高糖飼料對草魚生長及肝臟糖代謝的影響

陳志釗，朱 濤，雷彩霞，姜 鵬，杜金星，朱俊杰，宋紅梅，李勝杰

1.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380

草魚 (Ctenopharyngodonidella) 是我國重要的大宗淡水經(jīng)濟魚類，養(yǎng)殖總產(chǎn)量約占我國淡水經(jīng)濟魚類總產(chǎn)量的1/5[1]。當(dāng)前，可持續(xù)發(fā)展是草魚產(chǎn)業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)之一，而飼料成本控制是其中最主要的一環(huán)。糖類是水產(chǎn)飼料中最為廉價的能量來源，在飼料中添加一定量的糖類物質(zhì)具有蛋白質(zhì)節(jié)約效應(yīng)和活化氨基酸的作用，能有效節(jié)省飼料成本[2]。然而，與哺乳動物不同，魚類被認(rèn)為是“天生的糖尿病患者”，對葡萄糖的利用能力較低，飼料中過多的糖類可能導(dǎo)致魚類出現(xiàn)生長遲緩、肝臟腫大、損傷等問題[3-5]。

草魚喜好以天然水草為餌料，與其他餌料相比，水草的粗蛋白含量高、粗纖維含量低[6]，富含糖類物質(zhì)[7]；因此，草魚是研究魚類糖利用能力的理想對象。目前認(rèn)為，在相同蛋白水平下，適宜草魚生長的飼料糖水平為15%～33%，當(dāng)飼料糖水平超過40%時，其生長性能受到抑制，腸系膜脂肪沉積增加，糖類無法發(fā)揮蛋白質(zhì)節(jié)約作用[8-10]。但也有研究顯示，飼喂6%、22%和38% 3 種糖水平飼料的草魚特定或相對生長率無顯著性差異[11]。用25%、45%和50% 3 種糖水平飼料飼喂草魚的研究也得到了相似結(jié)果，且糖水平超過40%時仍能發(fā)揮蛋白質(zhì)節(jié)約效應(yīng)[12]；此外，當(dāng)糖水平同為42%時，低蛋白質(zhì)飼料能促進草魚相對和特定生長率的增加[13]。由此可見，不同高糖飼料下草魚的生長性能表現(xiàn)不一致，僅從糖水平高低的角度無法完全解釋其生長性能差異。

探索糖代謝與生長之間的關(guān)系，是交叉融合了水產(chǎn)營養(yǎng)學(xué)與育種學(xué)的新型研究方向。本實驗室前期從糖酵解途徑中挖掘到與草魚生長相關(guān)的SNP 位點[14]，且草魚快長和慢長群體中糖酵解、糖異生和糖原合成途徑中的一些關(guān)鍵基因表達量差異顯著[15]，推測糖代謝調(diào)控可能與草魚生長密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，攝食高糖飼料后，不同于肉食性魚類，草魚肝臟能夠調(diào)節(jié)糖酵解途徑的葡萄糖激酶 (Glucokinase,Gk)和糖異生途徑的葡萄糖-6-磷酸酶 (Glucose-6-phosphatase,G6pase) 的基因表達以應(yīng)對攝入的過量糖[9,16]。糖酵解和糖異生途徑的糖代謝相關(guān)基因表達可能受到魚體體質(zhì)量、飼料中主要能量源添加(蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì))水平以及養(yǎng)殖時間等因素的影響[9-10,13,17]。研究不同營養(yǎng)參數(shù)、養(yǎng)殖時間對糖代謝相關(guān)基因，暨對糖酵解的關(guān)鍵限速酶Gk 和丙酮酸激酶 (Pyruvate kinase,Pk)、糖異生的關(guān)鍵限速酶G6pase 和磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase,Pepck)、糖原合酶 (Glycogen synthase,Gys) 和脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase,Fas) 基因表達的影響，有助于解釋飼喂高糖飼料草魚出現(xiàn)亞健康狀態(tài)表征和生長性能下降的原因。

目前對草魚糖類物質(zhì)營養(yǎng)需求的研究多局限于體質(zhì)量約10 g 的草魚[8-10,12]，尚不清楚體質(zhì)量約100 g 草魚的營養(yǎng)需求是否符合已有的研究成果。為探究飼喂高糖飼料不同時間下，體質(zhì)量約100 g草魚的生長性能及肝臟糖代謝相關(guān)基因的表達變化，本研究配制了普通糖和高糖兩種飼料對草魚進行長期投喂，定期測量其生長指標(biāo)和與糖代謝相關(guān)的生理生化指標(biāo)，分析肝臟糖代謝相關(guān)基因的表達變化規(guī)律，綜合評價其生長性能和健康水平，為草魚糖代謝與生長之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為耐糖性狀選育研究提供依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料與試劑耗材

參照陳團等[18]對飼料糖源的選擇，及Cai 等[10]對飼料糖水平的設(shè)置，本研究以木薯生淀粉作為魚體可消化糖源，以細統(tǒng)糠 (主要成分為纖維素) 作為不可消化的等碳添加物，分別配制飼料糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15% (普通飼料) 和40% (高糖飼料) 的等氮等能飼料。所有原料 (淮安市禾豐飼料有限公司提供) 粉碎過80 目篩后，采用逐級擴大法混勻后，加入大豆油及適量蒸餾水再次混勻，經(jīng)螺旋擠壓機加工成直徑4 mm 的硬顆粒飼料，自然風(fēng)干后于-20 ℃保存待用。飼料配方和營養(yǎng)組成見表1。

表1 實驗飼料配方及常規(guī)成分分析Table 1 Formulation and proximate composition of diets

實驗所用組織固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，血糖、肝/肌糖原含量檢測試劑盒、胰島素ELISA 檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。RNA 保護液 (RNAsafer Stabilizer Reagent)購自O(shè)mega Bio-Tek 公司，總RNA 分離試劑 (Trizol Reagent) 購自Thermo Fisher Scientific 公司，逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa Bio Inc.公司。

1.2 實驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

實驗用草魚購自廣州市南沙海鷗島養(yǎng)殖場，在廣東梁氏水產(chǎn)種業(yè)有限公司英德基地開展實驗。實驗魚暫養(yǎng)2 周后，選取平均體質(zhì)量為 (132.01±16.43) g 的草魚1 800 尾，隨機分成兩組，每組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)300 尾魚，放入長10 m×寬10 m 室外水泥池中養(yǎng)殖。兩組分別投喂普通飼料(對照組) 和高糖飼料 (高糖組)，每日8:00 和16:00 投喂2 次，每次投喂至魚群不再進食為止。養(yǎng)殖期間，水泥池不間斷充氧，每天吸污排污，隔3 d 換水1 次，換水量約為池水的1/3，水體pH維持在7.7～7.9，養(yǎng)殖時間為140 d。在第40 、第60 、第80 和第140 天時，從每個池中隨機挑選已禁食24 h 的20 尾草魚測量體質(zhì)量、體長和體高；挑選10 尾從尾靜脈采集血液置于抗凝管中，制備血漿用于檢測血糖和胰島素含量，另取肝臟組織稱質(zhì)量，置于RNA 保存液中4 ℃過夜，再轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。第140 天時，每個重復(fù)挑選10 尾草魚測量內(nèi)臟團、腸系膜脂肪質(zhì)量，采集部分肝臟和肌肉組織快速置于液氮下保存，再用于檢測糖原，另采集部分肝臟和腸道組織置于多聚甲醛溶液中固定，用于制備組織切片。所有樣品的保存方式均為單一個體單管保存。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能測定

測量不同時期兩組草魚的體質(zhì)量增長率(Weight gain rate,RWGR)、肥滿度 (Fullness,RF)、臟體比 (Viserosomatic index,RVI)、肝體比 (Hepatosomatic index,RHI)、腸系膜脂肪系數(shù) (Mesenteric fat index,RMFI)和空殼質(zhì)量 (Eviscerated mass,WE)，計算公式如下：

式中：W0為實驗草魚的初始體質(zhì)量；W1為實驗草魚的終末體質(zhì)量；L1為實驗草魚的終末體長；Wv、Wh、Wm分別為實驗草魚的內(nèi)臟團總質(zhì)量、肝臟總質(zhì)量、腸系膜脂肪總質(zhì)量。

1.3.2 血糖、胰島素含量測定

血糖、血漿胰島素含量檢測分別按照葡萄糖含量檢測試劑盒、魚胰島素測試盒說明書操作，使用多功能酶標(biāo)儀Cytation 5 (BioTek,America)檢測樣品吸光度，計算血糖和胰島素含量。

1.3.3 組織糖原含量測定

采用肝/肌糖原測定試劑盒測定每個個體肝臟和肌肉組織中的糖原含量，按試劑盒說明書操作步驟，將樣品漂洗、吸干、研磨后水解制備糖原檢測液，用UV-7504 型單光束紫外可見分光光度計 (上海欣茂儀器有限公司) 于波長620 nm、光徑1 cm下檢測樣品的OD 值，計算糖原含量。

1.3.4 組織切片制作與觀察

將采集自第140 天的肝臟和中腸樣品經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切片、HE 染色，制備的切片在ZEISS Scope.A1 正置顯微鏡下成像拍照，使用Microsoft PowerPoint 2016 軟件整理和標(biāo)注圖片，檢查肝臟和腸道組織的健康狀況。成像完成后統(tǒng)一以毫米為標(biāo)準(zhǔn)單位，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分別測量每張切片中5 根完整腸絨毛高度及對應(yīng)的5 處絨毛寬度。

1.3.5 肝臟糖代謝相關(guān)基因表達分析

取已采集的肝臟組織勻漿后用TRIzol?試劑裂解，通過氯仿-異丙醇分離沉淀總RNA，經(jīng)75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌后重新溶解總RNA。使用多功能酶標(biāo)儀Cytation 5 (BioTek,美國) 檢測RNA 濃度及純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) 說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃保存。以β-actin為內(nèi)參基因，采用RTPCR 檢測肝臟糖代謝相關(guān)基因在不同養(yǎng)殖時間下的相對表達量。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL、去離子水7 μL、TB Green (SYBR 酶)10 μL，引物序列見表2。反應(yīng)在LightCycler? 96 Instrument 熒光定量PCR 儀上進行，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)。每個樣品進行3 次重復(fù)實驗，采用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量，以40 d 對照組的相對表達量為對照，分析各組各時間下該基因的表達量差異。

表2 草魚糖代謝相關(guān)基因 qRT-PCR 引物Table 2 qRT-PCR primers of grass carp glycometabolism genes

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 26 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，生長指標(biāo)、糖原含量、腸道組織絨毛高度、寬度和肌層厚度使用獨立樣本t檢驗法分析兩組樣本間的差異；基因的相對表達量數(shù)據(jù)使用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，采用Duncan's 法進行組間多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()”表示，差異顯著水平為P＜0.05，P＜0.01 時差異極顯著。使用Excel 2016、PowerPoint 2016 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 高糖和低糖飼料對草魚生長性能的影響

兩組草魚的生長性能各指標(biāo)如表3 所示，相較于對照組，高糖組草魚體質(zhì)量在第60 和第80 天顯著提高 (P＜0.05)，并在第140 天時極顯著提高(P＜0.01)；體質(zhì)量增長率在第60 和第80 天時顯著提高 (P＜0.05)；體高在第60 和第140 天時極顯著提高 (P＜0.01)；肥滿度在第40、第80 和第140 天時極顯著提高 (P＜0.01)；在第140 天時，草魚臟體比、腸系膜脂肪系數(shù)和空殼質(zhì)量均極顯著提高 (P＜0.01)。而兩組草魚的體長、肝體比無顯著性差異 (P＞0.05)。

表3 高糖飼料對草魚生長性能的影響Table 3 Effects of dietary carbohydrate on growth performance of grass carp

2.2 兩種不同糖水平飼料對草魚血糖、胰島素、糖原的影響

如表4 所示，高糖組和對照組草魚在各個時期的空腹血糖均無顯著性差異 (P＞0.05)。第140 天時，高糖組草魚血漿胰島素、肝糖原和肌糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照組，其中肝糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異性顯著 (P＜0.05)。

表4 高糖飼料對草魚血糖、胰島素、糖原的影響Table 4 Effects of dietary carbohydrate on plasma glucose,insulin and glycogen of grass carp

2.3 肝臟、腸道組織切片觀察

2.3.1 肝臟組織外形、HE 染色切片觀察

將經(jīng)HE 染色的第140 天草魚肝臟組織切片置于顯微鏡中觀察 (圖1)。以中央靜脈為中心，對照組肝組織中肝索呈放射狀整齊排列，相鄰肝索吻合成網(wǎng)狀，肝索之間可見肝血竇；細胞大小正常，呈橢圓形，細胞核大、居中，空泡不明顯。高糖組肝臟組織的肝索排列規(guī)則，肝血竇細長狹窄，肝細胞稍膨大，細胞核不在細胞中央，空泡數(shù)量較多。

圖1 草魚肝臟組織結(jié)構(gòu)注：a.對照組草魚肝臟 (400×)；b.高糖組草魚肝臟 (400×)；c.對照組草魚肝臟 (1 000×)；d.高糖組草魚肝臟 (1 000×)。Fig.1 Tissue slices of liver of grass carpNote: a.Liver of grass carp (400×); b.Liver in Group H of grass carp (400×); c.Liver in control group of grass carp (1 000×); d.Liver in Group H of grass carp (1 000×).

2.3.2 腸道組織結(jié)構(gòu)

將經(jīng)HE 染色的中腸腸道組織切片置于顯微鏡中觀察 (圖2)，對照組絨毛結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列規(guī)整緊密，未見損傷，絨毛近、中端形態(tài)正常。但絨毛遠端出現(xiàn)腫脹，比例為80% (n=10)。高糖組絨毛結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷，絨毛腫脹、變形并伴有絨毛折疊，腸腔面積增大，紋狀緣缺刻，比例為90% (n=10)。在400×顯微鏡下觀察 (圖2-c—d)，對照組微絨毛排列緊密、均勻，高糖組微絨毛排列疏松，出現(xiàn)膨脹。經(jīng)測量和分析 (圖3，N=50)，高糖組腸絨毛高度極顯著高于對照組，但兩組間絨毛寬度和肌層厚度差異不顯著 (P＞0.05)。

圖2 草魚中腸組織結(jié)構(gòu)注：a.對照組草魚中腸 (100×)；b.高糖組草魚中腸 (100×)；c.對照組草魚中腸 (400×)；d.高糖組草魚中腸 (400×)。Fig.2 Tissue slices of midgut of grass carpNote: a.Midgut in Control group grass carp (100 ×); b.Midgut in Group H of grass carp (100×);c.Midgut in control group of grass carp (400×); d.Midgut in Group H of grass carp (400×).

圖3 高糖飼料對草魚腸道組織絨毛高度、寬度和肌層厚度的影響Fig.3 Effects of dietary carbohydrate on villus height,villus width and muscle layer thickness

2.4 不同時期草魚肝臟組織糖代謝相關(guān)基因的表達

2.4.1 糖酵解關(guān)鍵基因的表達

如圖4-a 所示，隨著養(yǎng)殖時間的增加，高糖組的gk基因 mRNA 表達量均呈下降趨勢，對照組表達量在所有時間上無顯著變化 (P＞0.05)。第40 天時高糖組的gk基因 mRNA 表達量顯著高于對照組(P＜0.05)，其余時間兩組間無顯著性差異。高糖組的pk基因 mRNA 表達量隨養(yǎng)殖時間的增加整體呈下降趨勢，對照組表達量在所有時間上無顯著變化(P＞0.05，圖4-b)。第60 和第140 天時，高糖組表達量顯著低于對照組 (P＜0.05)，而第40 和第80 天時兩組間無顯著性差異 (P＞0.05)。

圖4 草魚肝臟糖代謝相關(guān)基因的表達注：方柱上的不同大寫字母表示同一時間點高糖組、對照組的相對表達量差異顯著，不同小寫字母表示同一組在不同時間點的相對表達量差異顯著 (P＜0.05)。Fig.4 Relative expression of genes related to liver glucose metabolism in grass carpNote: Different uppercase letters on the square columns indicate significant differences in relative expression levels between the high glucose group and the control group at the same time point,while different lowercase letters on the square columns indicate significant differences in relative expression levels of the same group at different time points (P＜0.05).

2.4.2 糖異生關(guān)鍵基因的表達

如圖4-c 所示，隨著養(yǎng)殖時間的增加，高糖組和對照組的pepck基因 mRNA 表達量均呈上升趨勢，第140 天時兩組的表達量均達峰值。其中第40 天時高糖組的表達量顯著低于對照組，其余時間兩組間的表達量無顯著性差異。高糖組和對照組的g6pase基因 mRNA 表達量隨養(yǎng)殖時間的增加均呈升高趨勢 (圖4-d)。相較于對照組，第40 和第60 天高糖組的g6pase基因 mRNA 表達量顯著降低，第80 和第140 天時顯著提高。

2.4.3 糖原、脂肪合成關(guān)鍵基因的表達

如圖4-e 所示，高糖組和對照組的gys2基因mRNA 表達量隨養(yǎng)殖時間增加均呈下降趨勢，但第40 天時高糖組的gys2基因 mRNA 表達量與對照組無顯著性差異，第40 和第60 天時高糖組的表達量均顯著高于對照組。高糖組和對照組的fas基因mRNA 表達量隨養(yǎng)殖時間增加總體呈下降趨勢(圖4-f)，相較于對照組，高糖組的fas基因 mRNA表達量在第40 天時顯著降低，第60 和第140 天時顯著提高。

3 討論

3.1 飼喂高糖飼料對草魚生長性能的影響

在飼料中添加適宜水平的糖有助于提高魚類的生長性能。根據(jù)已有研究，飼喂糖水平低于38%的飼料，草魚幼魚的生長性能無顯著變化[8,10]；但當(dāng)飼料糖水平超過40%時，草魚的生長性能顯著下降[8,10,22]，并引起血糖升高和肝腫大[5,8-9,23]。纖維素是魚類飼料中常用的填料和黏合劑[24-25]，魚類對纖維素的利用能力有限[26]，為了研究不同糖水平飼料對赤點石斑魚(Epinephelusakaara)生長性能的影響[27]，纖維素作為等碳添加物的添加量達1.97%～33.3%，將纖維素作為不可消化的糖源配制等氮等能飼料不會影響草魚的生長性能[10,26]。本研究中飼喂添加40%木薯淀粉飼料的高糖組草魚，體質(zhì)量在第60、第80 和第140 天時顯著高于對照組，在第140 天時空殼質(zhì)量顯著高于對照組，說明添加40% 木薯淀粉的高糖飼料可促進草魚體質(zhì)量增加，且體質(zhì)量的增加主要源于肌肉質(zhì)量增加。攝食高糖飼料提高魚類生長性能的結(jié)果在其他草食性魚類中也有報道，在脂質(zhì)水平低的飼料中添加高水平糖能夠促進銀鯽 (Carassiusgibelio)[24]、團頭魴 (Megalobramaamblycephala)[28]的生長，攝食高糖飼料后生長性能表現(xiàn)不同可能與糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)三者的交互作用有關(guān)。Abimorad 等[29]配制了包含2 種蛋白質(zhì)水平、2 種脂質(zhì)水平和3 種糖水平的12 種飼料飼喂草食性魚類細鱗鯧(Piaractusmesopotamicus)，結(jié)果顯示20%蛋白質(zhì)水平的高糖(50%) 飼料可顯著降低其體質(zhì)量增長率，而23%蛋白質(zhì)水平的高糖飼料可顯著提高其體質(zhì)量增長率，40%和80%脂質(zhì)水平的高糖飼料對體質(zhì)量增長率的影響也不相同，相似的結(jié)果在短蓋巨脂鯉(Piaractusbrachypomus)[30]、黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)[31]中也有報道。在草魚的研究中，將高糖 (45%) 飼料的蛋白質(zhì)水平從32%降至20%顯著提高了體質(zhì)量增長率[13]，說明草魚攝食高糖飼料后出現(xiàn)的生長性能表現(xiàn)差異可能與營養(yǎng)素間的交互作用有關(guān)。

長期攝食高水平糖飼料會導(dǎo)致草魚肝體指數(shù)增加[32-33]，引起代謝紊亂[34]，從而抑制其生長。本研究中高糖組草魚肝臟糖原水平相比對照組顯著提高，肝體指數(shù)增加但差異不顯著，肝細胞形態(tài)發(fā)生了改變，總體反映出高糖組草魚肝臟糖代謝負擔(dān)加重，但并沒有因糖原和脂肪積累而發(fā)生明顯肝腫大，也未對生長性能造成明顯的負面影響。盡管高糖組草魚肝臟gys2和fas基因 mRNA 表達水平在第40 和第60 天均顯著高于對照組，但隨著養(yǎng)殖時間延長，高糖組草魚gys2和fas基因 mRNA 表達水平整體呈下降趨勢，這與Fang 等[19]用高糖水平飼料飼喂草魚的結(jié)果相似，表明草魚可能通過自身新陳代謝減少肝糖原和脂肪的積累，從而減輕對肝臟器官損傷。中腸組織切片觀測發(fā)現(xiàn)，高糖組絨毛形態(tài)改變，出現(xiàn)損傷，這可能與實驗草魚處于生長階段早期、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)對魚體營養(yǎng)狀況反應(yīng)敏感有關(guān)[19]。實驗組草魚在第60 和第80 天時體質(zhì)量增長率顯著高于對照組，而在第140 天時高糖組體質(zhì)量增長率高于對照組但差異不顯著，可能受飼喂高糖飼料導(dǎo)致草魚幼魚腸道絨毛寬度減少、消化與吸收能力降低的影響[19,35]，從而引起實驗組草魚生長速度減緩。

3.2 高糖飼料對肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)

糖酵解是魚類葡萄糖分解的唯一途徑，其中葡萄糖激酶是肝臟中催化葡萄糖分解的第一個關(guān)鍵酶，飼喂高糖飼料的團頭魴[36]、尼羅羅非魚 (Oreochromisniloticus)[17]和虹鱒 (Oncorhynchusmykiss)[26,37]等多種魚類肝臟糖酵解相關(guān)基因表達水平顯著升高。本研究中，隨實驗時間延長飼喂高糖飼料組和對照組的草魚肝臟gk基因表達水平無顯著性差異，與Fang 等[19]飼喂草魚高糖(60%)飼料73 d 未能顯著改變肝臟gk基因表達水平的結(jié)果一致。但Cai 等[10]用高糖飼料飼喂草魚56 d 后發(fā)現(xiàn)高糖飼料組的gk基因表達水平顯著升高，推測可能與飼喂時間長短有關(guān)。Boonanuntanasarn 等[17]研究不同糖水平飼料飼喂羅非魚時發(fā)現(xiàn)，短期 (45 d) 飼喂高糖飼料顯著提高了gk基因表達水平，而長期 (90 d) 飼喂對gk基因表達水平無顯著性影響，該研究結(jié)果與本研究一致。本實驗飼喂草魚高糖飼料短期(40 d) 內(nèi)顯著提高了肝臟的gk基因表達水平，而長期 (140 d) 飼喂對gk基因表達水平無顯著性影響，表明短期和長期飼喂高糖飼料對草魚肝臟gk基因表達的影響不同，這可能是分子水平上的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)[17]。

糖異生是非糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成葡萄糖的過程，葡萄糖-6-磷酸酶是糖異生途徑中直接催化葡萄糖合成的酶，同時在肝糖原合成葡萄糖的反應(yīng)中也起催化作用。高糖飼料對不同魚類肝臟g6pase基因表達水平的影響不同，對同一種魚類也可能存在不同影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高糖飼料不會顯著改變銀鯽[24]、羅非魚[17]、虹鱒在空腹時肝臟g6pase基因表達水平；而Song 等[25]和 Marandel 等[16]采用高糖飼料飼喂虹鱒，發(fā)現(xiàn)其肝臟g6pase基因表達水平顯著升高。在本實驗條件下，飼喂高糖飼料140 d 草魚肝臟g6pase基因表達水平顯著升高，與Cai 等[10]、徐晶等[38]的研究結(jié)果相似。Qiang等[39]飼喂羅非魚高糖飼料0、27、45 d，發(fā)現(xiàn)其肝臟g6pase基因表達水平隨實驗時間延長而升高；Boonanuntanasarn 等[17]長期飼喂羅非魚不同糖水平飼料，90 d 高糖飼料組肝臟g6pase基因表達水平較45 d 高，表明持續(xù)飼喂羅非魚高糖飼料可提高其肝臟g6pase基因表達水平。本研究高糖組g6pase基因表達水平隨實驗時間的延長而升高，并在第140 天時顯著高于對照組，與上述羅非魚的研究結(jié)果相似[17,39]；表明長期飼喂草魚高糖飼料會導(dǎo)致g6pase基因表達水平升高，推測可能與本研究高糖組胰島素水平較高和血糖水平較低有關(guān)。胰島素可促進糖酵解、脂肪合成、糖原合成并抑制糖異生來降低血糖水平[40]，當(dāng)血糖水平較低時，機體通過提高g6pase基因表達水平來轉(zhuǎn)化中間代謝物，重新合成葡萄糖并補充血糖含量。

4 結(jié)論

綜上，采用高糖 (40%) 飼料投喂草魚可促進其體質(zhì)量的增加，但長期飼喂會對其生理指標(biāo)產(chǎn)生一定的負面影響，肝臟糖代謝相關(guān)基因表達變化顯著，合成肝糖原和脂肪酸是葡萄糖的主要轉(zhuǎn)化方式。本研究結(jié)果可為探明適宜草魚生長的飼料糖水平提供數(shù)據(jù)支持，也可為后續(xù)耐糖性狀標(biāo)記的開發(fā)提供理論依據(jù)。