不同劑量汽化過(guò)氧化氫和消毒時(shí)間對(duì)A2生物安全柜消毒效果的研究

吳大偉，何振健，程雙來(lái)，雷迅

(1. 中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；2. 廣州美岸生物科技有限公司，廣東 廣州 510080)

0 引言

生物安全柜是開(kāi)展病原微生物實(shí)驗(yàn)必不可少的設(shè)備，它能有效降低生物實(shí)驗(yàn)中病原微生物等產(chǎn)生的有害氣溶膠對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的危害，同時(shí)也能降低實(shí)驗(yàn)樣品的污染，起到隔離的作用。衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 233—2017《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》[1]對(duì)病原微生物生物安全實(shí)驗(yàn)室配置生物安全柜有明確要求，通常生物安全柜雖然本身配置有紫外消毒和高效過(guò)濾功能。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間地開(kāi)展病原微生物實(shí)驗(yàn)，其生物安全風(fēng)險(xiǎn)依然存在。因此，我國(guó)的GB 19489—2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》中第6.4.16條和《實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則對(duì)關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備評(píng)價(jià)的應(yīng)用說(shuō)明》中第5.7.3條均指出在安裝和更換HEPA前必須進(jìn)行徹底消毒，并對(duì)其消毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[2-4]。另外生物安全柜每年的性能檢測(cè)前也必須預(yù)先進(jìn)行消毒，以降低檢測(cè)人員的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此定期對(duì)生物安全柜進(jìn)行全面消毒已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室生物安全管理的常規(guī)工作，從而最大程度降低生物安全隱患。由于采用汽化過(guò)氧化氫對(duì)生物安全柜的消毒具有諸多優(yōu)勢(shì)：第一，對(duì)生物安全級(jí)別較高的密閉場(chǎng)所空氣和物體表面聯(lián)合消毒取得較好的效果，在高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室同樣具有較可靠的消毒效果；第二，汽化過(guò)氧化氫的分解產(chǎn)物為水和氧氣，基本無(wú)殘留，使用相對(duì)安全[5]。因此目前普遍采用汽化過(guò)氧化氫對(duì)生物安全柜進(jìn)行消毒。本文探索在特定過(guò)氧化氫汽化設(shè)備的工作下，不同劑量和消毒時(shí)間對(duì)A2二級(jí)生物安全柜的消毒效果的研究，為生物安全柜的規(guī)范消毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器材料

(1)汽化過(guò)氧化氫發(fā)生裝置：MiniX過(guò)氧化氫消毒機(jī)，由廣州美岸生物科技有限公司生產(chǎn)。

(2)過(guò)氧化氫試劑：食品用過(guò)氧化氫消毒液，型號(hào)：SX-XD-Ⅱ，濃度：35%，由荊州雙雄化工科技有限公司生產(chǎn)。

(3)生物指示劑：進(jìn)口嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bt93 Biological indicator, geobacillus stearothermophilus ATCC7953)。

(4)過(guò)氧化氫濃度檢測(cè)儀：MiniX過(guò)氧化氫消毒機(jī)集成檢測(cè)儀，由廣州美岸生物科技有限公司生產(chǎn)。

(5)嗜熱芽孢脂肪桿菌培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，規(guī)格：9 mL/管，由廣州市迪景微生物科技有限公司生產(chǎn)。

(6)A2生物安全柜：選用Thermo Scientific公司生產(chǎn)的TELSTAR BIO II Advance 4生物安全柜。主體外部尺寸(長(zhǎng)×寬×高)：1 354 mm×759 mm×1 260 mm。

(7)封裝材料：PVC塑料膜。

(8)濕度計(jì)：MiniX過(guò)氧化氫消毒機(jī)集成濕度計(jì)，由廣州美岸生物科技有限公司生產(chǎn)。

(9)培養(yǎng)箱：ASH-269型生化培養(yǎng)箱，由上海安弋儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì)

(1)過(guò)氧化氫劑量設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)30 g、40 g、50 g三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組，選取15個(gè)次A2生物安全柜，隨機(jī)分為三個(gè)組，每組5個(gè)，分別對(duì)應(yīng)三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組采用無(wú)菌蒸餾水代替生物指示劑，陽(yáng)性對(duì)照組則是生物指示劑不用消毒劑進(jìn)行消毒。

(2)時(shí)間劑量設(shè)計(jì)

分別對(duì)各個(gè)過(guò)氧化氫劑量組在0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h的消毒時(shí)長(zhǎng)，檢查消毒效果，同時(shí)在這些時(shí)間點(diǎn)記錄環(huán)境溫度和環(huán)境濕度。

1.2.2 消毒前準(zhǔn)備

(1)生物安全柜準(zhǔn)備

用PVC塑料膜對(duì)生物安全柜進(jìn)行密封，如圖1所示，并將其與汽化過(guò)氧化氫發(fā)生器通過(guò)管路連接。

圖1 生物安全柜用用PVC塑料膜密封后的狀態(tài)圖

(2)溫度測(cè)量準(zhǔn)備

用動(dòng)態(tài)溫度計(jì)記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)消毒空間的環(huán)境溫度。

(3)相對(duì)濕度測(cè)量準(zhǔn)備

以A2生物安全柜放置濕度傳感器作為檢測(cè)單元，實(shí)時(shí)記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A2生物安全柜內(nèi)環(huán)境濕度。

(4)過(guò)氧化氫濃度測(cè)量準(zhǔn)備

以A2生物安全柜集成安裝的過(guò)氧化氫氣體濃度檢測(cè)傳感器作為檢測(cè)單元，實(shí)時(shí)記錄A2生物安全柜內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)過(guò)氧化氫濃度值。

(5)設(shè)置生物指示劑

分別在各個(gè)A2生物安全柜的操作臺(tái)面的左邊、中間、右邊各放置4片生物指示劑，同時(shí)在各個(gè)A2生物安全柜頂部的左邊、中間和右邊各放置4片生物指示劑，如圖2所示。

圖2 生物指示劑(BI)在生物安全柜的各個(gè)監(jiān)測(cè)位置

1.2.3 消毒過(guò)程

在消毒前準(zhǔn)備工作完成后，分別往各組的汽化設(shè)備加入30 g、40 g和50 g過(guò)氧化氫溶液，并啟動(dòng)汽化過(guò)氧化氫消毒裝置，按設(shè)定條件完成消毒運(yùn)行程序，并記錄消毒時(shí)間，在0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h取出一片生物指示劑進(jìn)行培養(yǎng)，并記錄消毒空間的溫度、濕度和過(guò)氧化氫的濃度。

1.2.4 嗜熱脂肪芽孢桿菌培養(yǎng)

從放置在消毒空間中取出生物指示劑，并接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，嗜熱脂肪芽孢桿菌置55±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d±2 h。

1.2.5 消毒效果判定

結(jié)果判定為合格的標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)具備以下三個(gè)條件：(1)試驗(yàn)組培養(yǎng)為無(wú)菌生長(zhǎng)；(2)陰性對(duì)照組培養(yǎng)為無(wú)菌生長(zhǎng)；(3)陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)為有菌生長(zhǎng)。

2 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：消毒劑劑量為30 g的過(guò)氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表1所示，消毒劑劑量為40 g的過(guò)氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表2所示，消毒劑劑量為50 g的過(guò)氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表3所示。消毒環(huán)境溫度為：28～31 ℃，消毒環(huán)境濕度為：52%～95%，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均合格。

表1 消毒劑劑量為30 g的過(guò)氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養(yǎng)渾濁數(shù)

表2 消毒劑劑量為40 g的過(guò)氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養(yǎng)渾濁數(shù)

表3 消毒劑劑量為50 g的過(guò)氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養(yǎng)渾濁數(shù)

3 結(jié)語(yǔ)

生物安全柜是一種有效的隔離安全屏障設(shè)備，對(duì)保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作人員生命安全和保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量起到重要作用，隨著生物安全柜在各個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域的使用日益增加[8]，人們對(duì)生物安全柜本身的消毒也越來(lái)越重視和規(guī)范。根據(jù)《中國(guó)藥典》和《美國(guó)藥典》的定義，氣相滅菌法是以氣態(tài)形式擴(kuò)散，以冷凝態(tài)液體接觸微生物進(jìn)行快速?gòu)氐诇缇姆椒āＤ壳皻庀鄿缇ㄋ玫南緞┌ㄟ^(guò)氧化氫(HP)、環(huán)氧乙烷(EO)、臭氧(O3)、二氧化氯(ClO2)等。然而，有些消毒劑在使用中存在一些缺陷：或具有毒性/致癌性、對(duì)環(huán)境不友好(如甲醛)，或?qū)x器設(shè)備、彩鋼板及環(huán)氧地面具有一定的腐蝕性(如過(guò)氧乙酸和高濃度過(guò)氧化氫等)，或存在易燃、易爆等安全隱患(如環(huán)氧乙烷和二氧化氯等)[6]。其中，汽化過(guò)氧化氫(VHP)則相對(duì)具有較多種優(yōu)點(diǎn)，包括在功效方面：滅菌有效性更好、擴(kuò)散性更好、應(yīng)用范圍更廣、“穿透性”更好等；在安全方面：幾乎無(wú)毒，可分解為水和二氧化碳；在殘留物方面：自動(dòng)分解為水和二氧化碳，無(wú)明顯殘留[7]。因此汽化過(guò)氧化氫(VHP)已成為生物安全柜消毒的首選消毒劑[8]。

汽化過(guò)氧化氫(VHP)消毒法主要用到的設(shè)備是汽化過(guò)氧化氫發(fā)生裝置，以前大多為進(jìn)口設(shè)備，目前國(guó)產(chǎn)的設(shè)備在性能上大大提高，而且價(jià)格合理，已經(jīng)占據(jù)越來(lái)越大的市場(chǎng)份額。本研究采用國(guó)產(chǎn)的MiniX過(guò)氧化氫消毒機(jī)進(jìn)行消毒，并使用理想的進(jìn)口的生物指示劑作為消毒效果監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在消毒實(shí)踐中，往往需要在消毒劑使用劑量和消毒時(shí)間尋找一組理想的數(shù)據(jù)，如果使用劑量和消毒時(shí)間不夠，無(wú)法殺滅生物指示劑，則必須重復(fù)消毒直到過(guò)關(guān)為止，這將造成包括時(shí)間、試劑和人工等的浪費(fèi)。但如果使用過(guò)量的消毒劑劑量和消毒時(shí)間，則會(huì)損害儀器設(shè)備，所以尋找一組合適的劑量和消毒時(shí)間非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，分別使用濃度為35%的過(guò)氧化氫消毒劑溶液進(jìn)行汽化[9]，在消毒劑使用量為30 g這個(gè)劑量下，消毒時(shí)間為2.0 h，能有效殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌；而在使用量為40 g時(shí)，則需要耗時(shí)1.5 h才能有效殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌；如果使用劑量達(dá)到50 g時(shí)，則消毒時(shí)間最小，只需1.0 h即可有效消毒。由于過(guò)氧化氫具有強(qiáng)的氧化性，特別是在高濃度的情況，對(duì)設(shè)備具有一定的腐蝕性，因此，可以使用30 g，消毒耗時(shí)2.0 h，作為A2型生物安全柜的常規(guī)消毒劑量，但如果要減少消毒時(shí)間，則選用40 g，耗時(shí)1.5 h進(jìn)行消毒，至于高達(dá)50 g劑量組則不建議采用。

值得進(jìn)一步思考的幾個(gè)指標(biāo)：第一個(gè)指標(biāo)是濃度。目前使用劑量是以35%的過(guò)氧化氫消毒劑溶液計(jì)算，分別以30 g、40 g和50 g進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果按照目前的消毒空間換算，消毒空間為生物安全柜主體體積和支架體積之和，主體外部尺寸(長(zhǎng)×寬×高)：1 354 mm×759 mm×1 260 mm，主體體積約為1.3 m3，支架高度為740 mm，支架部分的尺寸為1 354 mm×759 mm×740 mm，約0.76 m3，即消毒空間的總體積為2.06 m3。因此本實(shí)驗(yàn)過(guò)氧化氫液體全部汽化后，理論上汽化過(guò)氧化氫的使用劑量分別是30 g、40 g和50 g，換算成濃度依次是5.10 g/m3、6.80 g/m3和8.50 g/m3。由于在消毒過(guò)程中，部分過(guò)氧化氫將會(huì)分解成水和氧氣[10]，以及消毒空間各種其他影響因素，導(dǎo)致實(shí)際的濃度將會(huì)低于理論濃度。消毒空間的汽化過(guò)氧化氫的濃度是如何變化的，濃度是否從0開(kāi)始升高，然后達(dá)到飽和狀態(tài)后維持在一定濃度水平，最后降解再慢慢降低下來(lái)，這需要進(jìn)一步研究。第二個(gè)指標(biāo)是閃蒸溫度。閃蒸溫度是汽化設(shè)備的一個(gè)性能指標(biāo)，閃蒸溫度能使液體過(guò)氧化氫迅速汽化成氣溶膠狀態(tài)的過(guò)氧化氫，使消毒空間的汽化過(guò)氧化氫達(dá)到飽和狀態(tài)并形成有效的消殺濃度，同時(shí)能盡最大程度減少過(guò)氧化氫分解，閃蒸溫度的持續(xù)程度將會(huì)導(dǎo)致消毒空間溫度的升高，這需要進(jìn)行控制。第三個(gè)指標(biāo)是環(huán)境溫度。環(huán)境溫度必須控制在相對(duì)較低的狀態(tài)，才有利于汽化過(guò)氧化氫的微凝結(jié)，從而實(shí)現(xiàn)理想的消毒效果。第四個(gè)指標(biāo)是環(huán)境相對(duì)濕度，環(huán)境相對(duì)濕度是消毒效果的一個(gè)重要影響因素。以上四個(gè)指標(biāo)將在后續(xù)的研究中進(jìn)行深入探索。