• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    橙黃小單孢菌 (Micromonospora aurantiaca) 幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)、鑒定及應(yīng)用

    2023-10-24 03:18:56游錦若申鉉日李永成夏光華何燕富張雪瑩
    南方水產(chǎn)科學(xué) 2023年5期
    關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)膠體底物

    王 逗,游錦若,申鉉日,2,李永成,2,夏光華,2,何燕富,2,張雪瑩,2

    1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 ???570228

    2.南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心,海南 ???570228

    幾丁質(zhì)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖 (GlcNAc) 通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[1],在自然界中廣泛分布于蝦和蟹的外殼[2]、真菌細(xì)胞壁、昆蟲外骨骼以及一些綠藻中。僅水生生態(tài)系統(tǒng)中,幾丁質(zhì)每年的產(chǎn)量就超過1×1011t[3]。天然幾丁質(zhì)由于分子內(nèi)和分子間強大的氫鍵作用而性質(zhì)穩(wěn)定,難溶于水、稀酸、堿,僅溶于濃鹽酸、硝酸等強酸以及一些離子液體 (如咪唑基離子液體等)[4],所以很難得到有效利用,造成了嚴(yán)重的資源浪費。然而,幾丁質(zhì)的水解產(chǎn)物N-乙酰殼寡糖卻具有水溶性、細(xì)胞膜滲透性和易吸收性等理化特點;還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血壓和降低膽固醇等多種生物活性[5],廣泛應(yīng)用于生物化工、生物醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品、化妝品、保健品等領(lǐng)域[6]。其中,N,N-二乙酰基殼二糖 [(GlcNAc)2] 具有抗腫瘤、抗菌和免疫刺激作用等生物活性[7]。(GlcNAc)2在醫(yī)療方面,能夠防止術(shù)后組織黏連[8];在農(nóng)業(yè)方面,能夠促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物先天免疫[9]。此外,(GlcNAc)2還能誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶在鏈霉菌、蘑菇等生物中的表達(dá)[10-11]。

    降解幾丁質(zhì)的方法包括物理法、化學(xué)法和生物酶法。迄今為止,采用物理法制備N-乙酰殼寡糖的研究較少,在工業(yè)上尚未形成規(guī)?;a(chǎn)。傳統(tǒng)的化學(xué)法采用強酸處理幾丁質(zhì),反應(yīng)非常復(fù)雜,難以控制,并會產(chǎn)生各種二級化合物,難以去除。生物酶法作為綠色生產(chǎn)技術(shù),可克服物理和化學(xué)法的缺點[12],其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、對環(huán)境無污染,因而受到越來越多的關(guān)注[13]。

    幾丁質(zhì)酶 (Chitinase,EC 3.2.1.14) 屬于糖苷水解酶,通過水解幾丁質(zhì)的β-(1→4) 糖苷鍵將其降解為N-乙酰殼寡糖或GlcNAc[14]。在碳水化合物-活性酶數(shù)據(jù)庫 (CAZy) 中,根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的保守性,被分為糖苷水解酶18 家族(GH18)、19 家族 (GH19) 和20 家族 (GH20)。GH18 家族幾丁質(zhì)酶主要由細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和動物產(chǎn)生,GH19 家族幾丁質(zhì)酶主要來源于高等植物和某些細(xì)菌[15],而GH20 家族幾丁質(zhì)酶來源于細(xì)菌和人類。不同來源的幾丁質(zhì)酶已在大腸桿菌(Escherichiacoli) 和枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)等異源宿主系統(tǒng)中以重組蛋白的形式表達(dá)[16-17]。幾丁質(zhì)酶有許多潛在的應(yīng)用,除了用于制備N-乙酰殼寡糖[18-19]外,還可以用作致病菌的抗真菌劑[20],利用和清理幾丁質(zhì)廢棄物并將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇[21]。

    海洋環(huán)境中含有豐富的幾丁質(zhì),是篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物的重要來源地之一。在前期研究中,本課題組從紅樹林蝦場土壤中篩選到一株能夠利用幾丁質(zhì)的放線菌橙黃小單孢菌(Micromonosporaaurantiaca)。迄今為止,已有諸多放線菌來源的幾丁質(zhì)酶被分離和鑒定[22-23],但是橙黃小單孢菌來源幾丁酶的相關(guān)研究尚未見報道。本研究以橙黃小單孢菌的基因組DNA 為模板,克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3,并成功在大腸桿菌中表達(dá)。之后,對重組酶進(jìn)行純化及酶學(xué)特性的研究,采用掃描電鏡(SEM) 進(jìn)一步驗證了該重組酶對幾丁質(zhì)底物的水解活性。最后,利用該重組酶水解膠體幾丁質(zhì)制備(GlcNAc)2,為幾丁質(zhì)資源的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與質(zhì)粒

    橙黃小單孢菌:于海南省??谑袞|寨港紅樹林蝦場土壤中篩選得到,保存于本實驗室;pMD-19T載體購于寶生物工程 (大連) 有限公司;E.coliDH5α、E.coliBL21 (DE3) 和表達(dá)載體pET-28a 購于Novagen公司。

    1.2 主要材料與儀器

    細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 (上海捷瑞生物工程有限公司);PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、蛋白Marker [生工生物工程 (上海) 股份有限公司];T4 DNA 連接酶、DNA Marker [寶生物工程 (大連) 有限公司];限制性內(nèi)切酶 (賽默飛世爾科技公司);GlcNAc (上海源葉生物科技有限公司);(GlcNAc)2-6標(biāo)準(zhǔn)品(山東青島博智匯力有限公司);牛血清白蛋白 (武漢賽維爾生物科技有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    DYCZ-24DN 型雙板垂直電泳槽、DYPC-31DN 型水平電泳槽 (北京六一生物科技有限公司);A300 型PCR 擴(kuò)增儀、LG2020D 型凝膠成像系統(tǒng) (杭州朗基科學(xué)儀器有限公司);高效液相色譜柱:Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6 mm×250 mm,5 μm) (北京迪科馬科技有限公司);K6600B 型全波長酶標(biāo)儀 (北京凱奧科技發(fā)展有限公司);NRY-200 型全溫培養(yǎng)搖床 (上海南榮實驗室設(shè)備有限公司);Phenom ProX 型SEM (飛納科學(xué)儀器有限公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 目的基因的克隆和生物信息學(xué)分析

    本研究根據(jù)美國國家生物信息中心 (NCBI) 已公布的橙黃小單孢菌ATCC 27029 的全基因組DNA 序列信息 (NCBI 登陸號CP002162),從中挖掘出一條可能編碼幾丁質(zhì)酶的基因序列,根據(jù)該基因序列采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物Primer-F (CATATGGTGGTCCTCCCGAACAACTTC,酶切位點為NdeI) 和Primer-R(AAGCTTTCAGGCCGGCAGCCGC,酶切位點為Hind III),委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系 (50 μL):TaKaRa LA Taq 0.5 μL,Primer-F (20 μmol·L-1) 1 μL,Primer-R (20 μmol·L-1) 1 μL,基因組DNA 1 μL,dNTP Mixture 8 μL,2 × GC Buffer I 25 μL,ddH2O 13.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性 1 min;94 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸100 s,30 個循環(huán);72 ℃ 延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 瓊脂糖凝膠電泳驗證后,根據(jù)DNA 膠回收試劑盒說明書回收目的產(chǎn)物片段。

    生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站:氨基酸序列分析采用NCBI 的BLAST 功能,信號肽序列分析用SignalP 5.0 在線服務(wù)器 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),蛋白質(zhì)同源序列比對采用DNAMAN 軟件,保守域的分析采用NCBI 的CD-search 工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/),理論分子量和等電點的預(yù)測采用ExPASy 的ProtParam 工具 (http://web.expasy.org/protparam/)。

    1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

    將目的基因連接至pMD19-T 載體,之后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)菌落PCR 鑒定結(jié)果,挑選陽性克隆子送至北京擎科生物科技有限公司測定目的基因序列。將測序正確的基因序列和pET-28a 表達(dá)載體分別用NdeI 和Hind III 雙酶切,回收目的基因片段和酶切質(zhì)粒,用T4 DNA 連接酶連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。

    1.3.3 重組幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

    將含有目的基因的重組菌接種到含50 μg·mL-1卡那霉素的Luria-Bertani (LB) 液體培基中,在37 ℃、180 r·min-1下振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.8 時,加入終濃度為0.2 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG),在16 ℃、180 r·min-1下誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后,離心 (4 ℃,6 000 r·min-1,5 min) 收集菌體,用0.85% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的生理鹽水清洗后用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液重懸,之后置于冰水浴中超聲破碎 (功率350 W,工作 2 s,間隔5 s)。超聲破碎結(jié)束后在4 ℃、6000 r·min-1下離心15 min,上清液即為粗酶液。將粗酶液上樣于鎳親和層析色譜柱進(jìn)行分離純化,并利用SDSPAGE 分析蛋白的純度和分子量。

    1.3.4 膠體幾丁質(zhì)的制備

    參照Pan 等[24]的方法制備膠體幾丁質(zhì),略有改動。稱取10 g α-幾丁質(zhì)粉末,緩慢加入到200 mL預(yù)冷的濃鹽酸中 (邊加邊攪拌),在4 ℃冰箱中靜置至溶液呈黃色。之后,向上述混合物中加入2 L預(yù)冷的50% (體積分?jǐn)?shù)) 乙醇,快速攪拌后于4 ℃下放置過夜。然后在4 ℃、4 000 r·min-1下離心15 min,并收集沉淀部分。用大量去離子水反復(fù)沖洗沉淀部分至中性,離心 (10 000 r·min-1,10 min) 后獲得的沉淀物即為膠體幾丁質(zhì)。

    1.3.5 重組幾丁質(zhì)酶的酶活力測定

    以膠體幾丁質(zhì)作為底物,采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法測定還原糖產(chǎn)量[25]。用0~5 μmol·L-1的GlcNAc 制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.122 6x-0.030 9,R2=0.990 8。酶活測定方法如下:將膠體幾丁質(zhì)加入至pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中,混合均勻后制成終質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1的膠體幾丁質(zhì)混懸液。取0.5 mL 上述膠體幾丁質(zhì)混懸液與0.5 mL 酶液混合,于50 ℃水浴中磁力攪拌反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后離心 (10 000 r·min-1,2 min),獲得上清液。取0.5 mL 上清液,加入0.5 mL DNS 溶液,搖勻后煮沸5 min 進(jìn)行顯色反應(yīng),用酶標(biāo)儀于540 nm 處測定吸光值,根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖產(chǎn)量。同時,以加熱滅活的酶液作為空白對照組。酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下,每分鐘催化膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmol GlcNAc所需要的酶量,用U 表示。

    1.3.6 重組幾丁質(zhì)酶的蛋白濃度測定

    采用Bradford 法[26]測定重組酶的蛋白濃度。以0~0.1 mg·mL-1的牛血清白蛋白制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=4.579 1x-0.002,R2=0.990 7。根據(jù)吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算待測樣的蛋白濃度。

    1.3.7 重組幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

    1) 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究。取等量的酶液,在不同反應(yīng)溫度 (25~65 ℃) 下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定重組幾丁質(zhì)酶的酶活。將最適反應(yīng)溫度下的相對酶活定義為100%。為了測定重組幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性,將酶液置于不同溫度 (40~60 ℃) 下孵育1 h 后取樣,按標(biāo)準(zhǔn)方法,在最適反應(yīng)溫度下測定殘余酶活。將孵育前幾丁質(zhì)酶的酶活定義為100%。

    2) 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性研究。取等量的酶液,在不同pH 的緩沖液 (50 mmol·L-1,pH 3.0~5.0 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;pH 5.0~8.0 為磷酸鹽緩沖液;pH 7.0~9.0 為Tris-HCl 緩沖液;pH 9.0~10.0 為甘氨酸-NaOH 緩沖液) 中按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定重組幾丁質(zhì)酶的酶活。將最適反應(yīng)pH 下的相對酶活力定義為100%。為了測定重組幾丁質(zhì)酶的pH 穩(wěn)定性,將酶液加入到不同pH 的緩沖液(50 mmol·L-1,pH 3.0~4.0 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;pH 5.0~6.0 為磷酸鹽緩沖液;pH 7.0~8.0 為Tris-HCl 緩沖液;pH 9.0~10.0 為甘氨酸-NaOH 緩沖液) 中,在4 ℃下孵育1 h。之后,在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下,按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活。孵育前重組幾丁質(zhì)酶的酶活被定義為100%。

    3) 化學(xué)試劑和金屬離子對酶活力的影響。為了研究化學(xué)試劑對重組幾丁質(zhì)酶酶活力的影響,向反應(yīng)體系中分別加入不同的化學(xué)試劑,包括尿素(終濃度200 mmol·L-1),十二烷基硫酸鈉 (SDS,終濃度10 mmol·L-1),乙二胺四乙酸 (EDTA,終濃度10 mmol·L-1),吐溫 (Tween 20、40、60、80,終體積分?jǐn)?shù)1%) 和曲拉通X-100 (終體積分?jǐn)?shù)1%),在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下,按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定重組酶MaChi3 的酶活力。為了研究金屬離子對重組幾丁質(zhì)酶酶活力的影響,向反應(yīng)體系中分別加入終濃度1 mmol·L-1的鉀離子 (K+)、鎂離子 (Mg2+)、亞鐵離子 (Fe2+)、鈣離子 (Ca2+)、鈷離子 (Co2+)、鐵離子 (Fe3+)、鋇離子 (Ba2+)、鋅離子 (Zn2+)、銅離子 (Cu2+) 和銀離子 (Ag+),在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下,按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定重組酶MaChi3 的酶活力。將未添加任何化學(xué)試劑和金屬離子時的相對酶活定義為100%。

    4) 底物特異性及動力學(xué)參數(shù)測定。將酶液分別與終質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、蝦殼粉、淀粉、纖維素、不同脫乙酰度的殼聚糖 (脫乙酰度50%、70%、80%、85%、90%、95%) 進(jìn)行反應(yīng),在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下,測定重組酶MaChi3 的酶活力,研究該重組酶對不同底物的特異性。

    在含有不同質(zhì)量濃度 (1~8 mg·mL-1) 膠體幾丁質(zhì)的反應(yīng)體系中,在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測定重組酶MaChi3 的酶活力。采用雙倒數(shù)作圖法,利用Origin 8.5 軟件進(jìn)行線性擬合,根據(jù)擬合公式計算MaChi3 的動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax值。

    1.3.8 幾丁質(zhì)的SEM 表征

    將10 mg α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)分別加入到50 mmol·L-1pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中,均勻分散后加入2 mL 酶液,于55 ℃下振蕩孵育24 h。孵育結(jié)束后,在10 000 r·min-1下離心10 min,收集底物樣品,在60 ℃下干燥24 h。采用SEM 對孵育前后的α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)的表面微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。觀察前用導(dǎo)電雙面膠帶將樣品固定在樣品臺上,在真空環(huán)境下進(jìn)行鍍金處理,物料表面被一層薄薄的金覆蓋形成導(dǎo)電膜以獲得導(dǎo)電性。使用SEM 的顆粒表面分析系統(tǒng)觀察樣品的表面形態(tài),加速電壓為10 kV,放大倍數(shù)為2500 倍[27]。

    1.3.9 N,N-二乙?;鶜ざ堑闹苽?/p>

    將10 mg 膠體幾丁質(zhì)加入到50 mmol·L-1pH 7.0 的Tris-HCl 緩沖液中,均勻分散后加入5 mL 酶液,于55 ℃下振蕩反應(yīng)。定時從反應(yīng)瓶中取樣 (0、2、4、6、8、10、12、24 h),在沸水浴中孵育10 min 后離心 (10 000 r·min-1,5 min),取上清液用0.22 μm 濾頭過濾,濾液用于HPLC 檢測分析。檢測條件:安捷倫1260 高效液相色譜儀,配備Asahipak NH2P-504E (250 mm×4.6 mm,Shodex,日本) 色譜柱。流動相為75% (體積分?jǐn)?shù)) 乙腈,流速為0.5 mL·min-1,柱溫箱溫度設(shè)定為25 ℃,檢測器溫度為25 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,檢測波長為210 nm。(GlcNAc)1-6的保留時間依次為13.2、18.0、25.3、34.1、49.7 和77.3 min。

    1.3.10 數(shù)據(jù)處理

    采用Origin Pro 2018 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,每組實驗做3 次平行。

    2 結(jié)果

    2.1 幾丁質(zhì)酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

    以本實驗室保存的橙黃小單孢菌的基因組DNA 為模板,利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得一條大約1 400 bp 的基因條帶 (圖1-a)。將測序結(jié)果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 分析,發(fā)現(xiàn)其與查找到的幾丁質(zhì)酶基因序列一致性達(dá)到100%(NCBI 登錄號WP_013285221),表明已成功從M.aurantiaca的基因組DNA 中克隆到幾丁質(zhì)酶基因,并將其記為Machi3。Machi3基因的全長為1 371 bp,編碼456 個氨基酸,預(yù)測的蛋白理論相對分子質(zhì)量和pI 分別為47.44 kD 和7.55。信號肽預(yù)測結(jié)果表明,在MaChi3 的N 端含有信號肽,信號肽的切割位點在第33—第34 個氨基酸之間。MaChi3 含有一個Glyco_18 結(jié)構(gòu)域 (位于40—305位氨基酸殘基) 和一個具有碳水化合物結(jié)合作用的RICIN 結(jié)構(gòu)域 (位于331—455 位氨基酸殘基,圖1-b)。將MaChi3 的氨基酸序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 分析,發(fā)現(xiàn)其與來源于那拉提瓦小單孢菌 (M.narathiwatensis) (NCBI 登錄號WP_091195038)、邱氏疣孢菌 (Verrucosisporasioxanthis)(NCBI 登錄號WP_164447165) 和石渣球孢菌 (Allocatelliglobosisporascoriae) (NCBI 登錄號WP_184833644) 的幾丁質(zhì)酶序列一致性分別為87.3%、83.5%和78.3%。但是,上述幾丁質(zhì)酶均為未經(jīng)驗證的假定幾丁質(zhì)酶。因此,將MaChi3 的氨基酸序列提交至PDB 數(shù)據(jù)庫,結(jié)果表明該酶與來源于約氏黃桿菌 (Flavobacteriumjohnsoniae) UW101 的GH18 家族幾丁質(zhì)酶具有32%的一致性。GH18 家族幾丁質(zhì)酶具有保守序列DxDxE 和SxGG,DxDxE基序為幾丁質(zhì)酶的催化中心,而SxGG 基序負(fù)責(zé)酶與底物的結(jié)合。在催化過程中,SxGG 基序中的絲氨酸對DxDxE 基序中第一個天冬氨酸上產(chǎn)生的暫時過剩的負(fù)電荷起穩(wěn)定作用[28-29]。如圖1-c 所示,在MaChi3 的催化域中含有符合上述保守基序的145DMDWE149序列,但是SxGG 基序中的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基 (103AVGG106) 所代替,這一發(fā)現(xiàn)與Vaaje-Kolstad 等[30]報道的來源于乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcuslactisssp.Lactis) 的LlChi18A相一致。事實上,除了SxGG 基序中的絲氨酸外,酪氨酸也具有穩(wěn)定電荷的作用。盡管MaChi3 缺乏絲氨酸殘基,但卻含有酪氨酸殘基 (Y45,相當(dāng)于LlChi18A 的Y48)。另外,Vaaje-Kolstad 等[30]研究發(fā)現(xiàn),在與LlChi18A 催化域相似性較高的50 個不同來源的GH18 家族幾丁質(zhì)酶的催化域中,約有一半蛋白質(zhì)的絲氨酸或酪氨酸殘基被替代,但是這兩個保守氨基酸殘基不會被同時替代??傊?,以上序列分析結(jié)果表明,MaChi3 是一種新型的GH18 家族幾丁質(zhì)酶。

    2.2 MaChi3 的誘導(dǎo)表達(dá)

    重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,利用鎳親和層析色譜柱對粗酶液進(jìn)行純化,在大約47 kD 處出現(xiàn)一條蛋白條帶 (圖2),與推測的蛋白相對分子質(zhì)量 (47.44 kD)基本吻合,表明重組酶MaChi3 已成功在大腸桿菌中表達(dá)。

    圖2 重組酶 MaChi3 的 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant chitinase MaChi3

    2.3 MaChi3 的酶學(xué)性質(zhì)研究

    2.3.1 MaChi3 的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

    為了測定重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的最適反應(yīng)溫度,以膠體幾丁質(zhì)作為底物,在25~65 ℃下進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示,MaChi3 的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,并且在50~60 ℃范圍內(nèi)具有較高的相對酶活力 (>90.4%)。當(dāng)反應(yīng)溫度提高至65 ℃時,相對酶活力急劇下降,僅為23.5% (圖3-a)。為了測定MaChi3 的溫度穩(wěn)定性,將其置于40~60 ℃水浴中孵育1 h,然后在最適反應(yīng)溫度下測定其殘余酶活力。由圖3-b 可知,MaChi3 的溫度穩(wěn)定性良好,在50 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力超過70%,在其最適反應(yīng)溫度55 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力保持在67.3%。

    圖3 重組幾丁質(zhì)酶MaChi3的最適反應(yīng)溫度 (a) 及熱穩(wěn)定性 (b)Fig.3 Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of recombinant chitinase MaChi3

    2.3.2 MaChi3 的最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性

    重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的最適反應(yīng)pH 為7.0,并且在pH 6.0~9.0 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的酶活力 ,相對酶活力高于64% (圖4-a)。為了測定MaChi3的pH 穩(wěn)定性,將該酶置于pH 3.0~10.0 的緩沖液中孵育,之后在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測定其殘余酶活力。MaChi3 在pH 6.0~9.0 范圍內(nèi)孵育1 h后殘余酶活力保持在80%以上,展現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性 (圖4-b)。此外,在其最適反應(yīng)pH (pH 7.0)下孵育1 h 后對其酶活力基本無影響,殘余酶活力為98%。

    圖4 重組幾丁質(zhì)酶 MaChi3 的最適反應(yīng)pH (a) 及pH穩(wěn)定性 (b)Fig.4 Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant chitinase MaChi3

    2.3.3 化學(xué)試劑和金屬離子對MaChi3 的影響

    如表1 所示,Triton X-100 和EDTA 對Ma-Chi3 的酶活力無顯著影響。尿素、SDS、吐溫 20和吐溫60 對MaChi3 具有不同程度的抑制作用,相對酶活力為58.1%~90.4%。吐溫40 和吐溫80 對MaChi3 的酶活力有輕微的促進(jìn)作用,相對酶活力分別為104.1%和108.4%。不同的金屬離子對Ma-Chi3 表現(xiàn)為不同程度的激活或抑制作用。Mg2+和Ca2+對其酶活力具有激活作用,相對酶活力分別為117.7% 和107.3%。Zn2+和Ba2+對MaChi3的酶活力幾乎無影響。而K+、Ag+、Co2+、Fe2+、Cu2+和Fe3+對MaChi3 的酶活力呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用,相對酶活力降低至43.3%~87.2%(表1)。

    表1 化學(xué)試劑和金屬離子對重組酶 MaChi3 酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on activity of recombinant chitinase MaChi3

    2.3.4 MaChi3 的底物特異性和動力學(xué)參數(shù)

    分別以α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、淀粉、纖維素、蝦殼粉和不同脫乙酰度的殼聚糖作為底物,研究重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 的底物特異性。如圖5 所示,MaChi3 在催化膠體幾丁質(zhì)水解時表現(xiàn)出了最高的酶活力 (2.24 U·mg-1)。但是,以α-幾丁質(zhì)粉末作為底物時,酶活力僅為0.59 U·mg-1,前者約是后者的3.8 倍。當(dāng)MaChi3 以蝦殼粉為底物時,酶活力為0.84 U·mg-1,與其催化α-幾丁質(zhì)水解的活性相當(dāng)。以50%脫乙酰度的殼聚糖為底物時,MaChi3展現(xiàn)了較高的水解能力 (1.66 U·mg-1)。但是,隨著脫乙酰度的增加水解效率逐漸降低。以淀粉和纖維素為底物時,酶活力均較低,分別為0.40 和0.39 U·mg-1。此外,以膠體幾丁質(zhì)作為底物,MaChi3 的Km和Vmax值分別為5.93 mg·mL-1和8.58 μmol·(min·mg)-1。

    圖5 重組酶 MaChi3 的底物特異性Fig.5 Substrate specificity of recombinant chitinase MaChi3

    2.3.5 SEM 分析

    為了進(jìn)一步驗證重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 對幾丁質(zhì)底物的水解能力,對酶解前及酶解后的α-幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)進(jìn)行SEM 觀察。α-幾丁質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)緊密、表面略光滑 (圖6-a)。經(jīng)MaChi3 酶解后,表面微觀結(jié)構(gòu)被破壞,變得粗糙、不平整,并出現(xiàn)大小不均勻的碎片附著在表面 (圖6-b)。α-幾丁質(zhì)被制成膠體幾丁質(zhì)后,纖維結(jié)構(gòu)變得松散(圖6-c),暴露出更多的酶切位點,因而經(jīng)MaChi3酶解后,表面變得更加粗糙和褶皺,有更多的小碎片附著在表面 (圖6-d)。以上結(jié)果表明,重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 對幾丁質(zhì)具有水解活力,并對膠體幾丁質(zhì)的水解活力更高,該結(jié)論與底物特異性結(jié)果(圖5) 一致。

    圖6 α-幾丁質(zhì) (a) 和膠體幾丁質(zhì) (b) 以及MaChi3酶解后的α-幾丁質(zhì) (c) 和膠體幾丁質(zhì) (d) SEM圖Fig.6 SEM images of α-chitin (a),colloidal chitin (b),MaChi3-hydrolyzed α-chitin (c) and MaChi3-hydrolyzed colloidal chitin (d)

    2.3.6 N,N-二乙?;鶜ざ堑闹苽?/p>

    如圖7-a 所示,在反應(yīng)初始階段,重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 快速地將膠體幾丁質(zhì)水解為 (GlcNAc)2,同時生成了少量的GlcNAc。反應(yīng)24 h 后,(GlcNAc)2的產(chǎn)率基本保持穩(wěn)定,為285.5 mg·g-1幾丁質(zhì),GlcNAc 的產(chǎn)率為39.8 mg·g-1幾丁質(zhì),考慮到Ma-Chi3 的熱穩(wěn)定性 (圖3-b),此時幾丁質(zhì)酶可能已經(jīng)失去了活性。

    圖7 膠體幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物分析 (a) 和 (GlcNAc)1-6 標(biāo)準(zhǔn)品及水解產(chǎn)物的HPLC圖 (b)Fig.7 Hydrolysis products of colloidal chitin (a) and HPLC spectra of (GlcNAc)1-6 stands and hydrolysis products (b)

    3 討論

    蝦、蟹等甲殼類動物在生產(chǎn)加工過程中會生成大量的廢棄物,其中,外殼占廢物干質(zhì)量的20%~58%。這些外殼中富含蛋白質(zhì) (20%~40%)、礦物質(zhì)(30%~60%) 和幾丁質(zhì) (20%~40%) 等成分。在工業(yè)上,蝦、蟹的外殼是生產(chǎn)幾丁質(zhì)的主要原料。幾丁質(zhì)經(jīng)水解后得到的N-乙酰殼寡糖和單糖具有多種生物活性,已被應(yīng)用于多個領(lǐng)域。因此,從甲殼類動物的殼中提取幾丁質(zhì)并將其轉(zhuǎn)化為更具有應(yīng)用價值的水解產(chǎn)物 [ 如(GlcNAc)2] 是緩解廢棄物污染問題的有效途徑。

    在原核生物中,放線菌是最好的幾丁質(zhì)分解者之一,其體內(nèi)含有豐富的幾丁質(zhì)降解酶系[31],可以利用幾丁質(zhì)作為唯一的碳源和氮源。本研究從放線菌橙黃小單孢菌的基因組DNA 中克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3,經(jīng)過生物信息學(xué)分析得知,MaChi3 屬于GH18 家族幾丁質(zhì)酶。為了簡化酶的分離純化過程,并提高酶的產(chǎn)量[32],本研究將幾丁質(zhì)酶基因Machi3在E.coliBL21 (DE3) 中重組表達(dá),經(jīng)過純化獲得了電泳純的重組幾丁質(zhì)酶。

    不同微生物來源的幾丁質(zhì)酶對溫度表現(xiàn)出不同的敏感性,如來源于橙色假交替單胞菌(Pseudoalteromonasaurantia) 的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃[33],而來源于冷喜幾丁質(zhì)節(jié)桿菌(Chitiniphilusshinanonensis) 的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃[34]。Huo 等[35]克隆表達(dá)了來源于維氏氣單胞菌 (Aeromonasveronii) B565 的幾丁質(zhì)酶,該重組酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃,在50 ℃下孵育1 h 后殘余酶活力僅為20%。相比之下,本研究克隆表達(dá)的重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 具有較高的最適反應(yīng)溫度和良好的熱穩(wěn)定性,為拓寬幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。同時,不同來源的幾丁質(zhì)酶對酸堿適應(yīng)性差異較大,已報道的幾丁質(zhì)酶最佳pH 值范圍為3.0~10.0[36-37]。由于幾丁質(zhì)酶在不同的氫離子(H+)濃度下解離程度不同,其高級結(jié)構(gòu)中S-S 鍵、疏水鍵及氫鍵受到影響,從而影響幾丁質(zhì)酶構(gòu)象的變化而表現(xiàn)出不同的活性。Wang 等[38]克隆、表達(dá)了假交替單胞菌 (Pseudoalteromonassp.) DL-6 來源的幾丁質(zhì)酶ChiA,其最適反應(yīng)pH 為9.0,在堿性條件下 (pH 8.0~12.0) 較穩(wěn)定。Chen 等[39]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa) 幾丁質(zhì)酶的最適pH 為4.5,在酸性條件下 (pH 4.5~6.0) 較穩(wěn)定。而本研究的重組幾丁質(zhì)酶MaChi3 是一種中性酶,并且在中性pH 附近 (pH 6.0~9.0) 具有較好的穩(wěn)定性。由表1 可知,金屬離子螯合劑EDTA 對MaChi3 的酶活性無顯著影響,說明MaChi3 為非金屬依賴性蛋白酶。除了SDS 外,MaChi3 對所測試的化學(xué)試劑表現(xiàn)出了較強的抵抗力。據(jù)報道,SDS 能夠破壞蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的氫鍵,從而破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)[40]。MaChi3 與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶相似,表現(xiàn)出嚴(yán)格的底物特異性[41-42],對膠體幾丁質(zhì)的酶活力高于其他底物,這可能與底物的物理形態(tài)和脫乙酰度有關(guān)。此外,本研究對MaChi3 降解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行了分析。在反應(yīng)過程中 (GlcNAc)2為主要產(chǎn)物,GlcNAc 為唯一副產(chǎn)物,產(chǎn)物類型簡單,有利于后續(xù)的分離純化。(GlcNAc)2已被廣泛用作藥用生物活性物質(zhì)以及抗菌劑和螯合劑。因此,MaChi3 在制備 (GlcNAc)2方面具有潛在應(yīng)用價值。

    4 結(jié)論

    本研究從海洋微生物橙黃小單孢菌的基因組DNA 中克隆到了一條幾丁質(zhì)酶基因Machi3,并成功在大腸桿菌中表達(dá)。MaChi3 的相對分子質(zhì)量為47 kD,為新型的GH18 家族幾丁質(zhì)酶。MaChi3 的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,最適反應(yīng)pH 為7.0。在體外的穩(wěn)定性較好,在55 ℃下孵育1 h 后仍能保持大部分的酶活力 (67%),在pH 6.0~9.0 范圍內(nèi)孵育1 h 后殘余酶活力超過80%。吐溫40、吐溫80、Ca2+和Mg2+對MaChi3 的酶活力有輕微的促進(jìn)作用,Triton X-100、EDTA、Zn2+和Ba2+對MaChi3無顯著性影響,其他化學(xué)試劑和金屬離子對MaChi3表現(xiàn)為不同程度的抑制作用。該酶對α-幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、蝦殼粉、不同脫乙酰度 (50%~95%)的殼聚糖、淀粉以及纖維素均有一定的水解活力,其中膠體幾丁質(zhì)是MaChi3 的最適底物,酶活力為2.24 U·mg-1。α-幾丁質(zhì)被制備成膠體幾丁質(zhì)后,纖維結(jié)構(gòu)變的更加松散,因而更有利于MaChi3 的水解作用。以膠體幾丁質(zhì)為底物時,MaChi3 的Km和Vmax值分別為5.93 mg·mL-1和8.58 μmol·(min·mg)-1。此外,膠體幾丁質(zhì)經(jīng)MaChi3 水解后主要產(chǎn)物為(GlcNAc)2,反應(yīng)24 h 后產(chǎn)率為285.5 mg·g-1幾丁質(zhì),同時生成了少量的GlcNAc。MaChi3 優(yōu)良的酶學(xué)特性使其在 (GlcNAc)2制備方面有一定的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    幾丁質(zhì)膠體底物
    微納橡膠瀝青的膠體結(jié)構(gòu)分析
    石油瀝青(2022年2期)2022-05-23 13:02:36
    兩種品牌大腸菌群酶底物法檢測試劑性能的比較
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:30:56
    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的無色桿菌ZWW8的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學(xué)性質(zhì)研究
    解析參與植物脅迫應(yīng)答的蛋白激酶—底物網(wǎng)絡(luò)
    科學(xué)(2020年2期)2020-08-24 07:57:00
    黃河水是膠體嗎
    微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀
    中國釀造(2017年8期)2017-09-03 06:20:01
    泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進(jìn)展
    康惠爾水膠體敷料固定靜脈留置針對靜脈炎的預(yù)防效果
    康惠爾水膠體敷料聯(lián)合泡沫敷料預(yù)防褥瘡的療效觀察
    幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
    浙江柑橘(2013年2期)2013-01-22 01:34:29
    午夜激情福利司机影院| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩在线高清观看一区二区三区| 老女人水多毛片| av黄色大香蕉| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲国产精品国产精品| 免费黄色在线免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 91精品伊人久久大香线蕉| 天美传媒精品一区二区| 成人特级av手机在线观看| 精品午夜福利在线看| 舔av片在线| 亚洲怡红院男人天堂| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品无大码| 国产精品国产三级专区第一集| 人体艺术视频欧美日本| 欧美区成人在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 五月开心婷婷网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美97在线视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一级毛片aaaaaa免费看小| 看黄色毛片网站| 人人妻人人看人人澡| 男人添女人高潮全过程视频| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 黄色欧美视频在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 新久久久久国产一级毛片| 日日啪夜夜爽| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产一级毛片在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕制服av| 极品教师在线视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 97精品久久久久久久久久精品| 熟女人妻精品中文字幕| 一级黄片播放器| 一级黄片播放器| 人妻系列 视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲四区av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜免费鲁丝| 久久97久久精品| 精品久久久久久久末码| 久久午夜福利片| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产乱来视频区| 韩国av在线不卡| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美精品专区久久| 少妇人妻 视频| av免费在线看不卡| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲av男天堂| 亚洲国产高清在线一区二区三| av.在线天堂| 亚洲内射少妇av| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| av线在线观看网站| 国产精品伦人一区二区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产91av在线免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| 内地一区二区视频在线| 精品久久久噜噜| 国产精品不卡视频一区二区| 特级一级黄色大片| 成年版毛片免费区| 国内精品美女久久久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 成人综合一区亚洲| 联通29元200g的流量卡| 亚洲无线观看免费| 亚洲最大成人av| av在线观看视频网站免费| freevideosex欧美| 黄片wwwwww| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 老司机影院成人| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美激情久久久久久爽电影| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日日啪夜夜撸| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久综合国产亚洲精品| 好男人视频免费观看在线| 国产成人aa在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 尾随美女入室| av天堂中文字幕网| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 深爱激情五月婷婷| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品熟女久久久久浪| 青春草国产在线视频| 男女那种视频在线观看| kizo精华| 国产高清不卡午夜福利| av网站免费在线观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 日日撸夜夜添| 色视频在线一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲精品第二区| 久久久久久久久久久丰满| 免费人成在线观看视频色| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩国内少妇激情av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 只有这里有精品99| 亚洲av男天堂| 少妇的逼好多水| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费看av在线观看网站| 涩涩av久久男人的天堂| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲经典国产精华液单| 国产乱人视频| 亚洲美女视频黄频| a级毛片免费高清观看在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 97精品久久久久久久久久精品| 日本三级黄在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产黄频视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 国产视频首页在线观看| 日本欧美国产在线视频| 婷婷色av中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 午夜日本视频在线| xxx大片免费视频| 69人妻影院| 国产 精品1| 成人亚洲精品av一区二区| 国产淫语在线视频| 国产精品.久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩伦理黄色片| 日韩av免费高清视频| 亚洲四区av| 亚洲人成网站在线播| 老女人水多毛片| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久网色| 丝瓜视频免费看黄片| 熟女av电影| 免费观看av网站的网址| 看非洲黑人一级黄片| 一级a做视频免费观看| 六月丁香七月| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本三级黄在线观看| 免费看不卡的av| 欧美区成人在线视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 有码 亚洲区| 亚洲四区av| 中文在线观看免费www的网站| 女人久久www免费人成看片| av免费观看日本| 99热国产这里只有精品6| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 婷婷色av中文字幕| 欧美97在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 69人妻影院| 欧美日韩亚洲高清精品| 国内精品宾馆在线| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲图色成人| 国产精品99久久久久久久久| 制服丝袜香蕉在线| 一区二区av电影网| 国产亚洲91精品色在线| 欧美日韩在线观看h| 国产一区二区三区av在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人国产av品久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 99九九线精品视频在线观看视频| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美 日韩 精品 国产| 99re6热这里在线精品视频| 全区人妻精品视频| 亚洲电影在线观看av| 美女国产视频在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产精品999| 久久久午夜欧美精品| 日韩av免费高清视频| 国产免费视频播放在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 好男人视频免费观看在线| 久久精品国产亚洲av天美| 在线a可以看的网站| 亚洲天堂av无毛| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美另类一区| 国产淫片久久久久久久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久久午夜电影| av一本久久久久| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产av新网站| 69人妻影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产 一区精品| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲,欧美,日韩| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 春色校园在线视频观看| 国产精品伦人一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久a久久爽久久v久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 两个人的视频大全免费| 久久久久久久午夜电影| 乱系列少妇在线播放| 国产在线男女| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一区二区av电影网| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 特级一级黄色大片| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久国产a免费观看| 国产 精品1| 午夜免费观看性视频| 免费看不卡的av| 亚洲成色77777| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇丰满av| 亚洲色图综合在线观看| 91精品国产九色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲美女搞黄在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av不卡在线观看| 国产成人精品福利久久| 看非洲黑人一级黄片| 毛片一级片免费看久久久久| 日日啪夜夜爽| 永久网站在线| 欧美xxⅹ黑人| 大片电影免费在线观看免费| 大香蕉97超碰在线| 国产精品国产av在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 性色av一级| 一个人看视频在线观看www免费| 99热国产这里只有精品6| 性色avwww在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 老司机影院毛片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 十八禁网站网址无遮挡 | 高清在线视频一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 777米奇影视久久| 人妻系列 视频| www.av在线官网国产| 我的女老师完整版在线观看| 国产在视频线精品| 久久这里有精品视频免费| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 熟女人妻精品中文字幕| 免费看不卡的av| 久久精品国产自在天天线| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产一区二区三区av在线| 天天躁日日操中文字幕| 国产高清三级在线| 永久免费av网站大全| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费看av在线观看网站| av天堂中文字幕网| 国产成人福利小说| 成人二区视频| av福利片在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| a级毛色黄片| 白带黄色成豆腐渣| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99久久精品国产国产毛片| 波多野结衣巨乳人妻| av播播在线观看一区| 亚洲国产最新在线播放| 久久久精品免费免费高清| 国产精品无大码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 我的老师免费观看完整版| 视频中文字幕在线观看| 国产乱人偷精品视频| 中文字幕av成人在线电影| av国产精品久久久久影院| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲国产av新网站| 国产免费福利视频在线观看| 国产黄片美女视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产a三级三级三级| 久久精品国产a三级三级三级| 国产成人精品一,二区| 男女边摸边吃奶| av在线播放精品| 成人综合一区亚洲| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产在视频线精品| 国产毛片在线视频| 亚洲精品色激情综合| 人妻系列 视频| 老司机影院毛片| 麻豆国产97在线/欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产亚洲最大av| 欧美成人午夜免费资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 偷拍熟女少妇极品色| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 身体一侧抽搐| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产v大片淫在线免费观看| 1000部很黄的大片| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲成人一二三区av| 插逼视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 99热全是精品| 黄色日韩在线| 男女国产视频网站| 国产爽快片一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日韩强制内射视频| 如何舔出高潮| 国产永久视频网站| 色播亚洲综合网| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品成人久久久久久| 五月天丁香电影| 久久鲁丝午夜福利片| 黑人高潮一二区| 亚洲av不卡在线观看| 永久免费av网站大全| 最近中文字幕高清免费大全6| 丝袜喷水一区| 久久国产乱子免费精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人freesex在线| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产欧美在线一区| 久久99热6这里只有精品| av.在线天堂| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 91精品伊人久久大香线蕉| 日日啪夜夜爽| 国产精品无大码| 亚洲人与动物交配视频| 九九在线视频观看精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲图色成人| 亚洲精品,欧美精品| 国内精品宾馆在线| 黄色配什么色好看| 2018国产大陆天天弄谢| 成年av动漫网址| 免费大片黄手机在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 22中文网久久字幕| 一区二区三区四区激情视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 99久久精品热视频| 国产乱来视频区| 亚洲av日韩在线播放| 色播亚洲综合网| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 一级毛片电影观看| 香蕉精品网在线| 日日啪夜夜撸| 好男人在线观看高清免费视频| 在线播放无遮挡| 最近最新中文字幕免费大全7| 成人亚洲精品av一区二区| 久久99精品国语久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲最大成人中文| a级毛片免费高清观看在线播放| 老女人水多毛片| av免费观看日本| 国产 精品1| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品不卡视频一区二区| 国产av不卡久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人国产麻豆网| 晚上一个人看的免费电影| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 大片免费播放器 马上看| 91狼人影院| 国产成人福利小说| 亚洲不卡免费看| 亚洲成人av在线免费| 久久精品综合一区二区三区| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费大片18禁| 成年女人在线观看亚洲视频 | 韩国av在线不卡| 中文天堂在线官网| 午夜老司机福利剧场| 国产毛片a区久久久久| 国产视频首页在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲国产av新网站| 极品教师在线视频| 久久99精品国语久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久久久久久久免费av| 嫩草影院新地址| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品一及| 亚洲人成网站在线播| 国产 一区精品| 一级黄片播放器| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 热99国产精品久久久久久7| 熟女电影av网| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲成色77777| 丝袜美腿在线中文| 99re6热这里在线精品视频| 久久久久久久午夜电影| 联通29元200g的流量卡| 大码成人一级视频| tube8黄色片| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 国产成人免费观看mmmm| 欧美高清性xxxxhd video| 看非洲黑人一级黄片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩在线观看h| 久久精品久久久久久久性| 午夜福利在线在线| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产老妇伦熟女老妇高清| 永久免费av网站大全| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产欧美亚洲国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 色5月婷婷丁香| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品一二三| 国产精品精品国产色婷婷| av在线亚洲专区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久影院123| 人妻 亚洲 视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 七月丁香在线播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 视频区图区小说| 免费看av在线观看网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 又爽又黄无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线| 嘟嘟电影网在线观看| eeuss影院久久| 欧美极品一区二区三区四区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 内地一区二区视频在线| 草草在线视频免费看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品一及| 99热这里只有是精品50| 国产精品人妻久久久影院| 直男gayav资源| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲av成人精品一区久久| 在线观看三级黄色| 成人欧美大片| 精品一区在线观看国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 嫩草影院精品99| 99re6热这里在线精品视频| 精品一区在线观看国产| 中文在线观看免费www的网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久久久免| 少妇丰满av| 国产在线一区二区三区精| av免费在线看不卡| 熟妇人妻不卡中文字幕| 午夜福利在线在线| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲最大成人手机在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色播亚洲综合网| 亚洲成人av在线免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美区成人在线视频| 亚洲最大成人手机在线| 两个人的视频大全免费| 精品人妻熟女av久视频| 只有这里有精品99| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 精品午夜福利在线看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩制服骚丝袜av| av线在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 久热这里只有精品99| 一级二级三级毛片免费看| 日本熟妇午夜| 亚洲国产最新在线播放| 在线看a的网站| 久久精品国产亚洲网站| 精华霜和精华液先用哪个| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久久久大av|