溶瘤病毒和自然殺傷細(xì)胞來源外泌體殺傷腫瘤作用的研究進(jìn)展

李 雪，王 華

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法包括化療、放療和手術(shù)治療等，單獨(dú)治療后易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［1］，因此聯(lián)合治療是腫瘤治療的發(fā)展趨勢。目前多種治療手段聯(lián)合應(yīng)用在腫瘤治療中取得較好效果，如放療聯(lián)合抗血管生成治療、放療聯(lián)合免疫治療、雙免疫聯(lián)合療法和靶向治療聯(lián)合抗血管生成治療等［2］?，F(xiàn)代免疫療法中，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OV）成為使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后無反應(yīng)或不能實現(xiàn)持久反應(yīng)腫瘤患者的潛在治療選擇。OV 通過選擇性感染腫瘤細(xì)胞，在靶細(xì)胞中大量復(fù)制并最終使其裂解，同時還能引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)實體瘤免疫抑制微環(huán)境，從免疫抑制轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ睿?］。基于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，將OV 與不同抗腫瘤藥物合理組合，可能會進(jìn)一步提高腫瘤治療的效果。自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）來源的外泌體（NK-derived exosomes，NK-Exo）具有納米級大小、較強(qiáng)的組織穿透性和較低的免疫原性等特點(diǎn)，成為基于細(xì)胞療法的腫瘤治療研究熱點(diǎn)。NK-Exo 內(nèi)含有許多細(xì)胞毒性蛋白，可引起腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，其還可攜帶抗腫瘤藥物，借助其腫瘤靶向能力，將抗腫瘤藥物精準(zhǔn)帶至腫瘤組織。除細(xì)胞毒性作用和傳遞藥物外，NK-Exo 還可刺激免疫細(xì)胞，減弱腫瘤細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)，通過旁分泌途徑或循環(huán)系統(tǒng)靶向免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［4］。NK-Exo憑借其抗腫瘤特性、介導(dǎo)免疫細(xì)胞活化的能力和下調(diào)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的能力，與OV 的抗腫瘤作用可能相輔相成。本文主要綜述OV 和NK-Exo 治療腫瘤的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展，以期為發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤策略提供思路。

1 溶瘤病毒治療腫瘤的作用

OV 是一類能選擇性感染和殺傷腫瘤細(xì)胞的病毒，具有特異性復(fù)制能力，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時不會對正常細(xì)胞造成傷害。作為一種新型免疫療法，OV 在近幾十年逐漸發(fā)展為基因療法的一大熱點(diǎn)，該治療策略也逐漸得到廣泛關(guān)注［5］。按遺傳物質(zhì)的不同可將OV 分為2 類：DNA病毒和RNA 病毒。DNA 病毒有皰疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，RNA 病毒有呼吸道腸道病毒、柯薩奇病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒。

近年來，隨生物技術(shù)的發(fā)展，OV 作為一種有效的腫瘤治療手段取得里程碑的進(jìn)展。截至目前共上市4 款OV 類藥物：ECHO-7 病毒（Rigvir）、重組人5 型腺病毒注射液（安柯瑞，oncorine）、單純皰疹病毒（Lmlygic，又稱為T-VEC）和第3 代溶瘤單純皰疹病毒1 型Teserpaturev（Delytact，G47Δ），其中ECHO-7（Rigvir）病毒主要適用于黑色素瘤，重組人5 型腺病毒注射液（安柯瑞）主要適用于頭頸癌、肝癌、胰腺癌和宮頸癌等，單純皰疹病毒（Lmlygic）主要適用于晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，Teserpaturev（Delytact，G47Δ）主要適用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤或任何原發(fā)性腦癌［6］。目前已有多種病毒作為OV 載體開展了臨床試驗［7］。截至2023 年3 月，在ClinicalTrials.gov 網(wǎng)站注冊的溶瘤病毒治療腫瘤的臨床研究158 余項，其中單純皰疹病毒（Lmlygic）已開展針對黑色素瘤、頭頸癌、乳腺癌和胃癌患者的臨床試驗［8］；腺病毒（DNX-2401）已開展針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床試驗［9］；牛痘病毒（Pexa-Vec）已針對索拉非尼耐藥性肝細(xì)胞癌開展臨床試驗［10］；新城疫病毒（NDV MTH-68/H）已針對結(jié)直腸癌、霍奇金病、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤開展臨床試驗［11］；呼腸孤病毒（Reolysin）針對乳腺癌、頭頸癌和黑色素瘤開展臨床試驗［12］。

1.1 溶瘤病毒抗腫瘤作用機(jī)制

OV通過2種不同的作用機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤活性，一是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的直接溶解作用，二是誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫。OV 進(jìn)入腫瘤部位，首先通過直接溶瘤作用引起腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD），釋放多種腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA），TAA 與樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）識別結(jié)合后，通過淋巴反流進(jìn)入淋巴結(jié)，將腫瘤抗原信息呈遞給淋巴結(jié)中的幼稚T 細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化產(chǎn)生腫瘤特異性效應(yīng)T 細(xì)胞，激活腫瘤免疫反應(yīng)。隨著持續(xù)溶瘤和T 細(xì)胞特異性免疫攻擊，釋放出更多TAA，并通過DC 呈遞產(chǎn)生更多效應(yīng)T 細(xì)胞，引起一系列特異性腫瘤免疫應(yīng)答。此外，分布在腫瘤淋巴結(jié)或局部炎癥部位的記憶T細(xì)胞可對遠(yuǎn)處腫瘤進(jìn)行免疫追蹤，分化成效應(yīng)T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，減少惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［13］。其中，ICD 在獲得性抗腫瘤免疫方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［14］。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中OV 復(fù)制誘導(dǎo)產(chǎn)生ICD 時，可釋放TAA、損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns）以及OV 衍生的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns），同時表達(dá)上調(diào)多種炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而激活免疫反應(yīng)［15］。

1.2 溶瘤病毒遞送

OV 的有效性依賴于足夠數(shù)量的病毒感染目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，使其裂解并將OV 擴(kuò)散到鄰近腫瘤細(xì)胞。因此，OV 最大的挑戰(zhàn)就是有效遞送，進(jìn)而提高其對腫瘤細(xì)胞的感染效率，使OV 感染更多的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到更好的治療效果，從而延長患者存活期。

目前OV 的主要遞送途徑是瘤內(nèi)注射，有利于病毒直接進(jìn)入腫瘤，避免抗載體免疫力的攻擊及滯留在某些脫靶位置，降低在非目標(biāo)細(xì)胞中復(fù)制的風(fēng)險，可精確控制腫瘤微環(huán)境中OV濃度，腫瘤區(qū)域濃度最大化，減少病毒清除，從而獲得更好的治療效果。

除瘤內(nèi)注射外，靜脈給藥也是一種常見的給藥途徑。為克服中和抗體的中和作用和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用，有研究利用生物相容性聚合物如聚乙二醇和聚甲基丙烯酸羥丙酯對病毒外殼蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，使病毒免受抗體中和作用，同時延長病毒血液循環(huán)時間；或通過使用環(huán)磷酰胺預(yù)處理消耗體液中的補(bǔ)體和免疫球蛋白等，抑制或延遲機(jī)體抗病毒反應(yīng)，避免病毒被快速清除［16］。

近年來，基于細(xì)胞的遞送載體成為最具潛力的OV 遞送載體之一。利用細(xì)胞載體攜帶OV，可克服給藥后的抗體中和、補(bǔ)體失活，規(guī)避宿主免疫系統(tǒng)對OV 的識別。常用的細(xì)胞載體有轉(zhuǎn)化細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞等實體瘤細(xì)胞）、免疫細(xì)胞（T 細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞）及祖細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和血管祖細(xì)胞）［17］。目前，已有多種細(xì)胞遞送載體被成功應(yīng)用于OV 遞送。研究表明，骨髓瘤細(xì)胞可將麻疹病毒遞送到骨髓中的轉(zhuǎn)移性腫瘤［18］。面對機(jī)體存在的中和抗體時，DC 搭載呼腸孤病毒可攜帶并運(yùn)送病毒至目的腫瘤［19］；抗原特異性T 細(xì)胞可以搭載水皰性口炎病毒、單純皰疹病毒、新城疫病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒［20-23］，通過多種機(jī)制將其遞送到腫瘤細(xì)胞。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞具有腫瘤歸巢特性，也是常用的OV 遞送細(xì)胞載體［24-25］。

1.3 溶瘤病毒腫瘤趨向性和瘤內(nèi)擴(kuò)散增強(qiáng)策略

與正常血管相比，腫瘤血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)紊亂，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上過表達(dá)的抗原有血管內(nèi)皮生長因子受體2、血管細(xì)胞黏附因子和內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞黏附分子1 等。盡管OV 具有基于腫瘤細(xì)胞上一些過度表達(dá)的受體和黏附分子的腫瘤趨向性，但這種趨向性尚有待增強(qiáng)。有研究表明，攜帶血管內(nèi)皮生長因子的辛德畢斯病毒（Sindbis virus）和一定劑量紫杉醇聯(lián)合治療可通過增加腫瘤血管內(nèi)皮通透性和載體遞送，促進(jìn)病毒在腫瘤內(nèi)的遞送、感染和增殖，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同作用，治療腫瘤［26］。

此外，還有研究表明，通過基因編輯技術(shù)把牛痘病毒的B18R基因摻入溶瘤單純皰疹病毒，可克服腫瘤內(nèi)殘留的抗病毒反應(yīng)，提高抗腫瘤活性，實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)［27］；還可使用小分子化學(xué)增敏劑中和腫瘤內(nèi)殘留的抗病毒活性，如組蛋白去乙?；敢种苿┛梢种颇[瘤細(xì)胞中殘留的干擾素反應(yīng)［28］，從而獲得更好的抗腫瘤效果。常見的小分子化學(xué)增敏劑還有西羅莫司等，可通過抑制腫瘤抗病毒反應(yīng)，減緩抗溶瘤病毒中和抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)溶瘤病毒的瘤內(nèi)傳播［29］。

1.4 溶瘤病毒與其他療法聯(lián)合應(yīng)用

由于物理屏障、腫瘤異質(zhì)性和免疫抑制微環(huán)境的存在，目前OV 療法的有效性尚待提高［30］。為克服OV單藥治療的局限性，研究人員嘗試以O(shè)V為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療，包括與放療、化療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）-T細(xì)胞治療等聯(lián)合，協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤療效［31］。

1.4.1 OV與化療和放療等傳統(tǒng)抗腫瘤治療相結(jié)合

溶瘤性牛痘病毒靜脈給藥，聯(lián)合放化療治療晚期頭頸癌患者的Ⅰ期臨床試驗顯示，溶瘤性牛痘病毒的有效性和安全性可通過放化療得到提高［32］。研究表明，在化療（吉他西濱、伊立替康或氟尿嘧啶）過程中加入Pelareorep（一種靜脈注射溶瘤呼腸孤病毒）和帕博利珠單抗（pembrolizumab），治療胰腺導(dǎo)管腺癌安全有效［33］。

1.4.2 OV與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相結(jié)合

已有多項臨床試驗開展了OV 與針對多個免疫檢查點(diǎn)的抗體的聯(lián)合抗腫瘤作用研究，其中程序性死亡受體1（programmed death receptor-1，PD-1）/細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）聯(lián)合療法表現(xiàn)出較好的治療效果［34］。有研究評估了表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的溶瘤病毒單純皰疹病毒（Lmlygic）與抗CTLA-4抗體伊匹木單抗（ipilimumab）聯(lián)合使用，在晚期黑色素瘤患者中的有效性和安全性。結(jié)果表明，與單獨(dú)使用伊匹木單抗相比，聯(lián)合單純皰疹病毒（Lmlygic）可顯著增強(qiáng)全身抗腫瘤反應(yīng)和具有更高的安全性，可能在晚期黑色素瘤治療中具有重要的臨床應(yīng)用價值［35］。攜帶腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和重組人白細(xì)胞介素2（recombinant human interleukin-2，IL-2）的溶瘤腺病毒聯(lián)合PD-1 阻斷抗體可導(dǎo)致小鼠黑色素瘤完全消退［36］。

1.4.3 OV與CAR-T細(xì)胞療法相結(jié)合

建立人胰腺導(dǎo)管腺癌異種移植免疫缺陷小鼠模型，用攜帶TNF-α 和IL-2 的溶瘤腺病毒（Ad-mTNFα-mIL2）與表達(dá)間皮素的CAR-T 細(xì)胞（meso-CAR-T）進(jìn)行聯(lián)合治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ad-mTNFαmIL2 增加CAR-T 細(xì)胞和宿主T 細(xì)胞對免疫抑制性胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤浸潤，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 極化和DC成熟，可改變腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀態(tài)［37］。

綜上所述，OV 通過在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，殺死腫瘤細(xì)胞，激活宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并在腫瘤微環(huán)境中募集更多的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，通過多種途徑觸發(fā)腫瘤內(nèi)的多機(jī)制細(xì)胞死亡途徑達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果［38］。OV 的溶瘤能力取決于病毒的類型、治療劑量以及病毒嗜性等，因此需要為每種腫瘤研發(fā)出適合的OV，通過最佳遞送系統(tǒng)和最佳聯(lián)合療法獲得更好的療效和更高的安全性。由于OV 是一種條件復(fù)制型病毒，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時還會發(fā)生復(fù)制，可能導(dǎo)致不同模型或個體有效劑量的不同，因此在相關(guān)非臨床模型和臨床試驗中進(jìn)一步建立安全有效的給藥指南非常重要。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和早期診斷失敗，導(dǎo)致OV作為單一的抗腫瘤藥物可能無法成功治愈腫瘤。因此，需要合理的聯(lián)合治療策略，克服OV 和其他療法的固有局限性，如OV 因其可上調(diào)腫瘤局部免疫檢查點(diǎn)表達(dá)，因此可與NK-Exo 相結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果。

2 NK來源外泌體治療腫瘤的作用

外泌體是幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放的納米囊泡，其內(nèi)包裹蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)。在生理環(huán)境中，通過配體-受體相互作用和質(zhì)膜融合等不同機(jī)制與近距離或遠(yuǎn)距離的靶細(xì)胞相互作用，從而將其攜帶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞［39］，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和其他信號通路，對靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。通常外泌體可表達(dá)其來源細(xì)胞的特定蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮與其來源細(xì)胞相似的特定功能。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)外泌體在機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移和腫瘤侵襲等方面均發(fā)揮重要作用［40］。同時，腫瘤微環(huán)境中低氧和酸性環(huán)境對外泌體影響較小，使其更容易在腫瘤組織內(nèi)擴(kuò)散，這些特征使得外泌體成為腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

NK 細(xì)胞是一類在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，在抗擊腫瘤和病原體的免疫防御中發(fā)揮重要作用，通過與DC、T細(xì)胞和B 細(xì)胞交流，調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并通過釋放細(xì)胞毒性分子或連接活化受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是宿主天然免疫的重要組成部分，是抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線。同時，NK 細(xì)胞可在無抗原致敏、無抗體參與且無主要組織相容性復(fù)合物限制的情況下非特異性直接殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用［41］。

NK-Exo 含有典型的NK 分子，如CD56、NK2家族成員D、FasL、穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素及多種細(xì)胞毒性蛋白、微RNA（microRNA，miRNA）和細(xì)胞因子，同時NK-Exo 可在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對腫瘤具有殺傷作用［42］。越來越多的研究表明，NK-Exo 與NK 細(xì)胞具有相似的抗腫瘤活性，除抗腫瘤作用外，NK-Exo 還具有免疫調(diào)節(jié)功能［43-49］，因此在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

2.1 攜帶細(xì)胞毒性蛋白的抗腫瘤作用

有研究表明，NK-Exo 的細(xì)胞毒性作用不是依靠單一的蛋白質(zhì)，穿孔素、顆粒酶A、顆粒酶B以及顆粒溶素均可在殺傷腫瘤的過程中發(fā)揮作用。NK-Exo釋放的穿孔素，可在外泌體與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合時發(fā)揮打孔作用，在靶細(xì)胞膜上形成孔道，使得外泌體中的顆粒酶直接進(jìn)入靶細(xì)胞。NK-Exo 進(jìn)入靶細(xì)胞后可觸發(fā)胱天蛋白酶依賴性細(xì)胞凋亡和胱天蛋白酶非依賴性細(xì)胞凋亡。顆粒酶B可直接激活信號級聯(lián)反應(yīng)，破壞線粒體，釋放細(xì)胞色素c，從而激活胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3 和胱天蛋白酶7，誘導(dǎo)胱天蛋白酶依賴性細(xì)胞凋亡。顆粒酶A通過誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激反應(yīng)，釋放活性氧，導(dǎo)致單鏈DNA 損傷；同時，顆粒溶素直接損傷靶細(xì)胞膜并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而介導(dǎo)胱天蛋白酶非依賴性細(xì)胞凋亡［50］。另外，在NK-Exo 中還可檢測出FasL 的表達(dá)，F(xiàn)asL 通過與質(zhì)膜上的Fas相互作用介導(dǎo)對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用［51］。因此，胱天蛋白酶信號傳導(dǎo)、線粒體應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和Fas/FasL 信號通路在NK-Exo 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。

2.2 攜帶微RNA 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

miRNA 是一種單鏈非編碼小分子RNA，其可通過結(jié)合位于轉(zhuǎn)錄本3′-非翻譯區(qū)的互補(bǔ)序列來調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯［52］。目前對NK-Exo中miRNA的研究較少。研究表明，攜帶腫瘤抑制性miR-186的NK-Exo 可通過下調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的關(guān)鍵癌基因MYCN和極光激酶A 表達(dá)，抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖；同時通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)，減弱對NK 細(xì)胞的抑制作用，使NK 細(xì)胞繼續(xù)發(fā)揮殺傷作用，最終誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡［48］。另有研究表明，NK-Exo中富含的miR-3607-3p 可通過靶向IL-26 抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制胰腺癌發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化；同時發(fā)現(xiàn)，NK 細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞抑制作用也依賴于miR-3607-3p［53］。因此，NK-Exo 攜帶的miRNA 可通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。值得注意的是，NK-Exo的抗腫瘤活性已在體外和體內(nèi)得到證實，而其對正常細(xì)胞生長無影響［51］。

2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

有研究表明，腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)的TGF-β 可以有效抑制NK 細(xì)胞活性，TGF-β下調(diào)NK 細(xì)胞表面活化受體NK 細(xì)胞蛋白30 和自然殺傷細(xì)胞G2 家族（NK cell G2 family，NKG2）并降低腫瘤細(xì)胞表面NKG2 配體的表達(dá)，從而產(chǎn)生抑制性免疫環(huán)境［54］。除細(xì)胞毒性作用外，NK 細(xì)胞還通過釋放外泌體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，NK-Exo 通過旁分泌作用或遠(yuǎn)距分泌作用靶向免疫系統(tǒng)，減輕腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用。

NK-Exo 可激活免疫細(xì)胞。NK-Exo 與外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后，CD3+亞群中CD25+T細(xì)胞比例升高，細(xì)胞因子釋放增強(qiáng)，T 細(xì)胞激活增加。在免疫抑制條件下，NK-Exo 能夠激活單核細(xì)胞、T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞［55］，同時促進(jìn)巨噬細(xì)胞中M1極化，增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，同時抑制精氨酸酶1 活性［56］。此外，NK-Exo 可活化NK 細(xì)胞，經(jīng)過神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞預(yù)暴露處理的NK-Exo 活化NK細(xì)胞表面天然細(xì)胞毒性受體（natural cytotoxicity receptor，NCR），并使NK 細(xì)胞高表達(dá)NCR，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有更高的細(xì)胞毒性［57］。最近有研究表明，NK-Exo 可將TGF-β 抑制劑和硒代半胱氨酸共同運(yùn)送到小鼠腫瘤組織，與NK 細(xì)胞協(xié)同作用，在小鼠體內(nèi)增強(qiáng)抗癌功效［58］。還有研究發(fā)現(xiàn)，NK-Exo 可降低CD3/CD28 刺激的T 細(xì)胞上PD-1表達(dá)［55］，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境對T 細(xì)胞的免疫抑制，使T 細(xì)胞恢復(fù)正常激活狀態(tài)，恢復(fù)免疫系統(tǒng)抑制腫瘤的能力。

綜上所述，NK-Exo 在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制，增強(qiáng)抗腫瘤免疫，使其成為腫瘤免疫治療的候選藥物。對于實體瘤低氧且酸性的腫瘤微環(huán)境來說，注入NK 細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療最大的缺陷是NK 細(xì)胞無法有效的歸巢到腫瘤發(fā)生部位［59］；同樣，一些腫瘤細(xì)胞通過酸性腫瘤微環(huán)境下調(diào)NK 細(xì)胞表面受體表達(dá)而抑制穿孔素/含顆粒酶顆粒釋放和Fas/FasL 相互作用，進(jìn)而抑制NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用［60］。有研究表明，酸性腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取外泌體［61］。同時NK-Exo 可利用其納米級尺寸和較低的免疫原性進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，在細(xì)胞間或細(xì)胞與環(huán)境之間進(jìn)行交流。因此，未來的抗腫瘤策略可能基于NK-Exo，克服基于細(xì)胞治療引發(fā)的所謂“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的風(fēng)險。NK-Exo 的異質(zhì)性會導(dǎo)致質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和治療劑量不統(tǒng)一，進(jìn)而造成實驗結(jié)果可重復(fù)性差，治療效果差異大。此外，我國目前尚無外泌體制劑制備的管理規(guī)范，使用不同制備工藝、不同設(shè)備生產(chǎn)的外泌體很可能具有不同的特性和功能。雖然NK-Exo 在模型小鼠中表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性，但其也可聚積在正常組織或器官［62］，因此需進(jìn)一步提高其靶向能力。另外，天然分泌的NK-Exo 產(chǎn)量較低?？傊?，NK-Exo 的異質(zhì)性、規(guī)?；鸵?guī)范化生產(chǎn)及儲存亦是其臨床應(yīng)用必須克服的難題。

3 OV與NK-Exo聯(lián)合治療腫瘤的可能性

OV 與放療、化療、免疫療法和細(xì)胞療法等聯(lián)合療法均取得了顯著的治療效果，提示在今后研究中，可考慮OV 與NK-Exo 聯(lián)合治療，將具有腫瘤特異性復(fù)制能力、刺激有效抗腫瘤免疫應(yīng)答的OV 與可直接殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、下調(diào)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的NK-Exo 相結(jié)合，通過恢復(fù)免疫活性、提高殺傷作用以促進(jìn)OV 對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，最大程度提高腫瘤治療效果，彌補(bǔ)單一療法的不足。因此，需進(jìn)一步通過非臨床和臨床研究，確定OV 與NK-Exo 聯(lián)合治療是否可通過協(xié)同作用誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)并減少免疫抑制細(xì)胞浸潤而最大限度地發(fā)揮抗腫瘤效果。