復方中草藥對中華鱉腸道微生物菌群及非特異性免疫功能的影響

包宇航，章新宇，尹尚軍，張海琪，徐潔皓

1.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315000

2.浙江省淡水研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 湖州 313000

中華鱉 (Pelodiscussinensis) 是我國重要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟品種之一，進行規(guī)模化養(yǎng)殖時，因養(yǎng)殖密度過大、管理不當或養(yǎng)殖水質(zhì)不佳等因素，會導致各類病害頻發(fā)。針對細菌性疾病，目前主要依賴抗生素等化學藥物進行治療，而抗生素濫用可能會導致耐藥性危機和食品質(zhì)量安全問題[1-2]。因此，世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization,WHO) 和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織 (Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO) 提倡在水產(chǎn)養(yǎng)殖中預防性地使用天然免疫刺激劑以增強水產(chǎn)動物的免疫能力，進一步預防和控制水產(chǎn)動物疾病，同時避免對動物、人類健康及生態(tài)環(huán)境造成不良影響[3-4]。

中草藥是一種天然免疫刺激劑，能作為飼料添加劑提高養(yǎng)殖動物的生長性能和免疫力，具有一定的疾病預防作用，有望成為抗生素類藥物的替代品[5-7]。Yang 等[8]在基礎飼糧中添加不同水平的黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高中華鱉的體質(zhì)量增長率、生長率和成活率。復方中草藥制劑由2 種及2 種以上的草藥按一定比例混合而成，可產(chǎn)生協(xié)同、相加或拮抗3 種不同的作用效果[9]。與單一草藥相比，合理配比的復方中草藥制劑可提高養(yǎng)殖動物的抗菌能力、飼料利用率和生產(chǎn)性能[10-11]。如飼料中添加金銀花 (Lonicerajaponicathunb)、人參(Panaxginseng) 和山楂 (Crataeguspinnatifidabunge)可有效提高牙鲆 (Paralichthysolivaceus) 的生長率和飼料轉(zhuǎn)化效率[12]；添加黃芪 (Astragaliradix)、黨參(Codonopsisradix)、菊花 (Floschrysanthemi Indici) 等可顯著促進黃顙魚 (Pelteobagrusfulvidraco)的生長[13]。Takaoba 等[14]采用神曲 (Massamedicata)、山楂、青蒿 (Artemisiacaruifoliabuch)、鐵皮石斛 (Dendrobiumofficinalekimura) 及其復方劑飼喂真鯛 (Pagrusmajor) 幼魚，發(fā)現(xiàn)可促進其生長，并提高其對鰻弧菌 (Vibrioanguillarum) 的抵抗力。

中華鱉作為卵生脊椎動物，具有較為完善的免疫系統(tǒng)，可通過非特異性或特異性免疫有效抵御病原體入侵[15-16]。溶菌酶 (LZM)、酸性磷酸酶 (ACP)是非特異性免疫相關的重要酶類，且溶菌酶能直接殺死細菌或消化病原體[17]。堿性磷酸酶 (AKP) 是水產(chǎn)動物免疫防御中重要的水解酶，研究顯示其參與文昌魚 (Branchiostomatsingtauense) 的抗菌免疫反應[18]。腸道不僅是消化器官，其黏膜免疫系統(tǒng)參與構成機體免疫的第一道防線[19]。本研究通過在基礎飼料中添加2% (質(zhì)量分數(shù))的復方中草藥制劑飼喂中華鱉，測定其血清中非特異性免疫酶活性，同時利用16S rDNA 高通量測序研究該復方制劑對中華鱉腸道菌群的影響，探究中草藥有效成分是否通過優(yōu)化中華鱉腸道菌群、提高益生菌豐度等影響機體免疫力，以為中華鱉的病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用中華鱉購自浙江湖州某養(yǎng)殖場，3 月齡健康中華鱉100 只，平均體質(zhì)量為 (44.59±9.23) g。根據(jù)本實驗室前期的研究結(jié)果，采用處理成粉狀的黃芪 10 g、魚腥草 (Houttuyniacordatathunb) 10 g、五倍子 (Rhuschinensismill) 10 g、金銀花 10 g、白頭翁 (Pulsatillachinensisregel) 10 g、石榴皮 (PunicagranatumL) 10 g、黃連 (Coptidisrhizoma) 5 g、山楂 15 g、艾葉 (Artemisiaargyilevl) 10 g、羊棲菜多糖10 g 混合后置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?，作為復方飼料添加劑。實驗用基礎飼料配方 (質(zhì)量分數(shù))：優(yōu)質(zhì)白魚粉20%、α-淀粉25%、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 2%、發(fā)酵豆粕30%、谷朊粉20%、酶制劑0.4%、氯化膽堿0.2%、磷酸二氫鈣0.8%、維生素類1%、礦物元素類0.6%，其營養(yǎng)組成 (質(zhì)量分數(shù)) 為粗蛋白48%、水分10%、粗脂肪3%、粗纖維1.5%、粗灰分17%、總磷3%、賴氨酸2%。

1.2 實驗分組與處理

選取健康中華鱉100 只，隨機分為10 組，1—5 組為對照組 ，6—10 組為實驗組，每組10 只，為防止個體之間打架斗毆致死，每組體質(zhì)量差異在10 g 以內(nèi)。本次養(yǎng)殖采用恒溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，實驗用水為曝氣后的自來水，pH 7.3，亞硝酸鹽(NO2-N) 質(zhì)量濃度為0.005 mg·L-1，氨氮(NH+4-N) 質(zhì)量濃度為0.01 mg·L-1，水溫維持在(28±2) ℃。其中，對照組投喂配合飼料粉，實驗組使用復方中草藥拌飼投喂，每1 kg 配合飼料粉添加復方中草藥制劑20 g，定時定點投喂，每天2 次，連續(xù)投喂42 d 后進行腸道菌群和非特異免疫酶活性測定。

1.3 樣品采集

1.3.1 腸道內(nèi)容物采集

中華鱉喂養(yǎng)42 d，停飼24 h 后，從對照組和實驗組隨機各取10 只中華鱉，麻醉，頸動脈放血后將鱉體解剖并剝離出腸道，剪取小腸后段至直腸組織，取出內(nèi)容物至無菌離心管中，對照組記為CG1—CG10，實驗組記為CPG1—CPG10，樣品送至杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司進行16S rDNA高通量測序。

1.3.2 血清采集

中華鱉喂養(yǎng)42 d，停飼24 h 后，在對照組和實驗組隨機各取24 只，以未處理中華鱉為0 h，其余鱉腹腔注射107CFU·mL-1嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila) 1 mL，在攻毒后的第12、第24 和第72 小時以頸動脈采血法取血，每個時間點取6 只。收集血液至2 mL離心管內(nèi)，8 000 r·min-1離心1 min，分離血清和血細胞，取上層血清。嗜水氣單胞菌攻毒后的對照組命名為CG0h、CG12h、CG24h、CG72h，實驗組命名為CPG0h、CPG12h、CPG24h、CPG72h。

1.4 腸道微生物高通量測序分析

使用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 提取試劑盒(Omega Bio-Tek) 提取腸道內(nèi)容物DNA，實驗操作參照試劑盒說明書。以引物5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' PCR 擴增樣品中細菌16S rDNA V3—V4 區(qū)序列，利用AMPure XT beads 回收試劑盒 [貝克曼庫爾特國際貿(mào)易 (上海) 有限公司] 回收擴增產(chǎn)物。使用Illumina 的文庫定量試劑盒 (Illumina 公司) 對PCR 產(chǎn)物進行定量測量，并在每個文庫中添加正確比例的Adaptor 和Index 序列。合格的文庫濃度應在2 nmol·L-1以上，將合格文庫進行梯度稀釋，使用NaOH 變性為單鏈后，將文庫放入測序儀中進行2×250 bp 的雙端測序。選擇NovaSeq 6000 測序儀對文庫進行測序分析。

根據(jù)barcode 信息對樣品進行數(shù)據(jù)拆分，去除RawData 的引物序列和平衡堿基序列后將每一對paired-end reads 根據(jù)overlap 區(qū)拼接合并成一條更長的tag。對測序reads 進行窗口法質(zhì)量掃描，將read 從窗口起始到3' 終止的部分截掉 (平均質(zhì)量值低于20 時)，去除截短后長度小于100 bp 的序列、截短后N (不確定模糊堿基) 的含量在5%以上的序列和嵌合體序列。將所得數(shù)據(jù)通過DADA2 進行長度過濾和去噪，獲得ASV (feature) 特征序列和ASV (feature) 豐度表格再進行Alpha 多樣性分析。使用SILVA 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計各樣本中各物種的豐度，并采用Fisher's exact test 和 Mann-Whitney U test 對各組之間進行差異分析。

LDA Effect Size (LEfSe) 分析利用Kruskal-Wallis 秩和檢驗檢測樣本所含特征物種，通過檢測不同組間的物種豐度差異，獲得顯著性差異物種。再利用Wilcoxon 秩和檢驗檢測所獲得的顯著性差異物種的所有亞種是否處于同一分類級別，并使用線性判別分析 (Linear discriminant analysis,LDA) 得到最終的差異物種。通過PICRUSt2 軟件標記基因序列并預測菌群功能豐度，再利用STAMP 進行差異分析。

1.5 非特異性免疫酶活性檢測

根據(jù)各試劑盒說明書，使用酶標儀對采集的血清樣品進行總超氧化物歧化酶 (T-SOD)、LZM、ACP 和AKP 活性測定 (試劑盒均購于南京建成生物工程研究所)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行單因子方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.001 為差異極其顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為無顯著性差異。結(jié)果以 “平均值±標準誤()”表示。

2 結(jié)果

2.1 復方中草藥對中華鱉腸道菌群的影響

2.1.1 菌群Alpha 多樣性分析

中華鱉腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)如圖1 所示，Shannon 指數(shù)反映物種的相似性，結(jié)果顯示兩組樣品間的物種多樣性無顯著性差異 (P＞0.05)。Chao1 指數(shù)反映物種的豐富度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組特征數(shù)據(jù)的豐富程度顯著高于對照組 (P＜0.05)。

圖1 Alpha 多樣性指數(shù) box 圖注：對照組投喂基礎飼料；實驗組投喂添加2%的復方中草藥的飼糧。后圖同此。Fig.1 Alpha diversity index box chartNote: CG.Feeding basal diet; CPG.Feeding diet with 2% of Chinese herbal compound.The same case in following figures.

2.1.2 樣品菌群門、屬水平結(jié)構組成差異分析

中華鱉腸道菌群門水平組成如圖2 所示。對照組和實驗組的優(yōu)勢菌門相同，均為變形菌門 、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和軟壁菌門等。然而，對照組和實驗組中每個優(yōu)勢門的占比存在差異。與對照組相比，實驗組的變形菌門、軟壁菌門和浮霉菌門相對豐度明顯升高。對照組，變形菌門占48.89%，而實驗組占比為72.98%。此外，實驗組軟壁菌門和浮霉菌門占比分別是對照組的32 和2.25 倍。實驗組的藍藻門和梭桿菌門菌群相對豐度占比降低，分別為對照組的26.47% 和22.17%。

圖2 對照組和實驗組腸道菌群組成豐度差異 (門水平)Fig.2 Relative abundance of intestinal microflora composition of CG and CPG at genus level

中華鱉腸道菌群屬水平組成如圖3 所示，對照組和實驗組排名前8 的優(yōu)勢菌屬均為伯克霍爾德菌屬 (Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderi)、Romboutsia、螺桿菌屬 (Helicobacter)、梭菌屬(Clostridium)、Epulopiscium、檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter)、戴爾福特菌屬 (Delftia) 和乳桿菌屬(Lactobacillus)。與對照組相比，實驗組Epulopiscium、檸檬酸桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度升高，占比分別是對照組的4.66、55.9 和4.12 倍；而Romboutsia相對豐度在實驗組占比降低，為對照組的12.67%。

2.1.3 樣品菌群指示物種分析

利用LEFse 分析對照組和實驗組菌群差異，獲得兩組主要的特異性菌群，作為各樣品的指示種，分析結(jié)果如圖4 所示。實驗組的特異菌群為變形菌門的根瘤菌科、鞘脂單胞菌科、鞘脂單胞菌目及檸檬酸桿菌屬等菌群，對照組的特異菌群為Variovorax菌群。

圖4 對照組和實驗組腸道菌群 LEfSe 差異分析圖注：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種跟隨組進行著色，紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群；圓圈大小與微生物相對豐度成正比例關系。Fig.4 LEfSe variance analysis of intestinal microflora of CG and CPGNote: Species without significant differences are uniformly colored in yellow,and differential species are colored following the group; red nodes represent microbial taxa that play an important role in the red group,and green nodes represent microbial taxa that play an important role in the green group; the size of the circle is proportional to the relative abundance of microorganisms.

2.1.4 樣品菌群功能預測

通過PICRUSt2 預測實驗組和對照組腸道菌群的可能功能 (圖5)，與對照組相比，實驗組的脂代謝、氨基酸合成、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)的合成、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等功能顯著強于對照組，具體體現(xiàn)在纈氨酸降解、磷脂酰甘油生物合成、鳥苷酸和腺苷酸合成、β-丙氨酸合成、生物素合成、L-賴氨酸合成等途徑。

圖5 對照組和實驗組腸道菌群功能預測 STAMP 差異分析注：左圖所示為不同微生物功能預測在兩組樣本中的豐度比例，右圖為95%置信度區(qū)間內(nèi)微生物功能預測豐度的差異比例；左邊縱坐標軸為不同的微生物功能預測分類。Fig.5 STAMP variance analysis of functional prediction of intestinal microflora of CG and CPGNote: The left panel shows the proportion of abundance of different microbial functional predictions in the two groups of samples,and the right panel shows the proportion of differences in the abundance of microbial functional predictions within the 95% confidence interval;the left vertical axis shows different microbial functional prediction classifications.

2.2 復方中草藥對中華鱉免疫酶指標的影響

中華鱉血清免疫酶活性測定結(jié)果顯示，實驗組中華鱉血清中T-SOD、LZM、ACP 及AKP 4 種酶的初始活性均顯著高于對照組 (圖6)。嗜水氣單胞菌刺激后，實驗組和對照組的T-SOD、LZM、ACP 3 種酶的活性均呈上升趨勢：實驗組的T-SOD、ACP 活性在第12、第24 小時顯著高于對照組(P＜0.05)，LZM 活性在第24 小時顯著高于對照組(P＜0.05)，但兩組酶活性在第72 小時無顯著性差異。刺激后血清中AKP 的酶活性先下降后升高，實驗組AKP 活性在第12、第24 小時顯著高于對照組 (P＜0.05)，而兩組在第72 小時無顯著性差異。

圖6 復方中草藥對嗜水氣單胞菌刺激前后中華鱉血清中總超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的影響注：誤差線用標準誤值 (n=6) 表示；*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001，ns 表示無顯著性差異。Fig.6 Effect of Chinese herbal compound on T-SOD,LZM,ACP and AKP activity in serum of P.sinensis before and after A.hydrophila challengeNote: The error bar is expressed by the SEM value (n=6); *.P＜0.05,**.P＜0.01,***.P＜0.001; ns.No significant differences.

3 討論

水生生物的腸道菌群與個體健康、免疫屏障、抵御感染能力等息息相關[20]。腸道菌群的多樣性可作為評估腸道健康的指標[21]。本文通過Shannon 指數(shù)來評估對照組和實驗組中華鱉腸道菌群的多樣性，結(jié)果顯示兩組腸道菌群類別具有一定的共性，均以變形菌門和厚壁菌門為主，與其他水生生物腸道菌群的組成相似[22]。據(jù)報道，變形菌門可能有助于刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持機體正常的免疫功能[23]，而厚壁菌門參與腸道黏膜功能的維持和腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)[24]，因此推測它們可能在維持中華鱉的腸道菌群穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。通過Chao1 指數(shù)評估了兩組中華鱉腸道菌群的豐富度，結(jié)果表明飼喂復方中草藥可使中華鱉腸道優(yōu)勢菌門占比發(fā)生變化。實驗組中華鱉腸道中軟壁菌門、浮霉菌門豐度均高于對照組，即復方中草藥對這些菌群的增長具有促進作用。研究表明，軟壁菌門和浮霉菌門等有益菌群可以促進機體先天免疫相關的代謝功能，且浮霉菌能產(chǎn)生一些抗菌化合物從而維持機體免疫功能[25-26]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組中華鱉先天性免疫酶活性高于對照組，推測其可能與腸道中軟壁菌和浮霉菌的存在和豐度相關。

從屬水平對腸道菌群進一步分析，發(fā)現(xiàn)添加復方中草藥能促進中華鱉腸道中梭菌屬、乳酸菌屬等益生菌的菌群豐度。梭菌屬是魚類腸道常見菌屬，其可分解利用纖維素、單糖和木聚糖等糖類為宿主提供營養(yǎng)[27-28]。從人類糞便樣本中分離的梭菌能夠在結(jié)腸中積累調(diào)節(jié)性T 細胞 (Regulatory T cells) ，可影響中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)作用于免疫細胞的信號，從而抑制腸道炎癥反應，是腸道中的正向菌群[29]。本研究中實驗組梭菌屬豐度是對照組的1.62 倍，表明中草藥添加劑可以促進梭菌屬的定殖，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構。乳酸菌也是水產(chǎn)養(yǎng)殖常見的益生菌之一，具有較強的黏附能力，便于長期定殖于腸道，通過增強腸道免疫屏障提高免疫能力，促進機體生長[30-31]，其功能已在尼羅羅非魚 (Oreochromisniloticus)、鯉 (Cyprinuscarpio)、凡納濱對蝦 (Penaeusvannamei) 等水生動物中得到驗證[32-34]。乳酸菌屬的乳球菌和乳桿菌可通過口服在舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax) 的腸道內(nèi)定殖，其產(chǎn)生的乳酸菌素可作用于弧菌的細胞膜，導致膜內(nèi)物質(zhì)和能量泄露，從而達到抑菌效果[35-36]。鯉飼糧中添加復方中草藥 (黃芪、魚腥草、板藍根、茯苓) 后，腸道中乳酸菌的含量有所增加[37]，這與本研究結(jié)果吻合。衣原體常以上皮囊腫形式引起呼吸系統(tǒng)感染，是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的病原體之一[38]。本研究顯示，實驗組中衣原體在屬水平的豐度占比降至對照組的2.16%，推測復方中草藥的添加能夠降低有害菌的菌群豐度，但其作用機理需通過實驗進一步挖掘。

腸道菌群及其代謝物通過改善宿主內(nèi)分泌功能以維持機體生理穩(wěn)態(tài)[39]。通過對測序結(jié)果分析可知，中華鱉腸道微生物主要參與類固醇激素合成、脂肪酸代謝和賴氨酸合成等代謝途徑。對照組和實驗組腸道菌群的功能預測分析結(jié)果顯示，實驗組在代謝能力方面表現(xiàn)更突出。據(jù)報道，氨基酸代謝、脂肪酸代謝、碳水化合物代謝等功能與氧化應激緊密相關[40]，從鉤吻 (Gelsemiumelegans) 中提取的生物堿能夠提高武昌魚 (Megalobramaamblycephala) 腸道菌群的酶活性，提高其代謝效率[41]，這與本研究結(jié)果一致。此外，實驗組腸道菌群在氨基酸合成、蛋白質(zhì)合成、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等方面也表現(xiàn)出更強的功能。

T-SOD、LZM、ACP 和AKP 是常用于評估水產(chǎn)動物非特異性免疫能力的指標酶。丁鑒鋒等[42]、Yin 等[43]、Taee 等[44]、Shaluei 等[45]分別以這4 種酶為指標研究了不同配方或比例中草藥添加對仿刺參 (Apostichopusjaponicus) 幼參、斑節(jié)對蝦(P.monodon)、虹鱒 (Oncorhynchusmykiss) 等水生動物先天性免疫能力的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌攻毒激活中華鱉的非特異性免疫，對照組和實驗組4 種酶的活性均在第72 小時達到峰值。在正常狀態(tài)下及刺激后，實驗組血清中的T-SOD、LZM、ACP 及AKP 的活性在第0、第12、第24 小時均顯著高于對照組，實驗組LZM 的活力在第0 和第24 小時高于對照組，但在第12 小時無顯著性差異，推測該復方中草藥飼喂后能夠提高中華鱉的先天性免疫功能。草藥中的酚類化合物是一種重要的天然抗氧化劑，可通過上調(diào)超氧化物歧化酶 (SOD)等內(nèi)源性抗氧化酶活性來維持機體內(nèi)的氧化還原平衡，防止自由基堆積和氧化損傷[46-47]；黃酮類、多糖類化合物可通過調(diào)節(jié)TLRs 信號通路或激活巨噬細胞調(diào)控非特異性免疫相關酶的活性[48-49]。劉紅柏等[37]將黃芩、茯苓、板藍根等制成復方中草藥制劑，與基礎飼料混合投喂后可增強鯉的先天性免疫能力，與本研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

本研究在飼料中添加復方中草藥后，對中華鱉腸道菌群及非特異性免疫功能進行分析，結(jié)果表明復方中草藥可以影響腸道菌群的構成與群落特征，通過提高益生菌菌群豐度以優(yōu)化腸道菌群結(jié)構，從而提高機體的免疫能力，故本復方中草藥具有一定的應用前景。