野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝體框特征和線粒體16S rRNA 基因的比較分析

夏飛宇，張秀梅，徐 翩，徐 穎，王一航

浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022

厚殼貽貝 (Mytiluscoruscus) 是廣泛分布于黃海和東海沿岸海域的重要經(jīng)濟貝類。浙江省嵊泗縣是我國厚殼貽貝的原產(chǎn)地和主要養(yǎng)殖區(qū)域[1]，20 世紀70 年代前，嵊泗列島產(chǎn)出的貽貝一直為野生厚殼貽貝[2]，它們通常生活在低潮帶至水深20 m 處，附著于海浪擊打的巖礁上和溝縫中。隨著厚殼貽貝人工育苗技術(shù)研究的開展和推廣[1,3]，其養(yǎng)殖業(yè)在嵊泗縣逐漸發(fā)展起來，使用筏或延繩的懸浮養(yǎng)殖技術(shù)迅速普及。較其他養(yǎng)殖方式(如木樁養(yǎng)殖和底播養(yǎng)殖)，懸浮養(yǎng)殖下的貽貝生長速度更快，軟組織飽滿程度更高[4]。

潮間帶是陸地與海洋的過渡地帶，嵊泗縣周邊潮間帶以巖相為主，與養(yǎng)殖海域相比，這是種截然不同的生境。對巖相潮間帶的大量研究表明，海浪拍擊、巖縫擠壓、空氣暴露時長以及生長密度會對軟體動物的外殼產(chǎn)生深遠影響[5-6]；這些復(fù)雜的因素使得無法直接預(yù)測其形態(tài)變異。因此，了解厚殼貽貝的生活環(huán)境是如何影響其生長的，對貽貝養(yǎng)殖業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展極為重要。

線粒體DNA (mtDNA)由于具有突變率高、母系遺傳幾乎不發(fā)生重組等特點，是研究物種遺傳多樣性和分子進化的有效工具。對于雙殼貝類形態(tài)學(xué)的研究，國內(nèi)外已有較多報道，多與遺傳多樣性結(jié)合(通過微衛(wèi)星標記和DNA 條形碼)[7-9]。如Yuan 等[10]利用形態(tài)學(xué)、微衛(wèi)星和mtDNA 標記對日本野生和中國養(yǎng)殖群體櫛孔扇貝 (Chlamys farreri) 進行研究，發(fā)現(xiàn)它們之間無顯著的形態(tài)差異，但日本野生扇貝可分為南北兩個種群且和中國養(yǎng)殖群體存在遺傳差異；He 等[11]通過全基因組測序和殼形分析證實太平洋牡蠣 (Crassostreagigas) 的外殼形狀會在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)生變化；徐義平等[12]結(jié)合形態(tài)學(xué)、SRAP 標記兩種手段，探究了中國沿海4 個省份的11 個縊蟶 (Sinonovaculaconstricta) 群體，指出浙江樂清灣野生群體間具有較高的形態(tài)和遺傳相似性。目前關(guān)于野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝形態(tài)差異的研究尚未見報道，尚不清楚這種差異是否由遺傳造成。基于此，本研究采集了嵊泗縣嵊山、枸杞島巖相潮間帶 (簡稱野生) 和筏架養(yǎng)殖區(qū) (簡稱養(yǎng)殖) 不同生境下的厚殼貽貝樣本，測量分析其殼長、殼質(zhì)量，構(gòu)建體框特征并進行形態(tài)特征分析，同時對比其線粒體16SrRNA基因序列，以期為厚殼貽貝的種質(zhì)資源保護及其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)域及樣品采集

厚殼貽貝于2021 年8 月至2022 年4 月采自浙江省嵊泗縣嵊山鎮(zhèn)周邊海域 (122.73°E—122.79°E,30.69°N—30.75°N)。其中養(yǎng)殖貽貝取自枸杞島干斜村金盟厚殼貽貝筏架養(yǎng)殖區(qū)；野生樣品為枸杞島巖相潮間帶自然生長的貽貝。根據(jù)殼長確定厚殼貽貝年齡[13]：1 齡殼長介于24.0～56.0 mm，2 齡殼長介于56.0～75.0 mm，3 齡殼長介于75.0～85.0 mm，4 齡貝殼長介于85.0～100.0 mm，5 齡殼長介于100.0～110.0 mm。為避免異速生長帶來的影響，體框特征分析選取的樣品為2+ 齡。

1.2 樣品處理

采集貝體完整無損的厚殼貽貝，刮干凈殼表面附著的生物及足絲，帶回實驗室解剖。烘干后用電子天平稱取殼干質(zhì)量 (精度0.01 g)。從中隨機挑選157 只厚殼貽貝 (養(yǎng)殖78 只，野生79 只)，參考白曉倩等[14]的方法并略做改進，構(gòu)建體框特征模型。體框特征點如圖1 所示，包括殼寬(W)、殼高 (H)、殼長頂 (A)、殼背頂 (B)、鉸合部上端(C)、殼頂 (D)、寬頂 (O)、足絲孔 (E) 及殼頂至腹緣的垂足(F)。通過電子數(shù)顯游標卡尺 (精度0.01 mm) 測量它們的長度和距離，以此獲得W (L1)、H (L2)、AB (L3)、BC (L4)、CD (L5)、DE (L6)、AE (L7)、OA (L8)、OB (L9)、OC (L10)、OD (L11)、OE (L12)、OF (L13) 13 個貝體框特征指標。

圖1 體框特征測量點Fig.1 Measurement points of shell frame characteristics

1.3 線粒體DNA 提取、PCR 擴增及測序

隨機額外選擇野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝各20 只，解剖并提取其閉殼肌mtDNA。步驟如下：取約100 mg 閉殼肌組織，采用標準的酚-氯仿法提取基因組DNA，將乙醇沉淀后的基因組DNA 加入100 μL 胰蛋白酶/EDTA (TE) 緩沖液溶解。擴增16SrRNA基因片段的引物序列如下：16S ar：5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'；16S br：5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'。擴增產(chǎn)物純化及測序(Sanger) 由上海生工生物公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 形態(tài)差異分析

使用SPSS 26.0 軟件分別計算野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的體框特征指標平均值、標準差以及變異系數(shù)，不同生長區(qū)域的貽貝通過獨立樣本t檢驗判斷顯著性 (P＜0.05 表示差異顯著)。結(jié)果由GraphPad Prism 9.0 軟件繪圖。此外，使用R-4.1.3 軟件對13 個體框特征參數(shù)進行Pearson 相關(guān)性分析；通過主成分分析 (Principal component analysis,PCA) 對數(shù)據(jù)進行降維，保留特征根大于1 的主成分 (Principal component,PC) 用于后續(xù)分析；運用逐步判別法，構(gòu)建野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的判別函數(shù)并計算判別準確率，計算公式參照李思發(fā)等[15]。

1.4.2 遺傳多樣性分析

將測序結(jié)果用MEGA 7.0 剪切、比對并輔以人工校對分析核苷酸變異，以Kimura 雙參數(shù)法 (Kimura-2-parameter)為替代模型并基于鄰接距離法 (Neighbor-Joining) 構(gòu)建野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的系統(tǒng)發(fā)育樹[16](重抽樣3 000 次)。使用DNASP 5.10 計算單倍型數(shù)量 (N)、單倍型多樣性 (Hd) 和核苷酸多樣性 (π) 來估計野生和養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性。由POPART 繪制median joining network (MJN)，構(gòu)建養(yǎng)殖和野生厚殼貽貝的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝殼長與殼質(zhì)量的關(guān)系

對已收集到的所有厚殼貽貝殼長 (L)、殼干質(zhì)量 (G) 數(shù)據(jù) (養(yǎng)殖316 只、野生393 只) 進行回歸分析，得到兩條回歸關(guān)系式：G野= 0.000 3L2.5937(R2=0.930)，G養(yǎng)=0.000 2L2.5537(R2=0.877)。從回歸式和回歸曲線 (圖2) 可以看出，厚殼貽貝的殼長-殼質(zhì)量關(guān)系式基本符合冪函數(shù)增長規(guī)律。野生貽貝殼質(zhì)量與殼長的冪指數(shù)b(2.593 7) 要略大于養(yǎng)殖貽貝(b=2.553 7)，意味著在相同體長下野生群體的殼質(zhì)量更大，且這種趨勢隨著貽貝個體的增長更為明顯。

圖2 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝殼長和殼質(zhì)量的關(guān)系Fig.2 Relationship between shell length and shell mass of wild and cultured M.coruscus

2.2 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝體框特征參數(shù)比較

不同生長區(qū)域厚殼貽貝的貝殼體框特征參數(shù)見表1。從圖3 可以看出，除L4、L11和L13外，野生群體和養(yǎng)殖群體的各項體框特征差異顯著 (P＜0.01)。與自然生長在潮間帶的野生貽貝相比，養(yǎng)殖群體各項體框特征長度均相對較短，僅L7大于野生群體。統(tǒng)計結(jié)果顯示，野生群體L4的變異系數(shù)最大 (21.22%)，遠高于養(yǎng)殖群體及其他特征指標，說明野生群體貝殼在L4這一指標上的選擇潛力很大。13 項體框指標中，野生群體有9 項指標 (L1、L3、L4、L5、L6、L7、L9、L11、L13) 的變異系數(shù)大于養(yǎng)殖群體，說明野生群體的貝殼在生長過程中的可塑性要略高于養(yǎng)殖群體。上述結(jié)果表明，不同生長區(qū)域的厚殼貽貝外觀上的區(qū)分度較大。

表1 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝體框特征參數(shù)Table 1 Shell frame characteristics parameters of wild and cultured M.coruscus

圖3 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝體框特征差異Fig.3 Differences in shell frame characteristics between wild and cultured M.coruscus

2.3 體框特征之間的相關(guān)性分析和主成分分析

由圖4 可知，野生與養(yǎng)殖貽貝各體框特征間存在相關(guān)性 (P＜0.05)，但所有體框特征間的相關(guān)系數(shù)絕對值均未大于0.7。L1和L2作為衡量厚殼貽貝外部形態(tài)的重要指標，與其他變量的正相關(guān)最多。而L7與其他變量均為負相關(guān)，且與L6的負相關(guān)系數(shù)最大 (-0.65)。各體框特征中，L11與其他特征的相關(guān)程度最低，僅與L8、L9顯著相關(guān)。L9與L2、L8存在最高的正相關(guān)性 (相關(guān)系數(shù)均為0.63)。

圖4 體框特征間的相關(guān)性系數(shù)Fig.4 Correlation coefficient between shell frame characteristics

通過對體框特征進行KMO 適合度和Bartlett 球形檢驗，發(fā)現(xiàn)各特征值的相關(guān)系數(shù)矩陣和零矩陣存在顯著性差異 (Bartlett 球形檢驗P＜0.01)，且主成分分析的適合度為適中 (KMO=0.742＞0.7)，因此對13 個體框特征進一步做主成分分析。提取的4 個特征根大于1 的主成分中，PC1 解釋的方差貢獻率為32.44% (表2)，遠高于另外3 個主成分 (分別為14.02%、11.33%和9.70%)。PC1 由L1、L2、L3、L6、L7、L8、L9、L10、L12決定 (載荷絕對值大于0.5)，第二個主成分主要由L5(載荷絕對值等于0.633) 決定 (表2)。L11主要與PC3 相關(guān)，而PC4 主要受L4影響。由PC1 和PC2 的得分圖 (圖5) 可見，養(yǎng)殖群體的數(shù)據(jù)點較為集中，說明其形態(tài)一致性較高；而野生群體的數(shù)據(jù)點分散，說明其形態(tài)更為多樣。

表2 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝體框特征之間的主成分分析Table 2 Principal component analysis of shell frame characteristics between wild and cultured M.coruscus

圖5 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝主成分分析得分圖Fig.5 Principal component scores of wild and cultured M.coruscus

2.4 體框特征之間的判別分析

采用逐步判別分析法，從13 個體框特征中選擇對判別結(jié)果有顯著影響的。F檢驗結(jié)果顯示L1、L2、L10、L12這4 個體框特征對判別結(jié)果有顯著性影響 (P＜0.01)。以此得到一個典型判別函數(shù)LD1=30.60L1+15.12L2+14.34L10+6.99L12-285.02，典型判別函數(shù)相關(guān)性為0.848，Wilks'lambda檢驗顯著性＜0.01，說明該判別函數(shù)具有顯著性。

使用Fisher's 判別法，得到各生長區(qū)域厚殼貽貝的分類函數(shù)如下：

養(yǎng)殖群體：y養(yǎng)=573.15L1+448.99L2+437.26L10+132.74L12-285.02

厚殼群體：y野=670.28L1+497.00L2+482.79L10+154.93L12-364.06

依靠判別函數(shù)，對養(yǎng)殖貽貝的判別準確率達到了98.7%，而對潮間帶野生貽貝的判別準確率也有91.1%，綜合判別準確率為94.9%?？梢娕袆e公式能有效區(qū)分養(yǎng)殖和野生群體。

2.5 野生與養(yǎng)殖群體16S rRNA 基因差異

對擴增和測序成功的24 只厚殼貽貝序列進行比對后，獲得507 bp 的16SrRNA基因片段。樣品的平均核苷酸組成為A=30.8%，C =15.9%，G=23.3%，T=30.0%，G+C 平均含量39.2%。共檢測出12 個單倍型，其中養(yǎng)殖群體獨有單倍型4 個，野生群體獨有單倍型6 個，兩群體共享單倍型2 個。構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 (圖6) 顯示，厚殼貽貝的單倍型明顯分為了兩簇 (分別以Hap-1 和Hap-2 為中心)，各簇之內(nèi)的單倍型堿基變異步數(shù)均較低，但兩簇之間的堿基變異步數(shù)達到了101。本次樣品未檢測到Hap-7 和Hap-8間的連接節(jié)點單倍型。由系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖7) 可知，每個分支均包含來自野生和養(yǎng)殖的厚殼貽貝，表明野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝基本無分子水平上的遺傳分化。

圖6 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝16S rRNA基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Haploid network diagram of 16S rRNA gene in wild and cultured M.coruscus

圖7 鄰接距離法構(gòu)建的厚殼貽貝16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹注：YS 代表野生厚殼貽貝，YZ 代表養(yǎng)殖厚殼貽貝。Fig.7 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene of M.coruscusNote: YS represents wild M.coruscus,and YZ represents cultured M.coruscus.

由DNASP 分析可見，養(yǎng)殖貽貝的Hd為0.682，明顯低于野生貽貝 (0.894)。在兩個群體中一共檢測到112 個多態(tài)位點，其中簡約信息位點在野生和養(yǎng)殖群體中的數(shù)量均達到105。兩個群體的π較為接近 (養(yǎng)殖群體為0.087，野生群體0.089)，展現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

3 討論

3.1 野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

殼形既是雙殼貝類選育的重要指標，也是實際銷售過程中消費者推斷其經(jīng)濟價值的重要判斷依據(jù)。本研究中，L1、L2代表的變量分別是殼寬、殼高，其大小直接影響殼的整體外形。相同體長下野生厚殼貽貝的殼更寬、更厚(P＜0.01)，意味著野生群體形態(tài)可能更圓鈍，而養(yǎng)殖群體相對更扁平。這與Grefsrud 和Oivind[17]對巨海扇蛤 (Pectenmaximus) 的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)與同齡野生巨海扇蛤相比，養(yǎng)殖海扇蛤的殼更脆、更小、更輕，在應(yīng)對潮汐和海浪時，較大的殼質(zhì)量及尺寸可以起到更有效的保護作用。L10、L12是通過逐步判別篩選出的另兩個重要變量，分別表示殼背頂距離足絲孔和鉸合部上端的距離。結(jié)合L1、L7、L8與L11的值，可以看出野生厚殼貽貝殼寬頂O 的位置更靠近前端，它將殼面分為上 (四邊形AEOB)、下 (四邊形EOCD) 兩部分，養(yǎng)殖群體有寬大扁平的上部外殼，而野生群體則有較為膨脹的下部外殼。通常來說，扁平的殼形能減小水流阻力，而厚重圓潤的殼形使野生厚殼貽貝更能抵抗海浪的拍擊。顧志峰等[18]在對馬氏珠母貝 (Pinctada martensi) 的研究中也發(fā)現(xiàn)大亞灣野生種群的貝體外形較凸,而印度養(yǎng)殖種群的貝體外形顯得扁平。L4的大小代表了貽貝背角彎曲的程度，L4越大，貽貝的背角越不明顯，背緣呈弧形三角形。L4與其他指標的相關(guān)性相對較低且有著極高的變異系數(shù)，說明在后天的生長發(fā)育過程中，背角可能更易受外界環(huán)境干擾。已有研究也報道了厚殼貽貝幼年個體背角很明顯，但隨著生長會產(chǎn)生不同的變化[19]。

3.2 野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的遺傳多樣分析

測序結(jié)果表明厚殼貽貝出現(xiàn)明顯的堿基A/T 傾向性(A/T 占比達到60%)，這與軟體動物線粒體基因堿基組成特點相一致[20-21]。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，其高低決定了物種的生存進化能力。本研究中野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝呈現(xiàn)出高核苷酸多樣性和單倍型多樣性，其16SrRNA核苷酸多樣性均高于0.08，大于四角蛤蜊 (Mactraveneriformis)、西施蛤 (Coelomactraantiquate)[22]、菲律賓蛤仔 (Ruditapesphilippinarum)[23]，說明嵊泗厚殼貽貝種質(zhì)資源保護較好，且野生群體的遺傳多樣性要高于養(yǎng)殖群體。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示所有厚殼貽貝形成了兩個分支，但野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝在每個分支均有出現(xiàn)，可能是因為它們之間存在基因流，說明單從遺傳差異無法完全解釋野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝的形態(tài)差異。管成林等[8]、Shen 等[24]在對線粒體COI基因的研究中同樣發(fā)現(xiàn)野生和養(yǎng)殖厚殼貽貝無明顯的遺傳分化。嵊泗養(yǎng)殖海域厚殼貽貝苗種部分引自福建，葉瑩瑩等[25]對福州、舟山、溫州、寧德4 個地理群體厚殼貽貝的16SrRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，福州群體與其他群體間遺傳距離較大，這可能是造成本研究中單倍型兩簇間出現(xiàn)較大堿基差異的原因。

3.3 野生與養(yǎng)殖厚殼貽貝形態(tài)差異的解析

雙殼貝類的殼表現(xiàn)出一種極強的表型可塑性[26]，這種可塑性可能是種內(nèi)遺傳變異所致[27-28]，也可以歸因于某些環(huán)境因素，這是對棲息環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果[29-31]。本研究中，即使是距潮間帶僅幾百米的養(yǎng)殖厚殼貽貝，殼的形態(tài)也與野生群體有顯著性差異，這可能是由波浪暴露影響所致。固著生物在生命周期會產(chǎn)生位移風(fēng)險，這種風(fēng)險隨著流速的增加而上升，隨著貽貝韌性或附著強度的增加而降低[32]。很多學(xué)者就海洋波浪作用對貽貝殼形態(tài)的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)波浪暴露區(qū)域的貽貝有著和非波浪暴露區(qū)貽貝不同的殼分泌模式 (形狀和厚度)。例如Steffani 和Branch[33]發(fā)現(xiàn)紫貽貝 (M.galloprovincialis) 在受到波浪中度暴露時的生長速度及殼厚度，大于無暴露和高強度波浪暴露時。Akester和Martel[34]發(fā)現(xiàn)暴露在潮間帶中的貽貝 (M.trossulus) 的殼高/寬比較低，還有更堅固的鉸合齒和更厚的韌帶。因此，波浪暴露可能是影響貽貝殼形態(tài)的重要環(huán)境因素。

造成野生與養(yǎng)殖貽貝形態(tài)差異的另一個原因可能是生長密度導(dǎo)致的營養(yǎng)條件差異。雖然已有研究表明過高的生長密度不會使貽貝受到物理上的直接擠壓、磨損[35]，但大面積的養(yǎng)殖活動直接影響了海區(qū)的水動力結(jié)構(gòu)[36]。溫英[37]通過對流場的模擬證實了枸杞島貽貝養(yǎng)殖區(qū)的水層流速會受到貽貝串阻力的衰減作用。由于貽貝是濾食性生物，水流交換強度會直接影響其棲息地的餌料質(zhì)量和數(shù)量。相較于流速平緩的養(yǎng)殖區(qū)，潮間帶的營養(yǎng)物質(zhì)擴散更快，沿岸的波浪可以快速彌補貽貝附著地的顆粒有機物消耗[38]。這種營養(yǎng)條件差異會影響貝類的外殼形態(tài)，如Watanabe 和Katayama[39]發(fā)現(xiàn)棲息于營養(yǎng)條件較好環(huán)境中的菲律賓蛤仔個體比生長于貧營養(yǎng)環(huán)境中的個體殼寬更小，殼形橢圓化程度更高。由于雙殼貝類的殼形與其出肉率關(guān)系密切[40-41]，在波浪作用頻繁的潮間帶，食物供應(yīng)的增加可能使厚殼貽貝生長更快，進而可以分配更多的能量用于軟組織發(fā)育。但與此同時，海水動力也可能增加厚殼貽貝對足絲附著強度和貝殼厚度的需求，且貽貝的攝食率在食物濃度達到一定閾值時會保持相對穩(wěn)定，新陳代謝加快，消耗的能量也越來越多[42]。因此推測在一定閾值內(nèi)，波浪暴露和營養(yǎng)條件會對貽貝生長產(chǎn)生積極影響，但過度的波浪作用和過快的水流速度則可能產(chǎn)生負面影響。

4 結(jié)論

綜上所述，枸杞島海域厚殼貽貝種質(zhì)資源保護較好，但不同的生長環(huán)境使浮筏養(yǎng)殖厚殼貽貝較同齡野生群體的貝殼更為輕薄，16SrRNA基因測序結(jié)果證明了這種形態(tài)差異不是由遺傳造成。本研究所選取的13 個體框特征指標中有11 個存在顯著性差異，關(guān)鍵判別變量為L1(殼寬)、L2(殼高)、L10(殼頂至鉸合部上端距離) 和L12(殼頂至足絲孔距離)，這4 個體框特征可作為評價厚殼貽貝整體形狀、生長潛力和營養(yǎng)狀況的重要指標。生長密度和水動力差異可能是造成厚殼貽貝野生和養(yǎng)殖群體形態(tài)差異的主要原因，今后可從這兩個角度出發(fā)，合理規(guī)劃枸杞島貽貝筏架區(qū)的布局。