(xiàn)象，不過感染豬有強(qiáng)烈的體液反應(yīng)。已經(jīng)觀察到宿主細(xì)胞因子譜和外周細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的微小差異，但毫無疑問，許多問題仍然圍繞著PCV3逃避免疫反應(yīng)的機(jī)制。

PCV3的流行病學(xué)尚不清楚，確切的傳播途徑也未有明確的描述；但PCV3可通過豬的唾液、鼻腔分泌物、糞便、初乳和公豬精液傳播，這表明了水平和垂直傳播在病毒傳播上的重要性。在牛、狗、小鼠、野豬、羚羊、狍子、蜱蟲和蚊子等眾多家養(yǎng)和野生動物中檢測到了PCV3，表明該病毒可能存在多個貯存宿主，并且可跨物種傳播。目前，PCV3診斷性試驗技術(shù)能夠?qū)CV3與其他PCV區(qū)分開來，并證實其存在于病變中。鑒于尚未對由PCV3感染引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失進(jìn)行評估，而且該病毒有可能在未來幾年內(nèi)成為豬的一種高流行性病原體，未來的研究應(yīng)側(cè)重于填補(bǔ)本綜述中發(fā)現(xiàn)的知識空白。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒3型；流行病學(xué)；臨床癥狀；發(fā)病機(jī)制；免疫反應(yīng)；診斷

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）05-0001-16

豬圓環(huán)病毒是一種小型的環(huán)狀、無包膜、單鏈DNA病毒，可自然感染豬。目前已發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒有4種，包括豬圓環(huán)病毒1型（porcine circovirus type 1，PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）和豬圓環(huán)病毒4型（PCV4）。PCV1最初被認(rèn)為是豬腎細(xì)胞系（porcine kidney cell line，PK-15）的細(xì)胞培養(yǎng)污染物而受到重視。然而，PCV1被認(rèn)為是非致病性的，因為目前沒有因自然感染而導(dǎo)致豬暴發(fā)臨床疾病的報道，也沒有在實驗性研究中重現(xiàn)。

PCV2于20世紀(jì)90年代在加拿大首次被發(fā)現(xiàn)，最初被確定為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原體。此外，PCV2還與多種臨床癥狀有關(guān)，統(tǒng)稱為PCV相關(guān)疾病（PCV-associated disease，PCVAD）。與PCV2感染相關(guān)的常見臨床表現(xiàn)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、繁殖疾病（PCV2-reproductive disease，PCV2-RD）以及豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）。盡管已有PCVAD的商用疫苗，但該病仍被認(rèn)為是全球養(yǎng)豬業(yè)中最具經(jīng)濟(jì)破壞性的疾病之一。

PCV4于2019年首次被發(fā)現(xiàn)，但有關(guān)其臨床影響和發(fā)病機(jī)制的資料仍然有限。PCV4最早在患有呼吸道疾病、腹瀉和PDNS的7周齡豬的相關(guān)樣本中被檢測到。最近的研究報道，在其他臨床表現(xiàn)的豬樣本中也分離到了PCV4，如患神經(jīng)系統(tǒng)疾病或繁殖障礙的發(fā)病豬樣本。然而，Sun等和Tian等指出，在PCV4的病例中大多數(shù)能夠同時檢測到其他多種病原體，如PCV2或PCV3等。因此，PCV4感染的臨床影響仍存在爭議。

2016年，PCV3首次在美國一家豬場的相關(guān)樣本中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時該豬場的母豬死亡率增加，出現(xiàn)了PDNS樣的病變，并伴有以受孕率下降、木乃伊胎和死胎率增加為特征的慢性繁殖障礙問題。研究人員通過免疫組織化學(xué)和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR），排除了PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）和豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）等其他并發(fā)病原體。宏基因組分析顯示，存在一種新的遺傳變異的豬圓環(huán)病毒。通過滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、PCR和桑格測序（Sanger sequencing），研究人員證實存在一種由包含2 000個核苷酸的環(huán)狀基因組組成的新型PCV。該新型PCV的衣殼氨基酸與PCV2的同源性為36％，與其他PCV的同源性低于70％。因此，該新型PCV被命名為PCV3。幾乎同時，另一報道介紹了3周齡豬出現(xiàn)病因不明的心肌炎。病毒宏基因組分析顯示存在PCV3，原位雜交證實PCV3在與心肌炎相關(guān)的心肌細(xì)胞，以及炎癥細(xì)胞和小動脈中膜中復(fù)制。

此后，PCV3成為豬的各種臨床表現(xiàn)的疑似病原體，關(guān)于該病毒的田間報道和回顧性研究遍布全球（圖1）。與PCV3感染有關(guān)的發(fā)病機(jī)制和免疫反應(yīng)也取得了進(jìn)展。本綜述旨在總結(jié)PCV3在病毒的基因組特征、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、免疫反應(yīng)和診斷方法上的研究進(jìn)展。

1? 病毒的基因組特征、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化史

PCV屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。所有的PCV具有相似的形態(tài)，由一個緊密的環(huán)狀單鏈DNA基因組組成，其中有兩個方向相反的主要開放閱讀框（open reading frame，ORF）。PCV3有一個由2 000個堿基對組成的雙義基因組，其中ORF1編碼由297個氨基酸組成的復(fù)制酶（replicase，Rep）蛋白，ORF2編碼由214個氨基酸組成的衣殼（capsid，Cap）蛋白，ORF3編碼一個由231個氨基酸組成的蛋白，該蛋白的功能未知。PCV1和PCV2的基因組同源性接近80％，而PCV3與PCV家族其他成員的核苷酸同源性較低，與PCV1、PCV2和PCV4的核苷酸同源性分別為45.5％、46.8％和43.2％。此外，PCV3 Cap蛋白與PCV1、PCV2和PCV4 Cap蛋白的氨基酸同源性分別為24％、26％～36％和24.5％。

結(jié)構(gòu)分析表明，病毒Cap結(jié)構(gòu)蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）。同樣的結(jié)構(gòu)分析表明，與其他環(huán)狀病毒一樣，這些VLPs具有T=1的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由60個Cap蛋白亞基組成2-、3-和5-重軸。PCV3病毒粒子的半徑約8.8 nm，然而對于病毒粒子的真正形態(tài)學(xué)研究尚未完成。低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)顯示，PCV3 VLPs的β-鏈桶狀核心區(qū)域從外表面到內(nèi)凹區(qū)域發(fā)生了明顯變化，表明與PCV2 VLPs相比，其構(gòu)象靈活性有所增加。對PCV2和PCV3的VLPs比較評估表明，位于第72～79個氨基酸和第109～131個氨基酸的靈活區(qū)域存在明顯差異。

此外，與PCV2 Cap蛋白相比，PCV3 Cap蛋白的N端部分密度較低，結(jié)構(gòu)靈活性增加，表明其參與了多項功能。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，不同PCV3亞型的VLPs沒有明顯的結(jié)構(gòu)差異。這些結(jié)果符合PCV的大體觀察結(jié)果，即序列變化主要發(fā)生在表位水平，不會產(chǎn)生重大的結(jié)構(gòu)變化或影響病毒衣殼的組裝。

盡管PCV3于2016年首次被報道，但大量回顧性研究表明，該病毒在被首次發(fā)現(xiàn)之前已經(jīng)存在了幾十年?；仡櫺匝芯孔C明，20世紀(jì)60年代的福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本是能夠檢測到PCV3的最早的陽性樣本。雖然PCV3的起源尚不清楚，但一種假設(shè)認(rèn)為PCV3起源于蝙蝠，在不考慮與其他PCV重組的前提下，PCV3與蝙蝠的圓環(huán)病毒相似。大約215年前，蝙蝠的圓環(huán)病毒可能通過野豬中間體跨物種傳播給豬。分子系統(tǒng)發(fā)育分析預(yù)測，PCV3的最近共同祖先大約起源于20世紀(jì)中期（1945－1966）。最近，根據(jù)ORF2編碼氨基酸的差異，顯示有6種不同家系的PCV3在南美洲和北美洲的豬群之間流行，證明了未知的全球PCV3流行模式的復(fù)雜性。

盡管可用的PCV3全基因組和ORF2序列很有限，但研究人員還是設(shè)計出了幾種初步的分類系統(tǒng)。對PCV3序列進(jìn)行的同時期和回顧性系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Cap蛋白的第24和27個氨基酸發(fā)生了一致的突變，這可能是潛在的分子標(biāo)記。根據(jù)這些突變，PCV3可分為3個進(jìn)化支：PCV3a、PCV3b和PCV3c。根據(jù)完整的編碼序列（ORF1和ORF2），PCV3a可進(jìn)一步分為2個獨(dú)特的亞分支（PCV3a-1和PCV3a-2）和1個中間進(jìn)化支（PCV3a-IM）。此外，Chung等根據(jù)重組的病毒編碼基因，通過最大似然法（maximum likelihood mapping）定位分析，對PCV3的三種基因型和多種亞型，包括基因型1、基因型2（亞型a和b）和基因型3（亞型a、b、c、d、e、f、g和h），進(jìn)行了分類。

為了統(tǒng)一分類方法，F(xiàn)ranzo等提出了PCV3亞型的定義，即引導(dǎo)支持度（bootstrap support）大于0.9，全基因組水平的最大遺傳距離為3％，ORF2水平的最大遺傳距離為6％，全基因組和ORF2之間的結(jié)果一致。Franzo等利用這一分類系統(tǒng)確定了2個進(jìn)化支，其中進(jìn)化支1（PCV3a）由先前文獻(xiàn)報道的多個亞型組成，進(jìn)化支2包含2006年從中國某豬場獲得的2個遠(yuǎn)緣序列。世界各地的研究人員在PCV3基因組分析和進(jìn)化方面取得了許多研究進(jìn)展；然而，尚未獲得有關(guān)這些不同的基因型如何引發(fā)不同的表型或增強(qiáng)病毒逃逸宿主免疫系統(tǒng)檢測的信息。

2? 易感宿主

雖然家豬是PCV3的天然宿主，但一些家養(yǎng)的和野生的動物，如牛、犬、小鼠、巖羚羊、狍子、野豬、蜱蟲和蚊子，也能感染該病毒。然而，沒有證據(jù)表明這些動物在PCV3的傳播上發(fā)揮了作用。在家養(yǎng)動物中，牛（28.95％～34.70％為陽性樣本）和犬（9.09％～23.60％為陽性樣本）感染后會出現(xiàn)病毒血癥，但沒有出現(xiàn)臨床疾病；實驗室小鼠感染后也會發(fā)生病毒血癥，樣本的陽性率為100％。當(dāng)然，還未確定家養(yǎng)動物和實驗室動物在多大程度上充當(dāng)了PCV3的貯存宿主。Franzo等報道，巖羚羊和狍子感染PCV3后的發(fā)病率較低。Grassi等未能在黃喉姬鼠、木鼠和堤岸田鼠（bank Voles）的相關(guān)樣本中檢測到PCV3，這意味著野生嚙齒動物可能不會幫助PCV3在野生動物種群中傳播。

野豬可能是一個重要的病毒貯存宿主，Dei Giudici等、Franzo等、Klaumann等和Prinz等報道，PCV3在野豬群中的流行率（23.00％～61.54％）高于在一些家養(yǎng)豬群中的。此外，F(xiàn)ranzo等發(fā)現(xiàn)，年齡不足12個月的公豬對PCV3的感染率低于年齡較大的公豬的。在經(jīng)過為期5個月的研究后，Klaumann等提出了長期持續(xù)感染的假說，這可能部分解釋了年齡較大的公豬感染率較高的原因。

許多田間研究評估了病媒在PCV3傳播上的作用。Franzo等在有野豬群和無野豬群地區(qū)對蜱蟲上能否檢測到PCV3進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，在有野豬群的地區(qū)，能夠在蜱蟲上檢測到PCV3，反之則沒有，這表明野豬的存在也可能會影響PCV3向蜱蟲的傳播。同樣，從PCV3陽性豬場中捕獲的蚊子上也檢測到了PCV3。Ha等報道，在蚊子和豬上檢測到的PCV3，它們的基因組序列有100％的核苷酸同源性；但沒有臨床或?qū)嶒炞C據(jù)支持PCV3可通過病媒傳播。因此，在蚊子或蜱蟲上檢測到的PCV3可能與PCV3在豬群中的傳播無關(guān)?？傊琍CV3感染的流行病學(xué)、家養(yǎng)動物和野生動物之間的相互作用似乎是一種復(fù)雜的關(guān)系。

3? 臨床疾病

PCV3感染豬后會引發(fā)多種臨床癥狀，但其在田間的臨床相關(guān)性尚不清楚。本綜述介紹了PCV3感染引發(fā)的臨床癥狀，這些癥狀在文獻(xiàn)中有過報道，并得到了田間、流行病學(xué)或?qū)嶒炐匝芯康闹С帧?/p>

3.1 繁殖障礙和PDNS

首次檢測到的PCV3與母豬出現(xiàn)PDNS樣皮膚病變、高死亡率和繁殖障礙（包括流產(chǎn)、木乃伊胎和死胎率增加以及受孕率下降）有關(guān)。在這份原始報道中，受感染的母豬厭食，出現(xiàn)的肉眼病變，主要為多灶性丘疹、斑疹和淺表性皮炎，與PCV2感染引發(fā)的原發(fā)性PDNS沒有區(qū)別。對皮膚病變進(jìn)行組織學(xué)檢查后，確診發(fā)生了壞死性皮炎和表皮炎，伴有淋巴漿細(xì)胞性血管周圍袖套、中性粒細(xì)胞浸潤和出血。腎臟出現(xiàn)增生性腎小球腎炎、皮質(zhì)腎小管萎縮和壞死以及間質(zhì)纖維化。肺部表現(xiàn)為支氣管間質(zhì)性肺炎，氣道和血管被聚集的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞堵塞（圖2A）。在與單核炎癥細(xì)胞相關(guān)的肺泡間質(zhì)中也檢測到了PCV3（圖2B）。淋巴結(jié)出現(xiàn)彌漫性肉芽腫性淋巴結(jié)炎，淋巴細(xì)胞減少。除了濾泡和濾泡周圍淋巴細(xì)胞群外，巨噬細(xì)胞中也出現(xiàn)了PCV3的胞漿內(nèi)染色。隨后的病例報道顯示了各種臨床癥狀，包括PDNS、繁殖障礙、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和死胎（表1）。

雖然該臨床表現(xiàn)尚未在實驗性研究中重現(xiàn)，但PCV3可引發(fā)母豬繁殖障礙的證據(jù)主要來自田間報告。哥倫比亞的一份病例報告介紹了一家豬場的母豬出現(xiàn)了繁殖障礙，后備母豬在分娩前被確診為PCV3陽性，血清病毒滴度為7.4×103。分娩時該后備母豬出現(xiàn)難產(chǎn)，產(chǎn)下1具木乃伊胎和10頭仔豬，其中2頭仔豬在圍產(chǎn)期死亡。利用PCR進(jìn)行組織評估后顯示，在PCV3含量上，胎盤最高，其次為木乃伊胎組織，然后是圍產(chǎn)期死亡仔豬的腸系膜淋巴結(jié)和肺臟。有趣的是，在這些新生仔豬病例中，肺臟出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，腸系膜淋巴結(jié)表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少和肉芽腫性淋巴結(jié)炎，這與之前在母豬上觀察到的癥狀相同。此外，通過原位雜交證實了PCV3在組織原位上大量復(fù)制。其他研究證實，不僅PCR檢測發(fā)現(xiàn)胎兒組織含有高濃度的病毒，而且通過原位雜交還發(fā)現(xiàn)PCV3在胎兒的脾臟、腎臟、腦和肺臟的動脈中進(jìn)行自我復(fù)制，但未引發(fā)明顯的組織學(xué)病變。偶爾在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PCV3大量復(fù)制，但未觀察到心肌炎（圖3A-B）。雖然尚未確定引發(fā)上述生理現(xiàn)象的相關(guān)病因，但通過PCR可在流產(chǎn)胎兒和死胎組織中檢測到PCV3，未檢測到其他病原體。然而，Tochetto等在最近一項田間研究中發(fā)現(xiàn)，分娩母豬的病毒血癥與死胎比例存在相關(guān)性，但該報道的數(shù)據(jù)卻相互矛盾。據(jù)報道，在流產(chǎn)胎兒和胎盤合并感染或共同檢測的情況下，PCV3也是引發(fā)母豬出現(xiàn)繁殖障礙的部分病因；因此，需要進(jìn)一步研究以確定PCV3是這些混合感染病例的主要病原體或偶然發(fā)現(xiàn)的病原體。最后，Arruda等報道，在與高流產(chǎn)率相關(guān)的圍產(chǎn)期死亡病例中也檢測到了PCV3。因此，與繁殖問題相關(guān)的新生仔豬死亡有可能是宮內(nèi)感染的結(jié)果。

3.2 多系統(tǒng)炎癥綜合征

在報道PCV3感染的文獻(xiàn)中，統(tǒng)一認(rèn)為感染豬暴發(fā)了多系統(tǒng)炎癥。美國首次報道PCV3感染的研究人員認(rèn)為，這種新發(fā)現(xiàn)的病毒與保育豬（2～3周齡）和生長-育肥豬（9～? ? 10周齡）的多系統(tǒng)炎癥有關(guān)。研究人員觀察到的臨床癥狀包括淋巴漿細(xì)胞性心肌炎、間質(zhì)性肺炎和急性支氣管炎，通過原位雜交在病變部位檢測到了PCV3。這種炎癥過程與PCV3檢測的臨床關(guān)聯(lián)或表現(xiàn)仍不清楚。然而，臨床報道記述了豬發(fā)育不良，生產(chǎn)性能下降和突然死亡。雖然這些臨床癥狀沒有特異性，但組織學(xué)評估一致顯示，圍產(chǎn)期仔豬和斷奶仔豬暴發(fā)了多系統(tǒng)炎癥。

臨床病例中報道的病變經(jīng)PCR和原位雜交證實為PCV3陽性，同時包括淋巴漿細(xì)胞性血管炎（主要出現(xiàn)在心臟、腎臟和腸系膜血管），以及伴有表皮壞死的纖維素性壞死。在心臟、脾臟、腎臟和肝臟等多個組織的小血管內(nèi)膜和中間層上都檢測到了病毒，支持了多系統(tǒng)性血管周炎的觀點(diǎn)（圖4A-D）。Arruda等發(fā)現(xiàn)，感染豬淋巴結(jié)中也出現(xiàn)了莫特細(xì)胞和大量的巨噬細(xì)胞。盡管文獻(xiàn)描述不一致，但淋巴結(jié)和脾臟中淋巴細(xì)胞的減少與PCV3有關(guān)（圖5A-B）。Yajima和Knowlton詳細(xì)介紹了PCV3感染在心肌炎發(fā)生中的作用。

最近，McMurray等發(fā)現(xiàn)，人感染冠狀病毒后會出現(xiàn)一種類似的綜合征，包括淋巴漿細(xì)胞性心肌炎和全身性血管炎。在其他病毒感染中，也曾出現(xiàn)過病毒血癥持續(xù)時間長、中和抗體活性降低，隨后出現(xiàn)有害的T細(xì)胞反應(yīng)。這種情況會引發(fā)非特異性多系統(tǒng)炎癥綜合征，通常會導(dǎo)致多系統(tǒng)衰竭。尚不清楚這些是否是PCV3發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，因此有必要開展更多的研究，以了解PCV3感染的完整發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)，以及這種臨床表現(xiàn)是否會因混合感染而加劇，或是否容易繼發(fā)感染。

3.3 亞臨床感染和混合感染

大量回顧性研究表明，亞臨床感染發(fā)生在各年齡段的豬上，在無明顯臨床癥狀的組織中檢測到PCV3也證明了這一點(diǎn)（表1）。此外，除了在有亞臨床癥狀的母豬體內(nèi)檢測到PCV3特異性抗體外，還在無明顯臨床癥狀的豬的唾液中檢測到了PCV3。所有這些信息也得到了在未受到臨床感染的豬體內(nèi)檢測到病毒血癥的報道的支持。

在田間由PCV3和多種豬病原體組成的共感染已被普遍報道。在全球范圍內(nèi)，有病例報道PCV3與其他主要的具有重要經(jīng)濟(jì)價值的豬病原體混合感染，包括PCV2、PRRSV、PPV、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬德爾塔冠狀病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）和經(jīng)典豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV），而其他一些PCV3感染病例與流行率較低的病原體共同感染（表1）。一些研究報道了PCV3與其他引起母豬繁殖障礙的病原體的混合感染率。在美國、中國、韓國、泰國和歐洲國家，PCV2和PCV3的混合感染率從1.26％到70.00％不等。PRRSV和PCV3的混合感染率從0.67％到61.54％不等。同時，Ha等報道，PCV3與PPV2、PPV6和PPV7的混合感染率分別為8.6％、20.0％和24.8％。意大利的一項報道顯示，PCV3和PPV在散養(yǎng)豬和野豬上的混合感染率分別為2.6％和3.5％；然而，該研究并未在家豬上檢出此類混合感染。此外，PCV2、PCV3和PPV混合感染在家豬、散養(yǎng)豬和野豬上分別為8.8％、53.0％和59.0％，這表明PPV而非PCV3可能是PCV2導(dǎo)致豬發(fā)生繁殖障礙的一個重要輔助因素。Zhen等對亞洲某國家豬的PCV3陽性樣本檢測后發(fā)現(xiàn)，分別有83.3％、71.2％和50.0％的樣本同時感染了豬細(xì)環(huán)病毒1型（Torque teno sus virus，TTSuV1）、TTSuV2以及TTSuV1和TTSuV2。雖然報道混合感染的文獻(xiàn)很多，但沒有關(guān)于以下方面的信息：? ? ? ?（1）PCV3作為主要病原體或混合感染病原體的作用；（2）混合感染導(dǎo)致的病毒復(fù)制增加。這些報道很少描述臨床信息，而且僅限于介紹檢測情況?？傊?，PCV3與其他病毒和細(xì)菌混合感染的情況很常見，這表明PCV3可能是某些病原體的輔助因子，或可能需要其他輔助因子才能引發(fā)臨床疾病。建立混合感染模型可能有助于更好地了解引發(fā)臨床疾病所需的輔助因子或易感因素。

3.4 在實驗條件下觀察到的臨床疾病

PCV3陽性樣本是在野外條件下從亞臨床個體上采集的，因此經(jīng)常出現(xiàn)臨床癥狀，這給實驗帶來了挑戰(zhàn)。利用PCV3分離株ISU27734感染6周齡的剖宮產(chǎn)無初乳（colostrum-deprived， caesarian-derived，CD/CD）豬，豬經(jīng)鼻腔和肌內(nèi)接種PCV3全病毒，并通過皮下注射用弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔戚血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocycanin，KLH）進(jìn)行免疫刺激。在為期28 d的研究中，所有接種豬均未出現(xiàn)臨床癥狀。經(jīng)組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，8頭仔豬中的4頭出現(xiàn)了亞急性多系統(tǒng)炎癥，包括淋巴漿細(xì)胞性心肌炎、間質(zhì)性腎炎和淋巴漿細(xì)胞性動脈周炎?？傮w而言，實驗條件下誘發(fā)的病變在嚴(yán)重程度上要低于臨床病例報告中描述的水平。

另一項研究用PCV3陽性組織勻漿感染第一個處理組的CD/CD保育豬；用PCV3感染材料感染第二個處理組的CD/CD保育豬，并用KLH作為佐劑。在這兩個PCV3感染組中，試驗豬分別進(jìn)行了肌內(nèi)和鼻內(nèi)接種，并在第一次接種疫苗7 d后再次接種。在為期42 d的研究中，試驗豬在臨床上沒有發(fā)病，但兩個感染組的試驗豬都出現(xiàn)了多系統(tǒng)炎癥的組織學(xué)病變，表現(xiàn)為淋巴漿細(xì)胞性心肌炎和動脈周炎、間質(zhì)性腎炎、伴有血管周炎的淋巴漿細(xì)胞性腦炎、淋巴漿細(xì)胞性肝炎、淋巴漿細(xì)胞性動脈周炎以及腸漿膜和脾臟動脈炎。

根據(jù)這兩項試驗研究可以得出結(jié)論，PCV3感染足以使豬產(chǎn)生多系統(tǒng)炎癥綜合征。然而，實驗性病變在嚴(yán)重程度上與田間病例報告介紹的病變程度不盡相同，這表明其他輔助因素或混合感染可能會加劇PCV3的發(fā)病機(jī)制。最后，實驗性研究未能再現(xiàn)明顯的臨床癥狀，這可能表明田間觀察到的病例并不完全是PCV3感染所致。

4? 發(fā)病機(jī)制

4.1 病毒血癥

田間研究表明，PCV3感染引發(fā)的病毒血癥在病毒被動物機(jī)體完全清除前會持續(xù)較長時間。在對4家不同豬場的商品豬從斷奶到屠宰期間進(jìn)行的定期評估中發(fā)現(xiàn)，病毒血癥是間歇性的，整個生產(chǎn)周期的陽性率為6.5％～25.0％，表明可能存在長期持續(xù)性感染。田間病例還表明，母豬體內(nèi)的病毒載量可能與其所處的胎次有關(guān)，2胎母豬體內(nèi)的病毒載量最高，4胎母豬的最低。Kedkovid等指出，高胎次母豬體內(nèi)的病毒載量減小，可能是由于在整個生產(chǎn)周期中多次感染PCV3后產(chǎn)生了免疫力。同樣，Eddicks等研究發(fā)現(xiàn)，青年公豬體內(nèi)的病毒載量較高，12月齡以下的公豬體內(nèi)的病毒載量明顯高于大年齡公豬的。

在多項實驗性研究中，最早在感染后3 d就能夠從試驗豬中檢測到病毒血癥，到感染后21 d時，陽性豬的比例達(dá)到最高。此外，不同報道對基于基因組拷貝的病毒血癥的介紹也不盡相同，在感染后3～21 d達(dá)到最大濃度。病毒的毒株、感染途徑、接種時豬的年齡以及不同實驗環(huán)境中使用的潛在輔助因子可能只是影響病毒活力的幾個因素。然而，所有這些研究一致報道，至少在感染后28 d才可以檢測到持續(xù)的病毒血癥，有些病例在感染后42 d才確診。觀察到的長期或持續(xù)性感染的可能性與在其他ssDNA病毒感染中觀察到的情況一致，如PCV2、TTSuV。

4.2 排毒和傳播

目前已發(fā)現(xiàn)PCV3有幾種不同的排毒途徑，但仍然未知病毒的傳播途徑。Kwon等發(fā)現(xiàn)能夠在亞臨床感染的豬的唾液中檢測到PCV3，表明PCV3可以經(jīng)口傳播。此外，Kedkovid等利用PCR檢測豬的唾液腺，結(jié)果檢測到了PCV3；然而，尚未通過免疫組織化學(xué)或原位雜交等原位檢測方法證實病毒的復(fù)制。Temeeyasen等在感染后3～28 d從實驗性接種的豬的鼻腔中檢測到了間歇性排出的病毒，接種后第1周從豬的糞便中檢測到間歇性脫落的病毒。只有一項報道介紹了PCV3可以垂直傳播，1頭后備母豬在分娩前被確診為PCV3陽性，在其胎盤、所產(chǎn)木乃伊胎和產(chǎn)后立即死亡的弱仔豬中檢測到了病毒。Kedkovid等證明，PCV3還可通過初乳傳播，這可能有助于病毒的垂直傳播。然而，目前尚不清楚PCV3是否會通過乳腺發(fā)生感染和復(fù)制；因此，需要進(jìn)一步探討病毒通過初乳排毒的潛在機(jī)制。用qPCR檢測公豬的精液和睪丸組織，證明存在PCV3，這表明PCV3可能有性傳播的風(fēng)險。Eddicks等對一家種公豬場的人工授精的精液進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)PCV3的檢出率相對較低，為1.7％。然而，公豬精液在PCV3引起的繁殖障礙中所起的作用仍然未知。PCV3在環(huán)境中的存活和持久性，以及病毒污染物在傳播中的潛在作用，尚未得到充分的研究。Franzo等發(fā)現(xiàn)，對運(yùn)輸車消毒后，仍能從車上的海綿中檢測到PCV3，表明環(huán)境樣本可能有助于病毒的傳播。總之，所有這些研究認(rèn)為，PCV3可通過豬的大多數(shù)體液排毒，因此能夠進(jìn)行水平傳播，并可在環(huán)境中持續(xù)存活。然而，需要進(jìn)一步研究，以了解PCV3在陽性豬場中永存的機(jī)制，以及亞臨床感染個體在水平傳播和垂直傳播中的作用。

4.3 PCV3在細(xì)胞和組織中的復(fù)制

尚不清楚PCV3進(jìn)入豬體細(xì)胞的具體機(jī)制以及與臨床疾病相關(guān)的受體；不過，已確定病毒復(fù)制的不同細(xì)胞。原位雜交證明，在自然感染母豬的流產(chǎn)胎兒和木乃伊胎中，PCV3可以在心肌細(xì)胞、心臟和腎臟動脈的平滑肌細(xì)胞以及胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞中復(fù)制。同樣，在患有多系統(tǒng)炎癥的斷奶仔豬和生長豬上，普遍發(fā)現(xiàn)PCV3可以在心肌以及心臟和腎臟動脈的平滑肌細(xì)胞中復(fù)制。此外，Arruda等和Mora-Díaz等在豬皮下脂肪細(xì)胞、大腦白質(zhì)和灰質(zhì)小動脈平滑肌以及室管膜細(xì)胞中檢測到了PCV3。Arruda等指出，在豬腸系膜和胸膜的間皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、肺動脈平滑肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和淋巴結(jié)生發(fā)中心的淋巴細(xì)胞中罕見檢測到病毒復(fù)制。

Mora-Díaz等通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，PCV3可以在實驗性接種的6周齡CD/CD豬的心肌細(xì)胞、心臟小動脈中膜、腎小管上皮細(xì)胞和腎臟動脈中膜中復(fù)制。此外，實驗性研究也表明，PCV3可以在5周齡CD/CD豬肝竇的內(nèi)皮細(xì)胞，以及與間質(zhì)性心肌炎和皮質(zhì)間質(zhì)性腎炎、脾臟白髓、小腸派伊爾結(jié)和腸道漿膜炎癥灶有關(guān)的淋巴細(xì)胞中復(fù)制。免疫組織化學(xué)分析顯示，? 4周齡和8周齡無特定病原體豬的心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和肝竇，以及支氣管、腸系膜和腹股溝淋巴結(jié)的皮質(zhì)和髓質(zhì)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)陽性反應(yīng)。Jiang等證明，PCV3可以在作為一種感染模型的昆明小鼠的心肌和肺泡中進(jìn)行復(fù)制?？傊?，這些田間和實驗性研究結(jié)果表明，PCV3具有廣泛的細(xì)胞趨向性，可能表明，存在一種常見的細(xì)胞受體來促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞中復(fù)制。

事實證明，確定PCV3復(fù)制的細(xì)胞系也具有挑戰(zhàn)性。已嘗試在多種細(xì)胞系中分離PCV3，包括豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）和豬睪丸細(xì)胞，但結(jié)果存在爭議。從21日齡豬的豬腎原代細(xì)胞中成功分離和傳代了PCV3。雖然細(xì)胞病變效應(yīng)似乎不是PCV3感染的主要特征，但通過細(xì)胞質(zhì)以及原位雜交對病毒核酸的檢測證明存在病毒復(fù)制。也有報道稱，在PK-15細(xì)胞中成功分離到了PCV3，在豬腎原代細(xì)胞上觀察到相似特征，沒有細(xì)胞病變效應(yīng)，原位雜交檢測到較強(qiáng)的病毒復(fù)制。將線性化PCV3 DNA轉(zhuǎn)染豬肺泡巨噬細(xì)胞（3D4/21）細(xì)胞系，成功地從感染性克隆中解救出一種合成病毒。免疫熒光試驗證明了PCV3 Cap蛋白的核表達(dá)，表明3D4/21細(xì)胞系可以支持病毒的復(fù)制和包裝。

雖然關(guān)于受體和病毒入侵機(jī)制的資料有限，但研究人員推測PCV3與PCV2使用不同的機(jī)制。糖胺聚糖，包括硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素B，已被確定為PCV2感染所必需的黏附受體。然而，PCV3 Cap蛋白缺失PCV2 Cap蛋白中的硫酸乙酰肝素結(jié)合基序。對PK-15細(xì)胞的研究表明，病毒主要是通過網(wǎng)格蛋白和發(fā)動蛋白2介導(dǎo)的內(nèi)吞作用入侵細(xì)胞，而病毒復(fù)制依賴于介導(dǎo)早期和晚期體內(nèi)運(yùn)輸?shù)腞ab5和Rab7，以及酸性細(xì)胞質(zhì)環(huán)境。此外，核定位信號（nucleolar localization signal，NoLS）與核仁磷酸化蛋白（nucleolar phosphoprotein nucleophosmin-1，NPM1）之間的相互作用促進(jìn)了核定位。Song等發(fā)現(xiàn)，PCV3 Cap蛋白的第1～38位氨基酸殘基可以直接與NPM1相互作用。在NPM1的N端寡聚化結(jié)構(gòu)域中，第48位的絲氨酸的電荷性質(zhì)對Cap蛋白的相互作用和亞細(xì)胞定位至關(guān)重要。Zhou等證明，PK-15細(xì)胞感染PCV3后，NPMI從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致與Cap蛋白共定位。NPM1上調(diào)會增加PCV3的復(fù)制。在過去幾年中，病毒感染的復(fù)雜機(jī)制已被部分揭開。然而，對PCV3發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究取決于能否找到一種穩(wěn)定的細(xì)胞系，來持續(xù)支持PCV3復(fù)制，并隨后分離出病毒。

5? 免疫反應(yīng)

5.1 先天性免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生

盡管在免疫反應(yīng)這一領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展，但人們對PCV3感染的先天性免疫反應(yīng)還不完全了解，仍需繼續(xù)研究。一般來說，先天性免疫反應(yīng)是宿主通過模式識別受體和病毒DNA特有的病原體相關(guān)分子模式識別病毒而啟動，從而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。體外試驗結(jié)果表明，PCV3 Cap蛋白可通過視黃酸誘導(dǎo)基因樣解旋酶（retinoicacid-inducible gene-like helicase，RLH）或Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）激活促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）以及核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號。對體內(nèi)先天性免疫反應(yīng)模型的評估表明，PCV3感染對IL-8有調(diào)節(jié)作用，與PCV2感染類似。然而，IL-10和大多數(shù)促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-4）對PCV2的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，但在PCV3感染期間體內(nèi)似乎并未受到影響。需要進(jìn)一步的研究，以揭示PCV3感染期間宿主識別的分子和實際機(jī)制的作用，以及干擾素和趨化因子產(chǎn)生的啟動機(jī)制。這方面的信息將有助于更好地了解PCV3亞臨床感染、臨床疾病的過程以及發(fā)生混合感染的可能性。

5.2 體液反應(yīng)

目前對PCV3體液反應(yīng)的了解大多基于田間研究，這些研究主要試圖檢測是否存在PCV3誘導(dǎo)的抗體。然而，人們對這些抗體在PCV3感染期間的保護(hù)作用或動態(tài)變化知之甚少。Deng等在一項回顧性研究中提供了自2015年以來PCV3在中國豬群中流行的血清學(xué)證據(jù)，發(fā)現(xiàn)到2017年，PCV3血清陽性率明顯提高（由22.35％提高至51.88％）。另一項對中國PCV3陽性豬場進(jìn)行的血清學(xué)研究表明，在所有生產(chǎn)階段的豬中，母豬的抗體滴度最高。此外，無論是否存在臨床或亞臨床的繁殖障礙，抗體水平和陽性豬的數(shù)量均無差異。最后，同一項田間研究報道，抗體陽性率與較高水平的病毒血癥呈正相關(guān)。

在多家豬場進(jìn)行的一項縱向研究中，病毒檢測結(jié)果表明，6周齡后的豬會出現(xiàn)不同的檢測結(jié)果，到24周齡時，陽性豬的數(shù)量會增加。根據(jù)這項研究的結(jié)果，人們推測母源抗體可以保護(hù)仔豬，由于母源抗體下降，陽性豬的比例隨著年齡的增長而增加。其他田間研究也支持這一假設(shè)，因為3～4周齡的仔豬沒有發(fā)生病毒血癥?？傊?，這些田間研究結(jié)果表明，PCV3可能具有與PCV2相似的母源抗體動力學(xué)，即在未接種疫苗的豬群中，母源抗體在6～10周齡消失，隨后在保育后期和生長早期，感染豬的比例會增加。還需要進(jìn)行更多的研究，以確定PCV3母源抗體的存在和活躍狀態(tài)及其在豬群感染動力學(xué)上的潛在作用。通過實驗性接種，IgG和IgM反應(yīng)進(jìn)行了部分表征。早在感染后3～10 d就能檢測到特異性IgG抗體，感染后17 d抗體水平最高，感染后21 d抗體水平迅速下降。此外，接種PCV3并用KLH刺激的豬會產(chǎn)生長時間的IgG反應(yīng)，感染后10 d檢測到抗體，感染后28 d抗體達(dá)到最高水平，感染后42 d仍可檢測到抗體。用KLH進(jìn)行刺激可以反映現(xiàn)場的PCV3感染情況，其中與單獨(dú)感染PCV3相比，KLH輔助因子的存在會產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。相反，在實驗性接種的豬上并未觀察到IgM反應(yīng)。

Zou等指出，在很大程度上人類仍未對B細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行探究，不過，利用免疫表位數(shù)據(jù)庫分析資源預(yù)測了第93～103位、第109～146位和第170～181位氨基酸殘基的免疫原性B細(xì)胞表位。為了進(jìn)一步確定Cap蛋白中潛在免疫原性表位的特征，通過創(chuàng)建序列重疊區(qū)域顯示，線性免疫原性B細(xì)胞表位位于第51～65位、第136～150位和第155～169位氨基酸殘基。最小基序的氨基酸殘基為第57～61位、第140～146位和第161～166位，這些氨基酸殘基已被確定為進(jìn)化過程中的保守表位序列。在多序列比對中，第57～61位和第161～166位氨基酸基序上均未發(fā)現(xiàn)氨基酸置換或間隙，表明PCV3流行株之間具有高度保守性。相比之下，在第140～146位氨基酸基序中，100個毒株中有1個在第140位氨基酸處出現(xiàn)了K到R的氨基酸置換，這意味著這些表位的保守性可能較低。有研究構(gòu)建了三維模型，用于了解Cap蛋白的結(jié)構(gòu)和組裝成VLPs的過程。在PCV3 Cap單體中，所有確定的線性表位都暴露在病毒Cap蛋白表面。然而，當(dāng)組裝成VLPs時，表位第140～146位被包埋在內(nèi)部，表明該表位位于Cap蛋白的內(nèi)部。對實驗早期產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，表位第140～146位占主導(dǎo)地位。這種對特定表位的優(yōu)勢抗體反應(yīng)可能是“誘騙表位”的特征，在這種表位中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體幾乎沒有中和能力來降低病毒滴度。

5.3 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)

PCV3感染后細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)尚不明確。研究表明，5周齡的CD/CD豬接種PCV3感染物質(zhì)并用KLH刺激后，并沒有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞反應(yīng)。因此，在T細(xì)胞亞群中沒有觀察到差異，包括輔助性T細(xì)胞（CD4+ CD8+）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD4? CD8+高）、記憶性T細(xì)胞（CD4+ CD8+低）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+ CD25+ Foxp3+）。這些結(jié)果與PCV2感染期間觀察到的細(xì)胞反應(yīng)形成鮮明對比，在PCV2感染期間，由于CD8+和CD4+CD8+雙陽性T細(xì)胞群減少，淋巴細(xì)胞明顯減少。實驗性研究還表明，PCV3感染可降低植物血凝素刺激下的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的增殖，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖減少。這種對植物血凝素（一種有絲分裂原）反應(yīng)弱可能是因為T細(xì)胞無能。從感染PCV2的豬上分離到的PBMC中也觀察到類似的反應(yīng)，PBMC對超級抗原或有絲分裂原的反應(yīng)較弱或無反應(yīng)，降低了IL-4、IL-2和IFN-γ的水平。有趣的是，無論外周對PCV3的免疫反應(yīng)如何，組織評估顯示，淋巴細(xì)胞的大量涌入都與T細(xì)胞群有關(guān)，這意味著感染組織會發(fā)生T細(xì)胞群失衡，而不會轉(zhuǎn)化為全身性變化。雖然PCV3最初與淋巴細(xì)胞耗竭有關(guān)，但現(xiàn)在已清楚，PCV3感染并不具有PCV2的大多數(shù)特征，如淋巴細(xì)胞減少、淋巴組織中組織細(xì)胞替代以及巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞對病毒的吸收?？傊?，細(xì)胞反應(yīng)的這些關(guān)鍵差異表明，PCV3對豬免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和功能的影響與PCV2的不同。

5.4 免疫逃逸策略

多項田間和實驗性研究表明，PCV3感染的特點(diǎn)是病毒血癥時間長。然而，尚未完全清楚允許病毒血癥時間延長的免疫逃逸機(jī)制。一些體外研究證明，PCV3 Cap蛋白可抑制干擾素（interferon，IFN）-α和IFN-β的產(chǎn)生。在人胚腎細(xì)胞（human embryonic kidney cells 293T，HEK-293T）中，PCV3 Cap蛋白抑制了干擾素刺激反應(yīng)元件（IFN-β-stimulated response element，ISRE）啟動子的活性，表明Cap蛋白能抑制IFN信號。然而，該研究還表明，PCV3 Cap蛋白既不影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）1和STAT2的表達(dá)和磷酸化，也不影響IFNs轉(zhuǎn)錄和激活所必需的pSTAT1/pSTAT2的異源二聚化。此外，PCV3 Cap蛋白與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α1（karyopherin subunit alpha 1，KPAN1）的相互作用并不影響核轉(zhuǎn)運(yùn)活性。細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器環(huán)磷酸鳥苷-磷酸腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）可識別外源DNA，并激活cGAS-STING通路，從而產(chǎn)生I型干擾素。此外，GTP酶激活蛋白（SH3結(jié)構(gòu)域）結(jié)合蛋白1[GTPase-activating protein-（SH3domain）-binding protein 1，G3BP1]通過促進(jìn)DNA結(jié)合和cGAS激活，可增強(qiáng)先天性抗病毒免疫反應(yīng)。PCV3 Cap蛋白通過RGG結(jié)構(gòu)域與G3BP1相互作用，抑制cGAS-STING信號，從而抑制DNA誘導(dǎo)的IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄和干擾素啟動子的激活。這些研究表明，PCV3可調(diào)節(jié)I型干擾素反應(yīng)，以逃逸宿主免疫反應(yīng)。

自噬利用溶酶體和液泡來回收細(xì)胞成分，被認(rèn)為是病毒用于增強(qiáng)復(fù)制和持久性的另一種機(jī)制。PCV2 Cap蛋白通過AMPK/ERK/TSC2/mTOR信號通路誘導(dǎo)完全自噬，使病毒能夠通過自噬機(jī)制加強(qiáng)復(fù)制。研究表明，PCV3 Cap蛋白可在HEK-293T細(xì)胞中通過mTOR途徑誘導(dǎo)自噬。Cap的表達(dá)導(dǎo)致磷酸化的mTOR含量降低，而mTOR的水平保持不變。此外，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比率以及p62與β-肌動蛋白的比率的增加，也表明泛素-蛋白酶體途徑可能有助于自噬。要確定PCV3 Cap蛋白和其他ORFs在豬細(xì)胞系和體內(nèi)模型中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的情況，還需要進(jìn)一步的研究。

6? 診斷

6.1 臨床診斷

PCV3感染的最終臨床結(jié)果仍存在疑問。最近發(fā)布的PCV3感染的病例定義有PCV3繁殖障礙和PCV3系統(tǒng)疾病。然而，除了多系統(tǒng)炎癥外，這一新的病例定義提出的臨床癥狀均未在實驗性研究中重現(xiàn)。臨床上，PCV3感染最常見的癥狀是母豬繁殖障礙和PDNS樣病變，以及生長豬的多系統(tǒng)炎癥。由于PCV3感染與其他豬病原體感染的臨床表現(xiàn)相似和部分相同，僅憑臨床癥狀確診PCV3感染可能并不準(zhǔn)確。因此，PCV3相關(guān)疾?。≒CV3-associated disease，PCV3-AD）需要實驗室支持。

6.2 直接檢測方法

目前已開發(fā)出多種基于PCR的診斷檢測方法，包括基于熒光染料摻入法（SYBR Green）的實時qPCR、基于TaqMan的實時PCR和直接PCR，對組織、器官、血清、唾液、鼻拭子和環(huán)境樣本的檢測限均小于102拷貝/μL。微滴式數(shù)字PCR具有更高的靈敏度，可檢測組織和血清樣本中的PCV3，檢測限為1拷貝/μL。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等等溫擴(kuò)增方法也已成功開發(fā)，可用于檢測組織和血清樣本，其靈敏度與qPCR相當(dāng)。最近，利用等溫擴(kuò)增原理的診斷分析（添加指示劑染料甲酚紅和苯酚紅）實現(xiàn)了血清樣本的可視比色檢測。

由于PCV3與其他豬源性病毒混合感染的發(fā)生率相對較高，一些方法可以在存在其他病原體的情況下檢測PCV3。多重qPCR檢測法可從組織提取的病毒DNA中檢測PCV3及其他PCV和其他病原體，其靈敏度與PCV3的單重qPCR相當(dāng)。利用雙標(biāo)記（TaqMan）探針開發(fā)了一種四重實時PCR檢測方法，可同時檢測組織樣本中的PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，其特異性和靈敏度與單重和傳統(tǒng)PCR檢測方法相當(dāng)。此外，用于組織樣本中PCV2和PCV3雙重檢測的高靈敏度微滴式數(shù)字PCR對PCV2和PCV3的檢測限分別為2拷貝/μL和1拷貝/μL。

原位雜交已被用于證實PCV3在可疑病變組織復(fù)制。一些檢測方法使用RNAScope檢測平臺，利用探針靶向PCV3 ORF1病毒mRNA的反向補(bǔ)體。其他原位雜交方法利用了PCV3特異性地高辛探針。通過原位雜交或RNAScope診斷PCV3時，提交的組織病理學(xué)標(biāo)本應(yīng)包括心臟、肺臟、脾臟和淋巴結(jié)的樣本。PCV3抗體的開發(fā)及其在抗原直接檢測中的應(yīng)用一直受到限制，這可能是由于病毒難以分離。不過，也有少數(shù)研究利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光來檢測PCV3抗原。PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體與PCV2沒有交叉反應(yīng)，并且在扁桃體和淋巴結(jié)上能很好地檢測到PCV3抗原。有報道稱，在間接免疫熒光檢測中使用向BALB/c小鼠腹腔注射PCV3顆粒產(chǎn)生的多克隆抗體，通過細(xì)胞培養(yǎng)可確定病毒。

6.3 間接檢測方法

為了檢測PCV3特異性抗體，已建立了幾種ELISA檢測方法。密碼子優(yōu)化的全長Cap蛋白已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。與PCV2相似，PCV3 Cap蛋白N端33個氨基酸為核定位信號，具有較多的精氨酸，且密碼子少，阻止了蛋白質(zhì)在原核系統(tǒng)中表達(dá)。因此，大多數(shù)報道的ELISA使用的是在大腸桿菌中表達(dá)的截短Cap蛋白，其核定位信號序列被排除在外。Deng證明，間接ELISA靈敏度高，PCV3特異性IgG的最大稀釋度為1∶3 200；同時，未發(fā)現(xiàn)與PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV等其他豬源性病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。文獻(xiàn)報道的ELISA大多數(shù)是為評估PCV3特異性IgG而開發(fā)的。然而，Mora-Díaz等開發(fā)了一種間接ELISA，最早可在接種后7 d檢測PCV3特異性IgM。PCV3特異性抗體的血清學(xué)評估也是通過使用表達(dá)PCV3 Cap或轉(zhuǎn)染重組pcDNA3.1-Cap的桿狀病毒進(jìn)行直接免疫熒光檢測來實現(xiàn)的。

7? 總結(jié)與未來展望

自2016年報道首例由PCV3感染引發(fā)的病例以來，該病毒已在全球范圍內(nèi)被廣泛報道，并引發(fā)了多種臨床癥狀。其中三種主要表現(xiàn)形式不斷被報道，并在一定程度上得到了文獻(xiàn)的支持：多系統(tǒng)炎癥綜合征、繁殖障礙和PDNS以及亞臨床感染。在大量病例報道中，很難確定PCV3在不同臨床表現(xiàn)中的致病作用，原因如下：一是PCV3常與多種病原體混合感染；二是病理學(xué)評估不足；三是缺乏原位檢測，無法確定病變或感染組織中是否存在病毒基因組或抗原。迄今為止，與PCV3感染有關(guān)的重要證據(jù)是母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥和亞臨床感染。

還需要在實驗條件下進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以確定PCV3感染作為引起臨床疾病的主要病原體的真實效果。要解決這個問題，關(guān)鍵的一步是要開發(fā)實驗挑戰(zhàn)模型，使其能夠再現(xiàn)與田間報道相似的疾病嚴(yán)重程度。目前，關(guān)于PCV3混合感染的報道有很多，因此，應(yīng)將此類混合感染作為引起更嚴(yán)重的PCV3臨床疾病的潛在因素進(jìn)行評估。回顧性研究顯示，PCV3已在全球流行了幾十年，另一種假設(shè)是PCV3可能是PCV2和PRRSV等其他病原體感染的輔助因子，只是PCV3當(dāng)時尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，應(yīng)開發(fā)PCV3混合感染模型，以證明PCV3與其他病原體之間的協(xié)同作用關(guān)系。

持續(xù)病毒血癥已在實驗中得到證實，并在田間研究中得到了確認(rèn)，這表明存在再感染的可能性。然而，目前還沒有闡明PCV3如何導(dǎo)致長期持續(xù)感染以及可能會再感染的機(jī)制。多項研究表明，PCV3可通過豬的唾液、鼻腔分泌物和糞便排毒；然而，人們對水平傳播的機(jī)制仍知之甚少。PCV3通過公豬的精液和母豬的初乳進(jìn)行垂直傳播已得到證實，垂直傳播的重要證據(jù)是在分娩前呈PCV3陽性的后備母豬所產(chǎn)死胎和木乃伊胎中也檢測到了PCV3。此外，家豬和野豬群作為PCV3貯存宿主以及跨物種傳播的可能性尚未被確定。更好地了解傳播途徑可以有效地控制和預(yù)防疾病。利用PCR可以在多種組織中檢測到PCV3，因此，開發(fā)針對特定樣本類型的更靈敏、更特異的診斷方法是應(yīng)用不同診斷策略的當(dāng)務(wù)之急。

缺乏有效的病毒分離方法和培養(yǎng)分離病毒的細(xì)胞系是目前PCV3研究的主要限制之一。文獻(xiàn)中關(guān)于通過獲得感染性克隆分離病毒的報道也很少。雖然可以推測PCV3入侵和復(fù)制的一些基本機(jī)制與PCV家族的其他成員相似，但仍需要進(jìn)一步的研究來確定合適的細(xì)胞系，從而有效地分離病毒，研究病毒致病的基本機(jī)制。

最后，盡管人們在了解與PCV3相關(guān)的體液免疫反應(yīng)方面取得了進(jìn)展，但免疫反應(yīng)的特征仍不太明了。有趣的是，通過實驗性接種或田間研究檢測到的抗體與病毒清除之間并無關(guān)聯(lián)。病毒分離株的缺乏阻礙了對中和抗體的評估，而Cap蛋白中的非特異性原表位或“誘騙表位”可能會影響中和抗體的產(chǎn)生，從而減少或延遲中和抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而影響病毒的清除。因此，需要進(jìn)行更多的研究來評估中和抗體反應(yīng)。此外，在評估細(xì)胞反應(yīng)及其在病毒清除中的作用方面也鮮有進(jìn)展。

本綜述總結(jié)了自PCV3首次報道以來的研究進(jìn)展。此外，還需要進(jìn)一步的研究以填補(bǔ)領(lǐng)域中存在的不足，包括：（1）病毒循環(huán)及其在亞臨床感染動物中的作用；（2）持續(xù)性病毒血癥對病毒排毒和病毒在環(huán)境中存活的作用； （3）混合感染的發(fā)病機(jī)制和免疫反應(yīng)；（4）引發(fā)不同臨床表現(xiàn)的因素；（5）該病對養(yǎng)豬業(yè)的實際影響。

原題名：Five years of porcine circovirus 3： What have we learned about the clinical disease， immune pathogenesis， and diagnosis （英文）

原作者：Molly Kroeger、Gun Temeeyasen和Pablo E Pi?eyro