細針穿刺組織miR-1243、Survivin、CXCR4評價甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)與臨床病理的價值

白靜 劉鵬飛

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院普外二科 鄭州 450000

對于直徑>1cm甲狀腺結(jié)節(jié),超聲評估有惡性征象者,有關(guān)指南推薦進行超聲引導下細針抽吸活檢(ultrasound-fineneedle aspiration biopsy,US-FNAB),通過細胞學診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的性質(zhì)[1],并以此為依據(jù)制定治療方案。但其缺點在于結(jié)節(jié)越小,穿刺或病理陽性率可能越低[2],有可能造成延誤治療或過度治療。微小RNA-1243(miR-1243)在腫瘤中表達下調(diào),其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān),并可抑制細胞增殖,促進細胞凋亡[3]。生存素(Survivin)屬于人類凋亡抑制蛋白家族成員,其在甲狀腺癌組織中呈高表達,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、包膜浸潤、組織分化、不良預后有關(guān)[4]。趨化因子受體4(CXCR4)在多種器官的實體腫瘤中表達上調(diào),且與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、血管生成有關(guān)[5]?；诖?本研究探討miR-1243、Survivin、CXCR4鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的應用價值,并分析其與臨床病理參數(shù)相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。選取2020-01—2022-02本院收治的疑似惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的患者72例,男23例、女49例,年齡(43.82±3.27)歲,結(jié)節(jié)數(shù)目(1.71±0.22)個,結(jié)節(jié)直徑(20.51±1.88)mm。納入標準:至少存在一個可測量直徑的結(jié)節(jié),經(jīng)手術(shù)切除獲得病理診斷?；颊咭庾R清晰,無精神病史。排除標準:合并心腦腎等臟器功能障礙、冠心病、糖尿病、免疫缺陷疾病,以及有頸部手術(shù)、外傷史和超聲顯示不清的患者。

1.2方法

1.2.1 US-FNAB Mindray Resona 8s彩色多普勒超聲診斷儀(東莞市搏動醫(yī)療器械有限公司)引導下采用注射器(10 mL)配以7號針頭(22 G×32 mm,外徑0.7 mm,內(nèi)徑0.5 mm)選擇實性部分與血流信號相對優(yōu)勢部位穿刺,選中的結(jié)節(jié)(<0.5 mm)前后穿刺范圍>5 mm。操作方法:常規(guī)消毒、鋪巾, 1%利多卡因局部麻醉。左手持L14-5WU型探頭(頻率5～14 MHz),掃描甲狀腺后確定結(jié)節(jié)位置、穿刺點。右手持細針以針尖與皮膚呈45°角刺入結(jié)節(jié)中心部位。負壓狀態(tài)下切換不同角度反復抽吸10～15次,用95%乙醇固定抽取樣本。依據(jù)Bethesda診斷標準評價甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)[6]。Ⅰ級:標本不滿意。Ⅱ級:良性病變。Ⅲ級:非典型病變、濾泡性病變。Ⅳ級:濾泡性腫瘤。Ⅴ級:可疑惡性腫瘤。依據(jù)檢查結(jié)果將患者分為良性組26例(Ⅰ～Ⅱ級)、惡性組46例(Ⅲ～Ⅴ級)。

1.2.2 qRT-PCR法檢測組織中miR-1243表達量 采用miRNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(北京天根生化科技公司):5×gDNA Buffer 2 μL,10×King RT Buffer 2 μL,FastKing RT Enzyme Mix 1 μL,FQ-RT Primer Mix 2 μL,RNA(2 μg),RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL。反應條件:42℃ 15 min,95℃ 3 min。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增(北京天根生化科技公司)。反應體系:10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO4 2.5 μL,dNTPs 2.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件:95℃預變性60 s,95℃變性60 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共36次循環(huán)。

1.2.3 Western blot檢測組織中Survivin、CXCR4蛋白表達量 甲狀腺結(jié)節(jié)組織中加入1mL裂解液提取總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度。取40 μg經(jīng)SDS-PAGE(10%)凝膠電泳分離蛋白,移至PDVF膜,脫脂牛奶(5%)封閉,分別添加Survivin、CXCR4一抗(1∶800)與內(nèi)參GAPDH(1∶2 000),4℃孵育,次日加入二抗(1∶5 000),暗室內(nèi)曝光顯影,采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3觀察指標及判定標準(1)比較2組不同臨床病理參數(shù)患者中miR-1243、Survivin、CXCR4表達量,其中通過CT檢查、三維能量多普勒血管成像(3D-PDA)檢查獲取臨床病理參數(shù)。(2)分析各指標與臨床病理參數(shù)相關(guān)性。(3)分析各指標對惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價值。(4) 陽性判定標準:以miR-1243、Survivin、CXCR4診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的cut-off值為分界,miR-1243cut-off值為陽性,CXCR4>cut-off值為陽性,聯(lián)合診斷時有一項為陽性即為陽性。術(shù)后病理診斷結(jié)果為良性甲狀腺結(jié)節(jié)25例、惡性甲狀腺結(jié)節(jié)47例。以術(shù)后病理診斷結(jié)果為“金標準”,評價不同診斷方案的準確度。

2 結(jié)果

2.12組miR-1243、Survivin、CXCR4表達量與良性組比較,惡性組miR-1243表達量降低(P<0.05),Survivin、CXCR4表達量升高(P<0.05)。見表1。

表1 2組miR-1243、Survivin、CXCR4表達量

2.2不同臨床病理參數(shù)患者各指標表達無包膜、邊界不清晰、有鈣化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)節(jié)血流、周邊組織血流豐富者miR-1243表達量分別低于有包膜、邊界不清晰、無鈣化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血流不豐富者,而Survivin、CXCR4表達量升高(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理參數(shù)患者各指標表達

2.3各指標與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性miR-1243與包膜呈正相關(guān),而與鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(P<0.05);Survivin、CXCR4與包膜呈負相關(guān),而與鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)節(jié)血流情況呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 各指標與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

2.4各指標對甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷價值以惡性組46例為陽性樣本,良性組26例為陰性樣本,繪制ROC曲線。結(jié)果顯示,聯(lián)合診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的AUC大于單項診斷(P<0.05)。見表4。

表4 各指標對甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷價值

2.5各指標對良、惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷效能對比分析以miR-1243<0.85判定為陽性,診斷準確度為68.06%、陽性預測值為87.50%、陰性預測值為52.50%;以Survivin>0.46判定為陽性,診斷準確度為68.06%、陽性預測值為80.00%、陰性預測值為53.13%;以CXCR4>0.71判定為陽性,診斷準確度為68.06%、陽性預測值為83.33%、陰性預測值為52.78%;聯(lián)合診斷準確度為88.89%、陽性預測值為89.80%、陰性預測值為86.96%。見表5。

表5 各指標單項、聯(lián)合檢測對甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷效能對比分析

3 討論

大部分甲狀腺結(jié)節(jié)是在體檢時頸部超聲檢查發(fā)現(xiàn),其中大部分為良性,惡性腫瘤僅為5%～10%[1]。對于超聲檢查發(fā)現(xiàn)的甲狀腺結(jié)節(jié),尤其是超聲掃查提示TI-RADS分類≥4類的患者,需進一步采取措施對結(jié)節(jié)的病理性質(zhì)進行鑒別,以確定治療方案。US-FNAB是臨床最常用的診斷和鑒別診斷方法,其主要不足是結(jié)節(jié)越小,穿刺或病理陽性率越低?；诖?我們在US-FNAB中分別檢測抽取組織中的miR-1243、Survivin、CXCR4表達量,探討其鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的應用價值和與臨床病理參數(shù)相關(guān)性。

miR-1243在腫瘤中異常表達,在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平負向調(diào)控基因表達,參與細胞增殖、遷移等生物學過程,已證實在甲狀腺乳頭狀癌等多種腫瘤中呈低表達,可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[6-7]。本研究中,惡性組miR-1243表達量低于良性組,且與包膜呈正相關(guān),而與鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān),表明miR-1243表達下調(diào)可能參與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)進展過程。結(jié)節(jié)邊緣是否鈣化、邊界是否清晰、有無包膜及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均為惡性甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)特征。甲狀腺癌浸潤性生長方式可引起包膜穿破。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的重要依據(jù)。惡性甲狀腺結(jié)節(jié)周圍組織的細胞間裂隙較大,導致血管平滑性降低,血管規(guī)則程度減小。本研究結(jié)果提示,miR-1243低表達可能靶向調(diào)控靶基因表達,促進細胞增殖、遷移及侵襲,抑制細胞凋亡,并可刺激炎性細胞生長,促使甲狀腺濾泡不斷增生;同時增生部位不斷侵襲甲狀腺,致使甲狀腺部位血流豐富,進而參與甲狀腺結(jié)節(jié)惡性進展過程。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-1243<0.85時的診斷準確度為68.06%,且存在假陽性、假陰性,提示miR-1243需聯(lián)合檢測其他指標以鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)。

Survivin在多種惡性腫瘤組織中表達水平升高,且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、術(shù)后復發(fā)密切相關(guān),并可抑制細胞凋亡,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[8]。CXCR4與配體基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)結(jié)合可激活多種信號通路,調(diào)節(jié)細胞生長、趨化等生物學行為,可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[9]。本研究中,惡性組Survivin、CXCR4表達量高于良性組,其與包膜呈負相關(guān),而與鈣化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)節(jié)血流情況呈正相關(guān)。分析原因可能為CXCR4與SDF-1結(jié)合可激活Survivin,促進細胞增殖、遠處轉(zhuǎn)移,致使腫瘤細胞逃逸宿主免疫,進一步參與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)展過程。本研究結(jié)果提示,檢測甲狀腺結(jié)節(jié)患者Survivin、CXCR4表達可在一定程度上評價甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)。無法通過單一指標明確診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié),需多個指標聯(lián)合診斷以提高預測惡性結(jié)節(jié)的臨床價值。miR-1243、Survivin、CXCR4聯(lián)合診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的AUC高于單項診斷,以術(shù)后病理診斷結(jié)果為“金標準”,結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)合診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的準確度、陽性預測值、陰性預測值較好,具有一定臨床應用價值。

綜上所述,miR-1243、Survivin、CXCR4與甲狀腺結(jié)節(jié)臨床病理特征相關(guān),聯(lián)合檢測對甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)具有高度診斷效能。