基于非靶向代謝組學分析兩種日糧模式下克氏原螯蝦肌肉的代謝差異

鮑俊杰，王永杰，陳紅蓮，孫 雯，張 靜，周蓓蓓

1.安徽農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031

2.水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031

克氏原螯蝦 (Procambarusclarkii) 又稱小龍蝦，于20 世紀30 年代引入中國，因環(huán)境適應能力強、食性廣、繁殖快、產(chǎn)量高等特點受到養(yǎng)殖者的青睞，近年來已發(fā)展成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。2021 年，我國克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)總值達到4 221.95億元，經(jīng)過40 年的發(fā)展，已形成集繁育養(yǎng)殖、加工出口、物流餐飲、文化節(jié)慶為一體的完整產(chǎn)業(yè)鏈，成為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。隨著克氏原螯蝦大面積養(yǎng)殖的興起，其品質(zhì)參差不齊的問題也隨之顯現(xiàn)。因此，如何采用復合蛋白來源提升其養(yǎng)殖健康和品質(zhì)[2]，亟須深入研究。

代謝組學技術是研究小分子物質(zhì)及其在生物體中動態(tài)變化的技術[3]，檢測方式上可以分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學，廣泛應用于臨床醫(yī)學[4]、食品科學[5]、環(huán)境功能[6]等多個研究領域。代謝組學常結合核磁共振技術 (NMR)[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術 (LC-MS)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術 (GC-MS)[9]等檢測手段滿足不同的實驗需求[10]。近年代謝組學也已應用于水產(chǎn)領域，劉慧茹等[11]利用代謝組學技術，結合斑馬魚 (Danio rerio) 評價模型，發(fā)現(xiàn)皂苷類成分可能與抗疲勞活性有關；張彥坤等[12]通過代謝組學分析測定劍魚(Xiphophorushelleri) 肝臟內(nèi)源物的變化，探究了饑餓脅迫對水生動物的影響。

飼料不僅應給動物體提充足的營養(yǎng)和能量[13]，還應具有提升養(yǎng)殖功效的活性物質(zhì)[14]。目前，關于提升水產(chǎn)養(yǎng)殖功效的報道多集中在考察養(yǎng)殖產(chǎn)品的生長、生化指標和腸道微生物檢測等方面[15-16]。近些年針對不同日糧下動物肌肉中代謝產(chǎn)物變化的研究逐漸增多，認為肌肉中氨基酸、脂類和功能物質(zhì)等代謝產(chǎn)物的變化直接影響了肌肉品質(zhì)[17-18]，并結合代謝組分析更加全面準確地把握營養(yǎng)代謝乃至相關基因調(diào)控等方面的信息[19-20]。但目前關于克氏原螯蝦代謝組學相關的研究報道較少。針對以上問題，本文利用非靶向代謝組學技術結合超高效液相色譜-質(zhì)譜技術 (UHPLC-MS)，通過多元統(tǒng)計分析進行差異代謝物篩選，并對差異代謝物進行 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 通路分析，對比兩種日糧模式下克氏原螯蝦肌肉代謝組的差異及主要特征標志物，探究不同日糧下克氏原螯蝦肌肉代謝產(chǎn)物的變化，以為提升克氏原螯蝦養(yǎng)殖品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與樣品采集

挑選附肢健全、活力較好的克氏原螯蝦于2022 年6 月養(yǎng)于安徽省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所基地的克氏原螯蝦蝦塘。選擇臨近塘口，保持水源相同，蝦塘面積為0.200～0.267 hm2，放養(yǎng)蝦苗體質(zhì)量為5～10 g，放養(yǎng)密度為10 尾·m2，養(yǎng)殖周期為60 d，分別投喂蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為32%的常規(guī)飼料和發(fā)酵飼料，飼料配方和基本組成見表1。每日07:00 和18:00 各投飼1次，日投喂量約為蝦體質(zhì)量的4%。養(yǎng)殖期結束后，分別從不同組塘口各取5 尾蝦共混合5.0 g 樣品冷凍待測備用，每個處理均取3 份作為重復。

克氏原螯蝦的體質(zhì)量增長率 (WGR) 和特定生長率 (SGR) 指標按以下公式計算：

式中：RWG為體質(zhì)量增長率(%)；RSG為特定生長率(%·d-1)；m0為養(yǎng)殖初始體質(zhì)量 (g)；mt為養(yǎng)殖末體質(zhì)量 (g)；t為飼喂時間 (d)。

1.2 儀器與材料

低溫高速離心機 (Eppendorf 5430R)；超聲破碎儀 (寧波新芝 JY92-II)；MP Fastprep-24 勻漿儀 (MP Biomedicals)；質(zhì)譜儀AB Triple TOF 6600；超高壓液相色譜儀Vanquish UHPLC、色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide (1.7 μm,2.1 mm×100 mm)。甲醇、醋酸銨、甲酸、乙腈、乙酸銨等購于美國CNW Technologies 科技公司，均為色譜純；常規(guī)飼料和發(fā)酵飼料均購于安徽萬士生物制藥有限公司。

1.3 樣本提取

克氏原螯蝦肌肉樣品室溫下解凍后，稱取100 mg 到1.5 mL EP 管中，加入鋼珠和500 μL 提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]，-20 ℃低溫預冷2 min，經(jīng)研磨處理4 min，使用勻漿儀混勻，低溫超聲萃取30 min，重復2 次，置于-20 ℃下60 min，然后 4 ℃離心15 min (13 000 r·min-1)，取上清液150 μL (分裝管900 μL)。使用0.22 μm 的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到進樣小瓶，-80 ℃下保存。質(zhì)控樣本 (Quality control,QC) 由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC 的體積與樣本相同。

1.4 UHPLC-MS 分析條件

UHPLC 條件：樣品采用超高效液相色譜系統(tǒng)進行分離；柱溫25 ℃；流速0.5 mL·min-1；進樣量2 μL；流動相組成A：水+25 mmol·L-1乙酸銨+25 mmol·L-1氨水，B：乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，B 下降至65%；7～8 min，B 下降至40%；8～9 min，B 維持40%；9～9.1 min，B 上升至95%；9.1～12 min，B 維持95%。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續(xù)分析。樣本隊列中插入QC 樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)譜條件：分別采用電噴霧電離 (ESI) 正離子和負離子模式進行檢測。離子源溫度：600 ℃，噴霧電壓 (ISVF)±5 500 V (正負兩種模式)；其他參數(shù)正負離子模式下相同，毛細管溫度為320 ℃；輔助氣體加熱溫度420 ℃；鞘氣體流量40 arb；輔助氣體流量為20 arb；去簇電壓 (DP)：±60 V (正負兩種模式)，碰撞能量：(35±15) eV。

1.5 數(shù)據(jù)分析

生長性能數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差 ()”表示。采用ANOVA 過程進行單因子方差分析，顯著性水平為P＜0.05。

代謝組數(shù)據(jù)使用ProteoWizard 軟件，將二級質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉成mzXML 格式，再使用XCMS 進行峰對齊，做保留時間矯正和峰識面積提取等工作，同時使用自撰寫R 程序包和自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對峰進行物質(zhì)鑒定。采用R 軟件對鑒定的代謝產(chǎn)物進行主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析。根據(jù)變量重要性投影評分，將VIP＞1 且P＜0.05 的代謝物定義為差異代謝物 (Significant changed metabolites,SCMs)，將得到的差異代謝物通過代謝通路數(shù)據(jù)進行注釋解析，并通過富集分析法分析發(fā)酵飼料組與常規(guī)飼料組的變化，篩選關鍵代謝通路。

2 結果

2.1 不同飼料對克氏原螯蝦生長性能的影響

由表2 可知，采用兩種不同飼料飼喂克氏原螯蝦，養(yǎng)殖期第60 天結束時，兩組間克氏原螯蝦的體質(zhì)量增長率和特定生長率無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 不同飼料對克氏原螯蝦生長性能的影響Table 2 Effect of different feeds on growth performance of crayfish

2.2 代謝物總覽

本研究在正離子和負離子模式下分別篩選出581 和495 個化合物。通過與數(shù)據(jù)庫匹配，正離子和負離子模式下分別注釋到269 和273 個化合物(Human Metabolome Database,HMDB)。將所有的代謝化合物進行分類分析，被分為15 個一級類別，其中主要為有機酸及其衍生物，其次是脂質(zhì)和類脂分子，以及有機雜環(huán)化合物、核苷酸類等。

2.3 多元統(tǒng)計分析結果

2.3.1 主成分分析 (Principal components analysis,PCA) 結果

由PCA 分析圖 (圖1) 所示，每個散點表示一個樣本，樣本全部處于95%置信區(qū)間，對照組與實驗組的檢測結果說明代謝產(chǎn)物雖存在一定差異，可被區(qū)分，但也有部分相似；這可能是由于蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)產(chǎn)生的水解產(chǎn)物如肽類、氨基酸、脂肪酸等有一定程度的相似。

圖1 發(fā)酵飼料組和常規(guī)飼料組代謝物的 PCA 分析圖Fig.1 PCA plots of metabolites in fermented feed group and general feed group

2.3.2 正交偏最小二乘法判別分析 (OPLS-DA) 結果

OPLS-DA 模型分析結果見圖2 和圖3，可見兩組樣本明顯分離，表明兩組數(shù)據(jù)存在顯著性差異。正離子模式下模型R2Y=0.993、Q2=0.965，負離子模式下模型R2Y=0.991、Q2=0.927。隨著置換保留度逐漸降低，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明兩種模式下原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性良好。

圖2 發(fā)酵飼料組和常規(guī)飼料組代謝物的 OPLS-DA 分析圖Fig.2 OPLS-DA plots of metabolites in fermented diet group and general diet group

圖3 差異代謝物的OPLS-DA置換檢驗結果Fig.3 OPLS-DA model replacement test results of differential metabolites

2.3.3 差異代謝物火山圖

利用t檢驗和變異系數(shù)法比較兩組之間的代謝產(chǎn)物差異，設立篩選條件，對正、負離子模式下檢測到的所有代謝物 (含未被鑒定的代謝物) 進行差異分析，采用火山圖進行可視化展示 (圖4)，T 和CK 組在正離子和負離子模式下共篩選出差異表達代謝物分別為581 和495 個，其中正離子代謝產(chǎn)物上調(diào)314 個、下調(diào)267 個，負離子代謝產(chǎn)物上調(diào)258 個、下調(diào)237 個。

圖4 發(fā)酵飼料組對比常規(guī)飼料組的差異代謝物篩選Fig.4 Differential metabolite screening volcano maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)

2.3.4 差異代謝物中顯著差異代謝物篩選結果

根據(jù)差異代謝物做篩選，結果如表3 所示。在正離子和負離子模式下分別篩選出17 和10 種顯著差異代謝物。其中VIP 表示變量投影重要度；FC 表示差異倍數(shù)，F(xiàn)C＞1 表示該代謝物上調(diào)，F(xiàn)C＜1 表示該代謝物下調(diào)；m/z 表示質(zhì)荷比；顯著性分析P值越小，表示差異越顯著；RT 代表代謝物在色譜上的保留時間，即出峰時間(s)。

2.3.5 差異代謝物的層次聚類分析

圖5 為顯著差異代謝物 (VIP＞1,P＜0.05) 的層次聚類分析結果，橫軸表示發(fā)酵飼料組與常規(guī)組，縱軸表示相應的差異代謝物，紅色代表顯著性上調(diào)，藍色代表顯著性下調(diào)，顏色深淺表示上、下調(diào)的程度。由圖可見同組的樣本聚在同一簇內(nèi)，說明同組樣本之間的相似度高于組間。篩選出的27 種差異顯著的代謝物，發(fā)酵飼料組有19 種代謝物發(fā)生上調(diào)，8 種代謝物發(fā)生下調(diào)。正離子模式下發(fā)酵飼料組中腺苷酸基琥珀酸、鞘氨醇磷酰膽堿、巖藻糖基乳糖、磷酯酰膽堿等高表達，負離子模式下發(fā)酵飼料組中蘋果酸、補骨脂素、磷酯酰絲氨酸、谷氨酸等高表達。

圖5 發(fā)酵飼料組和常規(guī)飼料組 的層次聚類分析熱力圖Fig.5 Hierarchical cluster analysis heat maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)

2.3.6 差異代謝物的代謝通路分析

代謝通路分析的結果以氣泡圖展示 (圖6)。通過KEGG 注釋分析找到所有差異代謝物參與的通路，本實驗根據(jù)P值選擇顯著性最高的前20 條代謝通路，包含氨基酸生物合成、組氨酸代謝、碳酸氫鹽回收循環(huán)、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收、精氨酸合成、氨酰tRNA 的生物合成、精氨酸-脯氨酸代謝、氨基酸生物合成等。氣泡越大影響因子越大；顏色越深代表P值越小，富集程度越顯著。結果顯示組氨酸代謝通路、蛋白質(zhì)消化和吸收代謝通路、精氨酸-脯氨酸代謝通路、氨酰-tRNA 合成這4個差異代謝影響因子最大；精氨酸-脯氨酸代謝通路、蛋白質(zhì)消化和吸收代謝通路和氨酰-tRNA 合成通路的富集程度最顯著。

圖6 發(fā)酵飼料組對常規(guī)飼料組的通路分析氣泡圖Fig.6 Path analysis bubble chart of fermented diet group and general diet group

3 討論

本研究對來自不同日糧環(huán)境下的兩組克氏原螯蝦肌肉樣本的代謝組進行了比較分析，結果顯示兩組樣本在正離子和負離子模式下，其代謝物均有顯著性差異。代謝物主要包括有機酸、氨基酸、脂類和類脂及其衍生物等。顯著差異代謝物主要涉及精氨酸-脯氨酸、組氨酸代謝以及蛋白質(zhì)消化吸收等相關通路。

奎尼酸是一種氨基酸前體物質(zhì)，在生物體內(nèi)主要參與脂肪酸代謝過程，有助于維持身體的健康狀態(tài)，可以幫助將脂肪酸轉化為能量[21]。巖藻糖基乳糖是一種多糖類物質(zhì)，在生物體內(nèi)可以清除自由基、減輕氧化應激，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。亞麻木酚素具有促進血液循環(huán)增強機體免疫力的功能[22]。這幾種功能物質(zhì)通常以化合物的形式存在于植物體中，而本研究中，奎尼酸、巖藻糖基乳糖和亞麻木酚素在發(fā)酵飼料飼喂環(huán)境下在肌肉中的含量均提高了5 倍以上，表明克氏原螯蝦利用發(fā)酵飼料中的植物成分參與了這幾種物質(zhì)的生成和代謝。

本實驗中發(fā)酵飼料組增幅種類最多的是磷脂類(包括磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、鞘磷脂等)，此類物質(zhì)對大腦和血管各種功能起到重要的調(diào)節(jié)作用[23]，能影響生物細胞膜的流動性、通透性，并激活多種酶類的代謝和合成。磷脂酰絲氨酸由絲氨酸合成產(chǎn)生，可改善神經(jīng)細胞功能，是促神經(jīng)發(fā)育重要營養(yǎng)元素[24]。鞘磷脂對人類腸道和肝臟具有保護和修復的生理功能。此類物質(zhì)常見于大豆的副產(chǎn)物，而發(fā)酵飼料主要成分為豆粕，這類物質(zhì)的提高可以推斷克氏原螯蝦通過攝食豆類增加了此類物質(zhì)的合成。飼料的組成顯著影響了克氏原螯蝦的肌肉代謝，并使其更具營養(yǎng)[25]。這些肌肉代謝物的增加，說明可以利用投喂發(fā)酵飼料實現(xiàn)克氏原螯蝦肉中磷脂含量的增加[26]。

代謝物中還存在一些其他具有生理調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，例如補骨脂定和蘋果酸等。補骨脂定有抗氧化、調(diào)節(jié)細胞凋亡等作用[27]。可以治療動脈粥樣硬化、心臟病以及心肌損傷[28]。蘋果酸作為能量代謝中間體參與生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)，可以增加線粒體蘋果酸脫氫酶的活性，提高氨基酸的合成效率，機體ATP 的合成效率也可以得到提高[29]。這些物質(zhì)影響生物的活動能力，因此推斷其在肌肉中含量的升高有利于提升克氏原螯蝦的運動能力。

顯著差異代謝物中還有一部分氨基酸類物質(zhì)，發(fā)酵飼料組相對常規(guī)飼料組發(fā)生谷氨酸、精-谷氨酸、N-乙酰蛋氨酸組-絲氨酸和甲基甘氨酸等代謝物顯著上調(diào)。谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺在動物機體內(nèi)可相互轉化，并發(fā)揮重要作用[30]。有研究表明，日糧中添加谷氨酸可以幫助動物減輕腸道氧化損傷[31]，增強肌纖維強度[32]。精氨酸有抗脅迫能力，影響生物體的性腺發(fā)育速度與非特異性免疫調(diào)節(jié)的功能[33-34]。表明發(fā)酵飼料的豐富氨基酸組成，影響克氏原螯蝦新陳代謝和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉化。

經(jīng)KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，差異通路主要涉及氨基酸代謝和神經(jīng)傳導等方面，在組氨酸代謝、氨酰-tRNA 生物合成、精氨酸-脯氨酸代謝以及蛋白質(zhì)消化與吸收這幾條通路上差異最顯著。本研究中上調(diào)的谷氨酸和下調(diào)的組氨酸，被富集到氨酰-tRNA 生物合成代謝通路和組氨酸代謝上。氨酰-t R N A 合成，受特定的酶催化氨基酸與相應tRNA 氨?；鰪娚矬w遺傳信息翻譯準確性。谷氨酸可以由組氨酸代謝而來，并且是谷氨酰胺前體，可以在蛋白質(zhì)合成階段的后期以谷氨酰尾的形式修飾添加，對肌肉生成有促進作用[35]。表明在發(fā)酵飼料飼喂的環(huán)境下，克氏原螯蝦機體組織相應調(diào)整了谷氨酸代謝能力，促進了肌肉的氨?；磻约癆TP 的激活，提升運動能力。下調(diào)表達的組氨酸和精氨酸則被富集到精氨酸-脯氨酸代謝和蛋白質(zhì)消化與吸收通路中，表明在發(fā)酵飼料環(huán)境下，谷氨酸向精氨酸和脯氨酸的轉化受到抑制，克氏原螯蝦為適應不同的日糧環(huán)境可能相應地降低了部分蛋白質(zhì)的翻譯。

4 結論

本研究通過代謝組學結合LC-MS 的方法，研究了兩種日糧模式下克氏原螯蝦肌肉代謝產(chǎn)物的變化。結果表明，投喂發(fā)酵飼料一方面促進了克氏原螯蝦肌肉中多種生理功能物質(zhì)的合成，推測克氏原螯蝦通過攝食獲得運動能力和增強免疫；另一方面促進了肌肉中多種磷脂類物質(zhì)的合成，提升了克氏原螯蝦的食用價值。對差異代謝產(chǎn)物進行了KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料顯著影響了組氨酸代謝、精氨酸-脯氨酸、蛋白質(zhì)消化吸收和氨酰-tRNA 合成這幾條代謝通路。表明日糧能顯著影響克氏原螯蝦機體氨基酸代謝，推測發(fā)酵飼料在促進克氏原螯蝦肌肉中特定蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)代謝和輔助合成氨酰-tRNA 酶類等方面發(fā)揮積極作用。