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      高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液和尿液中12種殺鼠劑

      2023-10-25 05:12:00游慧圓劉云富譚廣輝吳燕梅
      化學(xué)分析計(jì)量 2023年9期
      關(guān)鍵詞:鼠藥乙腈液相

      游慧圓,劉云富,譚廣輝,吳燕梅

      (1. 惠州市職業(yè)病防治院,廣東惠州 516008; 2. 惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心,廣東惠州 516008)

      殺鼠劑種類繁多,使用廣泛。其中抗凝血?dú)⑹髣┳?944 年面世以來,由于其適口性好,不易產(chǎn)生抗食性,具有廣譜、高效、可口、毒性相對(duì)較低、不易引起二次中毒且有特效解毒藥維生素K1等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于室內(nèi)外殺鼠,是我國(guó)目前使用最廣泛的的殺鼠劑,既有利于徹底消滅投餌區(qū)的鼠群,而又能減少非靶標(biāo)動(dòng)物誤食中毒機(jī)會(huì)。但由于使用范圍廣或管理疏漏,人和動(dòng)物中毒及投毒事件時(shí)見報(bào)道[1-9]。

      安妥又名1-萘基硫脲、α-萘硫脲,是一種硫脲類急性殺鼠劑,選擇性強(qiáng),主要用于防治褐家鼠及黃毛鼠。安妥能引起急性中毒且能致癌,所以國(guó)家已經(jīng)明令禁止在鼠藥中使用安妥,但因其對(duì)鼠類殺滅效果好,市場(chǎng)上仍有銷售,安妥致人、畜中毒事件時(shí)有發(fā)生[10-12]。鼠立死是一種高效、劇毒、急性殺鼠劑,其毒作用為維生素B6 拮抗劑,干擾r-氨基丁酸的氨基轉(zhuǎn)移和脫羧反應(yīng),中毒癥狀為典型的神經(jīng)性毒劑癥狀具有滅鼠譜廣、使用濃度低的特點(diǎn)。鼠立死的突出優(yōu)點(diǎn)是蓄積毒性微弱,不易發(fā)生二次中毒,有高效解毒劑、毒餌濃度低,是一種理想的急性殺鼠劑,被用于田野滅鼠。毒鼠堿是由馬錢子中提取的一種生物堿,可用作鼠藥以控制嚙齒類動(dòng)物,但其對(duì)大多數(shù)家畜有很高的毒性作用,曾有文獻(xiàn)報(bào)道毒鼠堿所致人員中毒情況[13]。

      由于抗凝血?dú)⑹髣┓N類繁多,化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,容易混淆,而且不易揮發(fā),所以目前對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┑臋z測(cè)研究主要集中于液相色譜法[14-18]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-26]。見諸報(bào)道的安妥測(cè)定法有液相色譜法[27]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[25,28],鼠立死用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20,30]或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[29]測(cè)定,而毒鼠堿的測(cè)定方法未見報(bào)道。由于鼠藥種類繁多,臨床救治迫切需要實(shí)驗(yàn)室能夠在短時(shí)間內(nèi)確定毒物種類,所以目前鼠藥測(cè)定方法的研究主要集中于多組分同時(shí)測(cè)定。

      筆者利用液相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 法,建立了血液和尿液樣品中溴鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆、殺鼠靈、氯殺鼠靈、克滅鼠、異殺鼠酮、氯敵鼠、敵鼠、鼠立死、安妥、毒鼠堿12種滅鼠劑的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)便、快速,準(zhǔn)確度高,精密度好,適用于疑似鼠藥中毒病人的全血和尿液樣品中鼠藥的定性、定量測(cè)定,為化學(xué)中毒原因分析和臨床救治提供技術(shù)支撐。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 主要儀器與試劑

      超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:6460型,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

      MS3型漩渦混合器:MS3型,德國(guó)IKA公司。

      全自動(dòng)平行濃縮儀:Auto EVA 80,??萍瘓F(tuán)(廈門)股份有限公司。

      超聲波清洗器:KQ7200DV 型,江蘇金怡儀器科技有限公司。

      漩渦振蕩器:SL-0246 型,美國(guó)Scientific Industries(思博明)公司。

      高速臺(tái)式離心機(jī):Allegra 64R 型,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

      純水系統(tǒng):Direct-Q型,美國(guó)密理博有限公司。

      乙腈:色譜純,德國(guó)默克公司。

      甲酸、乙酸銨:優(yōu)級(jí)純,天津科密歐有限公司。

      10 種殺鼠劑標(biāo)準(zhǔn)溶液:質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,溴鼠靈,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23008-100M;殺鼠醚,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23009-100M;殺鼠靈,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23011-100 A;氯殺鼠靈,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23001-100M;克滅鼠,溶劑為乙腈,編號(hào)為1ST23012-100 A;異殺鼠酮,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23003-100M;氯敵鼠,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST000467-100M;鼠立死,溶劑為甲醇,編號(hào)為1ST23006-100M;安妥,溶劑為乙腈,編號(hào)為1ST000665-100 A;毒鼠堿,溶劑為乙腈,編號(hào)為1ST23016-100 A;天津阿爾塔公司。

      溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)溶液:質(zhì)量濃度為100 μg/mL,溶劑為乙酸乙酯,編號(hào)為SB05-141-2008,農(nóng)業(yè)保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

      敵鼠標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 μg/mL,溶劑為甲醇,編號(hào)為1033,北京中衛(wèi)永晟科技有限公司。

      質(zhì)量控制樣品:各組分質(zhì)量濃度均為0.1 μg/L,(1)含有牛血中溴鼠靈和溴敵隆,編號(hào)為GDOHNY BZ005;(2)尿中殺鼠醚和殺鼠靈,編號(hào)為GDOHN YBZ017,廣東省職業(yè)病防治院。

      實(shí)驗(yàn)用水:經(jīng)超純水機(jī)制取的超純水。

      1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

      分別移取12 種殺鼠劑各0.5 mL 于10 mL 容量瓶中,加入乙腈定容至標(biāo)線,配制成各組分質(zhì)量濃度均為5.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;另取10 只2 mL容量瓶,每5 只1 組,分成2 組,每組分別加入0、20、40、200、400 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,分別以全血/尿液空白基質(zhì)配制校準(zhǔn)工作溶液,配制成各組分質(zhì)量濃度均分別為0.0、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的血液、尿液基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

      1.3 樣品預(yù)處理

      取1 mL 血樣(或尿樣)于10 mL 離心管中,以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min,取上層清液至另一離心管中,渦旋振蕩的同時(shí)加入3 mL 乙腈,再以15 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min,上清液全部轉(zhuǎn)移至另一10 mL塑料萃取管中,置于40 ℃氮吹儀上濃縮吹干至0.5 mL,取上清液進(jìn)樣。

      1.4 儀器工作條件

      1.4.1 色譜儀

      色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3.0 mm × 150 mm,1.8 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);進(jìn)樣體積:6 μL;流動(dòng)相:A 相為5 mmol/L 乙酸銨-0.02 %甲酸-水,B 相為乙腈,A 與B 的體積比為1∶1,流量為0.50 mL/min,梯度洗脫見表1;柱溫:40 ℃。

      1.4.2 質(zhì)譜儀

      多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;含噴射流離子聚焦技術(shù)的電子噴霧離子源;霧化器壓力:276 KPa;干燥氣:空氣,溫度為280 ℃,流量為9.0 L/min;鞘氣:空氣,溫度為350 ℃,流量為11 L/min;毛細(xì)管電壓:正、負(fù)離子模式分別為4 000、3 500 V;噴嘴電壓:正、負(fù)離子模式均為500 V;掃描方式:鼠立死、安妥、毒鼠堿三種殺鼠劑為正離子掃描,其余9 種為負(fù)離子掃描。12 種鼠藥的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

      表2 12種鼠藥的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

      1.5 定量方法

      以全血和尿液空白基質(zhì)配制校準(zhǔn)溶液,經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè),以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

      試驗(yàn)比較了HLB 固相萃取法和液液萃取法兩種樣品處理方法。結(jié)果表明,HLB固相萃取法用時(shí)過長(zhǎng),回收率太低,不利于對(duì)中毒樣品的應(yīng)急處理。由于中毒樣品的檢測(cè)有時(shí)效性以及靈敏度的要求,在樣品處理的過程盡量減少轉(zhuǎn)移的次數(shù)。

      采用改進(jìn)后3 次轉(zhuǎn)移的方法,同時(shí)對(duì)丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶液進(jìn)行比較。對(duì)于全血樣品,采用乙腈蛋白沉淀法可獲滿意結(jié)果,鼠藥回收率均可達(dá)到70%以上。而使用乙酸乙酯鼠藥的回收率只有40%左右,丙酮回收率更低,只有20%左右。

      采用一邊滴加乙腈一邊渦旋振蕩的方法可以提高乙腈提取率,避免蛋白沉淀物包裹待測(cè)物。另外對(duì)比尼龍濾膜對(duì)待測(cè)組分的吸附作用,發(fā)現(xiàn)尼龍濾膜對(duì)12種殺鼠劑有不同程度的吸附作用,尼龍濾膜對(duì)殺鼠醚、鼠立死的吸附嚴(yán)重,因此樣品不進(jìn)行濾膜過濾,而是采用取上清液直接進(jìn)樣。

      2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

      移取殺鼠劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在電噴霧正、負(fù)離子檢測(cè)方式下對(duì)質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化,選擇質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)的模式為最佳條件。經(jīng)過測(cè)定后發(fā)現(xiàn),鼠立死、安妥、毒鼠堿僅在正離子模式下離子化,其它化合物在正負(fù)兩種模式下均可離子化,但在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高,因此選擇在ESI正離子MRM模式下監(jiān)測(cè)鼠立死、安妥、毒鼠堿,在ESI負(fù)離子MRM模式下監(jiān)測(cè)另外9種殺鼠劑。

      進(jìn)一步對(duì)12 種殺鼠劑的去簇電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最終得到12種殺鼠劑的質(zhì)譜條件見1.4。

      2.3 色譜條件的優(yōu)化

      試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈的兩種有機(jī)流動(dòng)相對(duì)待測(cè)組分的分離效果以及離子化效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動(dòng)相時(shí),雖然響應(yīng)值稍低,但其色譜峰形較好。

      分別比較了20、10、5、2 mmol/L 的乙酸銨-0.02%甲酸-水4 種不同濃度流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰形及響應(yīng)值的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)選擇在Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm,1.8 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司)為分析柱下,采用5 mmol/L 乙酸銨-0.02%甲酸-水作為流動(dòng)相時(shí),各目標(biāo)組分的色譜峰形均比較理想,分析靈敏度較高。

      2.4 校準(zhǔn)工作曲線與檢出限、定量下限

      在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,分別測(cè)定血液、尿液基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各標(biāo)準(zhǔn)品的定量離子色譜峰面積(y)對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸處理(軟件自動(dòng)操作,選擇強(qiáng)制過原點(diǎn)),得到12種殺鼠劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)。

      按照職業(yè)人群生物監(jiān)測(cè)方法推薦的檢出限和定量下限測(cè)定方法[31],配制12 種鼠藥0.025 μg/mL 的血樣和尿樣,按規(guī)定方法分析,分別以樣品信號(hào)的3、10倍標(biāo)準(zhǔn)差(n=7)計(jì)算待測(cè)物濃度,所得濃度分別為方法檢出限、定量下限。

      12 種殺鼠劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限分別見表3、表4。

      表3 12種殺鼠劑的尿中線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

      表4 12種殺鼠劑的血中線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

      由表3、表4 可知,各殺鼠劑在0.05~1.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。

      2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

      移取空白血樣和尿樣各1 mL,再分別加入12種鼠藥標(biāo)準(zhǔn)品各0.05、0.10、0.5 μg,然后按照1.3 方法進(jìn)行處理后,各進(jìn)行6次平行測(cè)定,最后計(jì)算每種殺鼠劑的平均回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,試驗(yàn)結(jié)果見表5。

      表5 12種殺鼠劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

      由表5 可知,血樣和尿樣中12 種殺鼠劑的加標(biāo)回收率分別為81.2%~106.5%和80.7%~107.8%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%~15.4%和1.2%~10.8%,表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度,滿足方法要求。

      2.6 質(zhì)控樣品測(cè)定

      運(yùn)用所建方法對(duì)采購(gòu)的鼠藥質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定(牛血中溴鼠靈和溴敵隆、尿中殺鼠醚和殺鼠靈),定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差見表6。

      表6 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

      由表6 可知,質(zhì)控樣品色譜峰與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間一致、且所選擇的特征離子均在質(zhì)控樣品質(zhì)譜圖中出現(xiàn)、對(duì)應(yīng)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品的豐度比相比其偏差不超過表中規(guī)定的范圍,則可判定質(zhì)控樣品中含有相應(yīng)的滅鼠劑,定性檢出有目標(biāo)物,檢測(cè)結(jié)果與證書標(biāo)示一致。

      3 結(jié)語

      建立了血液和尿液樣品中12 種鼠藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,該法樣品前處理簡(jiǎn)便快捷,方法靈敏度高、重現(xiàn)性好,精密度和回收率均滿足實(shí)驗(yàn)要求,適用于疑似鼠藥中毒病人血液和尿液樣品中12種殺鼠劑的同時(shí)定性定量測(cè)定,為疑似鼠藥中毒病人的臨床救治提供技術(shù)支撐。

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