用五選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)間任務(wù)模型評(píng)價(jià)咖啡因和鹽酸羥哌吡酮對(duì)大鼠注意力、行為控制和反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)作用

鮑金豪，常海霞，3，黎進(jìn)峰，房鑫鑫，代 威，李云峰

〔軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院1.軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，2.毒物藥物研究所，北京 100850；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，山東 泰安 271016〕

注意是認(rèn)知功能第一步，持續(xù)維持高水平的警覺和注意力是信息連續(xù)加工和保持良好腦作業(yè)能力的前提。同時(shí)，注意力與感知、學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行功能有著密切聯(lián)系。事實(shí)上，注意力缺陷經(jīng)常發(fā)生在包括抑郁癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病和注意缺陷多動(dòng)障礙等神經(jīng)精神疾病中，因此，提升注意力被認(rèn)為是治療這些疾病的重要治療策略之一［1］。目前，治療注意缺陷障礙的藥物主要包括精神興奮藥（如哌甲酯）、抗抑郁藥（如托莫西汀和氟西汀）、單胺氧化酶抑制劑司立吉蘭、腎上腺素α2受體激動(dòng)劑可樂定和一些中藥等［2］。

研究表明，咖啡因（caffeine，CAF）是腺苷A1和A2受體的競(jìng)爭性拮抗劑［3］，一直以來被認(rèn)為可發(fā)揮抗疲勞、促覺醒和增加警覺的作用，但其認(rèn)知增強(qiáng)特性一直存在爭議［4］，并且在是否可提高注意力方面的報(bào)道亦存在諸多矛盾［5-7］。本研究擬系統(tǒng)評(píng)價(jià)CAF對(duì)大鼠注意力、行為控制和反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)作用。

鹽酸羥哌吡酮（代號(hào)：YL-0919）是毒物藥物研究所自主研發(fā)的新型抗抑郁小分子化合物，在多種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出抗抑郁和抗焦慮作用，且具有快速起效、增強(qiáng)認(rèn)知和不導(dǎo)致性功能障礙等潛在優(yōu)點(diǎn)，目前作為1.1 類抗抑郁新藥進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，YL-0919具有選擇性激動(dòng)Sigma-1受體的作用［9］。文獻(xiàn)報(bào)道，抗抑郁藥具有增強(qiáng)注意力的潛能［10］，本研究室前期通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單次給予YL-0919 可優(yōu)先抑制前額葉皮質(zhì)γ-氨基丁酸中間神經(jīng)元，增強(qiáng)谷氨酸能錐體神經(jīng)元興奮性［11］。同時(shí)該藥具有促認(rèn)知樣活性，但其對(duì)于作為認(rèn)知第一步的注意是否有影響尚不明確。本研究擬探究YL-0919是否通過提高注意力發(fā)揮促認(rèn)知作用及其在大鼠行為控制和反應(yīng)速度上的作用。

目前，可用于注意力評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型較少，其中五選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)間任務(wù)（5-choice serial reaction time task，5-CSRTT）是公認(rèn)的可用于檢測(cè)嚙齒動(dòng)物持續(xù)性主動(dòng)注意力的行為檢測(cè)方法［12］。該實(shí)驗(yàn)需訓(xùn)練動(dòng)物對(duì)在5 個(gè)位置中隨機(jī)呈現(xiàn)的1 個(gè)位置上的短暫視覺信號(hào)做出響應(yīng)，經(jīng)藥物或其他實(shí)驗(yàn)手段干預(yù)后，可同時(shí)反映藥物或者實(shí)驗(yàn)操作對(duì)動(dòng)物注意力、行為控制和反應(yīng)速度等的影響。由于與人類持續(xù)注意力評(píng)價(jià)——連續(xù)操作測(cè)試（continuous performance test，CPT）相似，且具有自動(dòng)化程度高和參數(shù)靈活等特點(diǎn)，5-CSRTT 在該研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［13］。

本研究運(yùn)用5-CSRTT 評(píng)價(jià)不同機(jī)制的YL-0919 和CAF 對(duì)SD 大鼠注意力、行為控制和反應(yīng)速度的影響，并比較二者作用特點(diǎn)的異同，旨在為發(fā)現(xiàn)新型注意力提升藥物及靶標(biāo)提供新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，體重180～200 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK（京）2019-0010。大鼠以每籠4 只群居飼養(yǎng)，限制進(jìn)食，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度50%～60%，12 h 黑暗/白晝交替照明（光照時(shí)間8∶00～20∶00）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均由軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審核編號(hào)：IACUC-DW2X-2022-605。

1.2 藥品、試劑和儀器

YL-0919（批號(hào)：D5222-18-001，純度＞99.9%），浙江華海藥業(yè)有限公司；CAF（批號(hào)：TC130184，純度＞99.9%），石藥集團(tuán)新諾威制藥股份有限公司。顆粒飼料（每粒45 mg，直徑0.356 cm），美國Bio-Serv 公司?；拘袨闇y(cè)試包-大鼠五孔鼻觸實(shí)驗(yàn)箱（4 組）及配套軟件（型號(hào)MED-NP5L-B1），美國Med Associates公司。實(shí)驗(yàn)箱（45 cm×25 cm×30 cm）底部為不銹鋼橫桿，其中一側(cè)壁上裝有1 個(gè)食盒和1 盞食盒燈；在對(duì)面?zhèn)缺谙路骄嗟撞? cm處有橫向等距排列且外觀一致的5 個(gè)邊長3 cm 的正方形鼻觸孔，每個(gè)鼻觸孔中各有1盞信號(hào)燈和1個(gè)紅外探測(cè)裝置，實(shí)驗(yàn)程序運(yùn)行和數(shù)據(jù)采集由軟件控制完成。

1.3 大鼠5-CSRTT行為訓(xùn)練［12］

大鼠每次訓(xùn)練或測(cè)試前禁食16～18 h。大鼠經(jīng)訓(xùn)練后用于評(píng)價(jià)藥物。整個(gè)過程中，每只大鼠在同一實(shí)驗(yàn)箱中進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試。訓(xùn)練和測(cè)試過程如圖1所示。

Fig.1 Flowchart of 5-choice serial reaction time task（5-CSRTT）testing. After acclimatization，the rats were pre-trained to master the association between light source signals and feed pellet delivery.After the rats were formally trained to master the behavioral test under the conditions of signal duration (SD)=1 s，limited hold (LH)=5 s，and interatrial interval (ITI)=5 s，the rats were tested and grouped at baseline，and then randomly balanced into normal control group and drug administration groups according to their attention levels.During the administration and formal testing phase，the above experimental conditions were maintained. Depending on the group，rats were ig given hypidone hydrochloride（code YL-0919）2.5 and 5.0 mg·kg-1，caffeine（CAF）2.5，5.0，10.0 and 20.0 mg·kg-1 or ddH2O separately 1 h before the formal test. The animals were given drugs several times. Each drug was given in order of concentration，with an interval of several days between each concentration，during which the animals were not administered but kept under training and data were recorded，and when there was no significant difference between the administered group and the model control group，the next concentration of the drug was tested on the following day. Accuracy was measured as percent correct〔correct responses/（correct responses+incorrect responses）×100%〕. Correct responses were recorded as responses made to the right stimulus location during the LH. Incorrect responses were recorded as responses made to the wrong stimulus location during the LH. An omission error was recorded as a failure to respond to the visual stimulus within the LH. Premature responses were recorded as responses made during the ITI period.Perseverant responses were recorded as responses made after a correct response but prior to the collection of food reward. Average latency to make a correct response was recorded as the average time from the onset of the light stimulus until a nosepoke into the correct niche being registered. Average latency of food reward was recorded as the average time from the registration of a correct response to the retrieval of a food reward from the magazine well.

1.3.1 預(yù)適應(yīng)

連續(xù)3 d，每天輕柔抓取撫摸大鼠使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作，以減少無關(guān)應(yīng)激刺激對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3.2 適應(yīng)訓(xùn)練

大鼠限制飲食，除訓(xùn)練過程所得顆粒飼料外，每只大鼠每天僅提供約12 g 普通飼料，以保持其訓(xùn)練時(shí)處于饑餓狀態(tài)。每天將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)15 min，每15 s投放1粒顆粒飼料供大鼠食用，共投放50 次，使其熟悉飼料顆粒的投放位置和投放方式，大鼠食用超80%飼料顆粒時(shí)進(jìn)行下一步訓(xùn)練。

1.3.3 預(yù)備訓(xùn)練

每天將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)訓(xùn)練15 min。在每輪訓(xùn)練周期中，首先隨機(jī)持續(xù)點(diǎn)亮五孔信號(hào)燈中的1 孔，當(dāng)大鼠鼻觸正確信號(hào)燈（即點(diǎn)亮的信號(hào)燈）并觸發(fā)紅外感應(yīng)時(shí)，信號(hào)燈滅，食盒燈亮，并投放一粒飼料至食盒，大鼠吃飼料后食盒燈滅，并啟動(dòng)下一輪訓(xùn)練周期。經(jīng)過訓(xùn)練，使大鼠對(duì)鼻觸正確信號(hào)燈與得到飼料顆粒建立條件反射。大鼠15 min 內(nèi)得到并食用達(dá)40粒顆粒飼料時(shí)進(jìn)入下一步訓(xùn)練。

1.3.4 正式訓(xùn)練

每天訓(xùn)練50 輪訓(xùn)練周期。首個(gè)周期開始前及相鄰訓(xùn)練周期啟動(dòng)之間的時(shí)間間隔，設(shè)為間隔期（interatrial interval，ITI），間隔期大鼠每次鼻觸五孔將記錄為1 次沖動(dòng)反應(yīng)，儀器照明燈熄滅2 s 進(jìn)行懲罰并重新開始ITI。每輪訓(xùn)練設(shè)定限定期（limited hold，LH），限定大鼠鼻觸信號(hào)燈的時(shí)間，包括信號(hào)期（signal duration，SD，5孔中隨機(jī)1孔信號(hào)燈亮的持續(xù)時(shí)間）和后續(xù)期2 個(gè)階段。ITI 結(jié)束后進(jìn)入SD，五孔信號(hào)燈隨機(jī)亮1 孔，在LH 期間，若大鼠鼻觸亮燈孔，儀器信號(hào)燈滅，食盒燈亮，并投放1 粒飼料顆粒至食盒，大鼠吃飼料后食盒燈滅，記為1次正確反應(yīng)，若投放飼料顆粒至大鼠攝食期間繼續(xù)鼻觸五孔，每次記為1次固執(zhí)反應(yīng)，從信號(hào)開始到鼻觸亮燈孔的時(shí)間記為正確潛伏期，從正確反應(yīng)至動(dòng)物開始攝食飼料顆粒的時(shí)間記為攝食潛伏期，本輪訓(xùn)練周期結(jié)束；若大鼠鼻觸未亮燈的孔，記為1 次錯(cuò)誤反應(yīng)，若未進(jìn)行鼻觸，記為1 次遺漏反應(yīng)，出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)或遺漏，儀器不投放飼料，且照明燈熄滅2 s 進(jìn)行懲罰后本輪訓(xùn)練周期結(jié)束。將SD 和LH 的起始時(shí)長設(shè)定為20 s、ITI 為5 s，在同日的50 輪訓(xùn)練周期中，SD 和LH 時(shí)長保持不變，當(dāng)大鼠準(zhǔn)確率〔正確次數(shù)（/正確次數(shù)+錯(cuò)誤次數(shù)）×100%〕達(dá)到80%，則在次日訓(xùn)練時(shí)將SD 和LH 逐步縮短（依次為15，13，12，10，8，7，6和5 s），ITI維持不變。準(zhǔn)確率未達(dá)標(biāo)的動(dòng)物以原條件繼續(xù)訓(xùn)練3 次，仍不達(dá)標(biāo)的將予以淘汰。在此之后，SD 設(shè)定逐步由5 s降至4，3.5，3，2.5，2，1.5 和1 s，LH 和ITI 保持5 s。大鼠在程序參數(shù)SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s下的行為測(cè)試中連續(xù)3 d的準(zhǔn)確率無顯著差異后進(jìn)行下一階段。

1.4 藥物干預(yù)5-CSRTT大鼠行為試驗(yàn)

1.4.1 基線測(cè)試和分組

基線測(cè)試前2 d 進(jìn)行適應(yīng)性灌胃，每天1 次（雙蒸水，0.4 mL·d-1）?；€測(cè)試連續(xù)3 d，測(cè)試程序參數(shù)：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，每天測(cè)試15 min 或50 輪測(cè)試周期，記錄大鼠操作基線，觀察指標(biāo)為準(zhǔn)確率、正確次數(shù)、錯(cuò)誤次數(shù)和遺漏次數(shù)。依據(jù)準(zhǔn)確率將大鼠隨機(jī)均衡分為模型對(duì)照組（雙蒸水）和給藥（CAF或YL-0919）組，每組16只。

1.4.2 給藥和正式測(cè)試

測(cè)試程序參數(shù)：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，測(cè)試15 min或50輪測(cè)試周期。測(cè)試前1 h，大鼠依據(jù)分組單次ig 給予雙蒸水、YL-0919（2.5 和5.0 mg·kg-1）或CAF（2.5，5.0，10.0和20.0 mg·kg-1）。觀察指標(biāo)包括注意力評(píng)價(jià)指標(biāo)（準(zhǔn)確率、正確次數(shù)、錯(cuò)誤次數(shù)和遺漏次數(shù)）；行為控制評(píng)價(jià)指標(biāo)（沖動(dòng)次數(shù)和固執(zhí)次數(shù)）；反應(yīng)速度評(píng)價(jià)指標(biāo)（平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期）。

訓(xùn)練達(dá)標(biāo)的動(dòng)物重復(fù)給藥，各藥物按劑量從低到高的順序給予，2 次給藥測(cè)試間間隔數(shù)日，期間動(dòng)物保持訓(xùn)練（程序參數(shù)同測(cè)試程序）并記錄上述行為評(píng)價(jià)指標(biāo)，當(dāng)給藥組與模型對(duì)照組注意力評(píng)價(jià)指標(biāo)無顯著差異時(shí)，于次日進(jìn)行下一濃度藥物的測(cè)試。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，兩組間比較采用Studentt檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAF對(duì)5-CSRTT大鼠注意力的影響

如圖2 所示，與模型對(duì)照組相比，CAF 2.5 和5.0 mg·kg-1組大鼠行為反應(yīng)的準(zhǔn)確率、正確次數(shù)、錯(cuò)誤次數(shù)和遺漏次數(shù)均無顯著差異，但10.0 和20.0 mg·kg-1組正確次數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），準(zhǔn)確率亦顯著下降（P＜0.05）。由此提示，CAF 10.0和20.0 mg·kg-1可減弱大鼠注意力。

Fig. 2 Effect of CAF on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.2 CAF 對(duì)5-CSRTT 大鼠行為控制和反應(yīng)速度的影響

如圖3所示，與模型對(duì)照組相比，在行為控制指標(biāo)中，僅CAF 20.0 mg·kg-1組大鼠沖動(dòng)次數(shù)顯著增多（P＜0.01），2.5，5.0 和10.0 mg·kg-1組沖動(dòng)次數(shù)和固執(zhí)次數(shù)均無顯著差異；在反應(yīng)速度指標(biāo)中，CAF 2.5，5.0，10.0 和20.0 mg·kg-1組平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期均無顯著差異。由此提示，CAF 20.0 mg·kg-1可減弱行為控制，增強(qiáng)沖動(dòng)，但不影響反應(yīng)速度。

Fig.3 Effect of CAF on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and the annotate.±s，n=16.＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.3 YL-0919對(duì)5-CSRTT大鼠注意力的影響

如圖4 所示，與模型對(duì)照組相比，YL-0919 5.0 mg·kg-1組錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05），準(zhǔn)確率顯著提高（P＜0.05），正確次數(shù)和遺漏次數(shù)無顯著差異；2.5 mg·kg-1組準(zhǔn)確率、正確次數(shù)、錯(cuò)誤次數(shù)和遺漏次數(shù)均無顯著差異。由此提示，單次ig給予YL-0919 5.0 mg·kg-1可通過同時(shí)減少錯(cuò)誤次數(shù)和提高準(zhǔn)確率而提高大鼠注意力。

Fig.4 Effect of YL-0919 on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats. See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.＊P＜0.05，compared with model control group.

2.4 YL-0919 對(duì)5-CSRTT 大鼠行為控制和反應(yīng)速度的影響

如圖5 所示，與模型對(duì)照組相比，YL-0919 2.5和5.0 mg·kg-1組大鼠沖動(dòng)次數(shù)、固執(zhí)次數(shù)、平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期均無顯著差異，提示單次ig 給予YL-0919 2.5 和5.0 mg·kg-1對(duì)大鼠行為控制和反應(yīng)速度無明顯影響。

Fig.5 Effect of YL-0919 on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.

3 討論

5-CSRTT 是模擬人類持續(xù)注意力評(píng)價(jià)范式CPT，用以測(cè)試嚙齒動(dòng)物注意行為的經(jīng)典行為范式［12］。5-CSRTT 旨在發(fā)現(xiàn)治療注意力缺陷障礙和阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，也可用于探索注意力和沖動(dòng)性的神經(jīng)生物學(xué)過程。據(jù)報(bào)道，基于5-CSRTT已發(fā)現(xiàn)尼古丁［14］、安非他明［5］、哌甲酯［5］和托莫西?。?5］等化合物具有提高注意力的作用，表現(xiàn)為提高準(zhǔn)確率或減少?zèng)_動(dòng)行為等。

CAF 被認(rèn)為可能具有提高注意力的作用，但一直存在爭議［5-7］。Higgins 等［6］發(fā)現(xiàn)，單次ip 給予CAF（1.0～10.0 mg·kg-1）不影響準(zhǔn)確率和遺漏次數(shù)，而單次ip 給予CAF（10.0 mg·kg-1）顯著增加沖動(dòng)次數(shù)，這與本研究中ig 給予CAF（10.0 和20.0 mg·kg-1）減弱注意力，同時(shí)增加沖動(dòng)行為的結(jié)果相類似。結(jié)合文獻(xiàn)和本研究結(jié)果，提示CAF 在本研究受試劑量范圍內(nèi)主要表現(xiàn)為增強(qiáng)動(dòng)物沖動(dòng)和警覺，而不影響甚至減弱注意力。提示CAF 更多的表現(xiàn)為抗疲勞、提高警覺效應(yīng)而非注意力增強(qiáng)作用。

YL-0919 是選擇性Sigma-1 受體激動(dòng)劑［9］，在1.25～5.0 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)具有抗抑郁活性［16-18］。本研發(fā)現(xiàn)，YL-0919 在其抗抑郁劑量范圍內(nèi)可通過減少錯(cuò)誤次數(shù)和提高準(zhǔn)確率顯著提高大鼠注意力，同時(shí)不影響行為控制和反應(yīng)速度。提示提升注意力可能YL-0919 發(fā)揮抗抑郁、促認(rèn)知作用的作用特點(diǎn)之一。文獻(xiàn)表明，Sigma-1受體激動(dòng)劑具有增強(qiáng)認(rèn)知作用［19-20］，因此該受體可能參與了YL-0919 的注意增強(qiáng)作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，CAF 和YL-0919 在5-CSRTT 中具有不同的作用特點(diǎn)，YL-0919 可提高正常SD 大鼠的注意力，表現(xiàn)為減少大鼠在5-CSRTT 中的錯(cuò)誤次數(shù)，提高準(zhǔn)確率，且不影響大鼠的行為控制和反應(yīng)速度；CAF 可降低大鼠注意力并減弱行為控制能力，表現(xiàn)為減少正確次數(shù)，降低準(zhǔn)確率并增加沖動(dòng)次數(shù)。未來將針對(duì)更多劑量和更多給藥方式對(duì)二者作用的異同進(jìn)行進(jìn)一步研究。