廣西某豬場(chǎng)豬偽狂犬病病毒的分離鑒定

莫紅芳,何東賢,熊曉妍,覃振斌,石德順,石宗承*

(1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué),廣西南寧 530007;2.廣西大學(xué),廣西南寧 530004;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱 150069)

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多種家畜、野生動(dòng)物感染的一種以發(fā)熱、奇癢(豬除外)和腦脊髓炎為主要特征的急性、高度致死性傳染病[1],我國將其列為二類動(dòng)物傳染病[2]。PRV屬于皰疹病毒科,宿主范圍廣泛,可以感染并導(dǎo)致多種哺乳動(dòng)物發(fā)病[3]。豬(包括家豬和野豬)是感染PRV后可以存活的唯一物種,成為該病毒的貯存宿主和傳染源[4]。不同年齡階段的豬感染PRV表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。新生仔豬易出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、嘔吐、腹瀉、生長不良甚至急性死亡,病死率高;架子豬和大豬感染后表現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道癥狀,但多能耐過,呈隱性感染并終生帶毒、排毒;母豬和種公豬感染易引發(fā)繁殖障礙,導(dǎo)致母豬配種返情率上升,妊娠母豬流產(chǎn),產(chǎn)木乃伊胎、死胎和病弱仔等[5]?；疾∝i可持續(xù)不斷地向外界排毒,被PRV污染的器械和工具也是重要的傳播媒介[5]。由于PRV能侵入仔豬的免疫系統(tǒng)引起免疫抑制,導(dǎo)致仔豬免疫力降低,易引發(fā)多種病毒、細(xì)菌的繼發(fā)感染,給養(yǎng)豬企業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,成為各國檢疫和防疫的重點(diǎn)對(duì)象[6]。

豬偽狂犬病呈世界性流行,我國是PR高發(fā)、頻發(fā)地區(qū)[3],PRV gE基因缺失疫苗(如Bartha株)有效控制了該病在我國的流行。但自2011年以來,出現(xiàn)了高致病性的PRV變異株,傳統(tǒng)疫苗失去了防護(hù)作用,導(dǎo)致多地區(qū)的豬場(chǎng)陸續(xù)爆發(fā)了不同規(guī)模的豬偽狂犬病疫情[7]。研究發(fā)現(xiàn),PRV變異株的病原特征與PRV傳統(tǒng)株相同,但其某些基因(gB、gE和gD等)與PRV傳統(tǒng)株對(duì)應(yīng)的基因序列有很大差別[7]。此外,近幾年開始陸續(xù)出現(xiàn)PRV感染人的案例報(bào)道,感染者發(fā)生急性腦炎和眼內(nèi)炎,并伴隨嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]。本研究從廣西貴港某豬場(chǎng)病死仔豬的腦組織和扁桃體中分離到一株P(guān)RV,進(jìn)行了組織半數(shù)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)測(cè)定和動(dòng)物回歸試驗(yàn),以期為今后廣西地區(qū)豬偽狂犬病的流行病學(xué)調(diào)查及臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、細(xì)胞株和試驗(yàn)動(dòng)物 廣西貴港某疑似發(fā)生豬偽狂犬病豬場(chǎng)的15日齡病死仔豬2頭,無菌采集其腦組織、扁桃體共4份病料;PK-15細(xì)胞株由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;6周齡昆明小鼠,購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 2×rTaqMix、LATaq酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Super Red核酸染料,美國BIOTIUM公司產(chǎn)品;新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;雙抗(青鏈霉素溶液)、0.25% EDTA胰酶溶液、PBS緩沖液,美國GenView公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基,美國GIBCO公司產(chǎn)品;瓊脂糖,武漢擎科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5415R),德國艾本德公司產(chǎn)品;PCR儀(AB Veriti,Bio-Rad C1 000),美國伯樂公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C型),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO MCO-18AIC),美國賽默飛公司產(chǎn)品;倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX31),日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 參照曾智勇[1]等報(bào)道的方法進(jìn)行病料處理。將采集的4份病料分別置于組織研磨器內(nèi)研磨至糊狀,加入含1%雙抗的無血清DMEM制成10%組織懸液。經(jīng)反復(fù)凍融3次后,4℃ 12 000 r/min條件下離心20 min,棄沉淀取上清,0.22 μm濾器過濾,樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物合成 參考GenBank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)(登錄號(hào):MZ219272.1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)(登錄號(hào):AY556475.1)、豬細(xì)小病毒(PPV)(登錄號(hào):JQ710897.1)、豬偽狂犬病病毒(PRV)(登錄號(hào):AY217094)、豬瘟病毒(CSFV)(登錄號(hào):AF531433.1)的基因序列,利用DNAMan軟件分析保守序列設(shè)計(jì)并合成引物,引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The primer information

1.2.3 PCR檢測(cè) 參照吳旭錦[8]等報(bào)道的方法提取樣品總DNA與總RNA,利用PCV2、PPV、PRV引物分別對(duì)樣品總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè);將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用PRRSV、CSFV引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL,使用DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000和8 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)照?qǐng)D記錄結(jié)果,產(chǎn)物送生工生物(南寧)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 病毒分離 將樣品濾液接種于單層PK-15細(xì)胞中培養(yǎng),37 ℃孵育1 h后傾去,用PBS洗滌1次,加細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。培養(yǎng)6 h后開始觀察,待出現(xiàn)80%左右細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)時(shí)收獲,傳代3次直至CPE出現(xiàn)時(shí)間穩(wěn)定為止。選取每一代病毒液,經(jīng)PCR鑒定為PRV核酸陽性方可繼續(xù)下一步試驗(yàn)。

1.2.5 病毒TCID50測(cè)定 參照張建遠(yuǎn)[4]等報(bào)道的方法進(jìn)行病毒組織半數(shù)感染量(TCID50)的測(cè)定。提前4 h將PK-15細(xì)胞懸液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,使細(xì)胞量達(dá)2～3×105個(gè)/mL。將培養(yǎng)的F4代PRV病毒液用無血清DMEM作連續(xù)10倍倍比稀釋(10-1～10-8),棄掉原細(xì)胞生長液,將病毒液按100 μL/孔的劑量接種到單層細(xì)胞中,每個(gè)稀釋度接種8孔,同時(shí)在培養(yǎng)板最后2列加100 μL細(xì)胞維持液作細(xì)胞對(duì)照。逐日觀察細(xì)胞病變情況并記錄結(jié)果,根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒的組織半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 參照張建遠(yuǎn)[4]等報(bào)道的方法進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)。將培養(yǎng)的F4代PRV病毒液用無血清DMEM作連續(xù)10倍倍比稀釋(10-1～10-6),每個(gè)稀釋度按100 μL/只的劑量腳掌接種6只昆明小鼠,同時(shí)設(shè)置接種等劑量DMEM的陰性對(duì)照組。逐日觀察小鼠的發(fā)病癥狀和死亡情況,連續(xù)觀察1周,根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒的半數(shù)致死量(50% lethal dose,LD50)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病豬場(chǎng)背景

2.1.1 臨床癥狀 廣西貴港某豬場(chǎng)存欄母豬800多頭,主要是頭胎母豬。自上個(gè)月免疫口蹄疫疫苗后,豬群開始出現(xiàn)發(fā)燒、3～4 d不吃料等癥狀;緊接著懷孕母豬流產(chǎn)(妊娠期多為30～60 d),仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀并發(fā)生死亡(多為15～21日齡);隨后豬場(chǎng)飼養(yǎng)的3只犬也突然失蹤和死亡(圖1)。

A.懷孕母豬流產(chǎn); B.仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀; C.感染仔豬死亡; D.感染犬死亡A.Abortion of pregnant sow; B.Nervous symptoms of piglet; C.Death of infected piglet; D.Death of infected dog圖1 疑似感染PRV動(dòng)物的臨床癥狀Fig.1 The clinical symptoms of animals suspected of PRV infection

2.1.2 病理剖檢 對(duì)疑似患豬偽狂犬病死亡的仔豬進(jìn)行剖檢,眼觀可見明顯的扁桃體壞死、化膿,頜下淋巴結(jié)腫大、出血,肝臟有散在米粒樣黃白色壞死點(diǎn),肺臟水腫、有片狀出血,腎臟有針尖狀出血點(diǎn),呈典型“麻雀蛋”樣腎。死前有神經(jīng)癥狀的感染仔豬腦漿膜充血、出血,腦脊髓液增多(圖2)。

A.扁桃體壞死、化膿; B.頜下淋巴結(jié)腫大、出血; C.肝臟有散在米粒樣黃白色壞死點(diǎn); D.肺臟水腫、有片狀出血; E.腎臟有針尖狀出血點(diǎn); F.腦漿膜充血、出血,腦脊髓液增多A.Tonsillar necrosis and suppuration; B.Submaxillary lymph node enlargement and hemorrhage; C.Scattered rice like yellow white necrosis spots in the liver; D.Pulmonary edema,patchy bleeding; E.Needle like bleeding spots in the kidney; F.Cerebral plasma membrane congestion and hemorrhage,increased cerebrospinal fluid圖2 疑似感染PRV仔豬的病理變化Fig.2 The pathological lesions of piglets suspected to be infected with PRV

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

針對(duì)PRRSV、PCV2、PPV、PRV和CSFV基因的保守序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物,對(duì)樣品進(jìn)行PCR(RT-PCR)檢測(cè)。結(jié)果顯示,PRRSV、PCV2、PPV和CSFV核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性,PRV核酸檢測(cè)孔(13～16泳道)出現(xiàn)目的條帶,條帶大小約為217 bp(圖3),與預(yù)期大小一致。將13～16泳道對(duì)應(yīng)的樣品送生工生物(南寧)公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示4個(gè)樣品均為PRV的基因序列,且為當(dāng)前廣西地區(qū)流行的PRV變異毒株。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～4.PRRSV; 5～8.PCV2; 9～12.PPV; 13～16.PRV; 17～20.CSFVM.DNA Marker DL 2 000; 1-4.PRRSV; 5-8.PCV2; 9-12.PPV; 13-16.PRV; 17-20.CSFV圖3 組織病料PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The PCR detection result of diseased materials

2.3 病毒分離結(jié)果

將1份PCR檢測(cè)為PRV核酸陽性的腦組織病料制成10%組織懸液的濾液接種單層PK-15細(xì)胞并培養(yǎng),24 h時(shí)可見部分細(xì)胞開始固縮,邊緣輪廓變清晰,42 h后細(xì)胞形態(tài)變圓、聚集、脫落,融合成小合胞體,形成折光性很強(qiáng)的小病灶,而不接種PRV病毒液的PK-15細(xì)胞無任何細(xì)胞病變(圖4)。

A.病料感染的PK-15細(xì)胞; B.正常PK-15細(xì)胞A.PK-15 cells infected with diseased materials; B.Normal PK-15 cells圖4 組織病料感染PK-15細(xì)胞42 h出現(xiàn)的細(xì)胞病變Fig.4 The cytopathy caused by infection of PK-15 cells with diseased materials for 42 hours

2.4 病毒TCID50測(cè)定結(jié)果

將培養(yǎng)的F4代PRV病毒液作連續(xù)10倍倍比稀釋(10-1～10-8),接種單層PK-15細(xì)胞,根據(jù)3 d后觀察到的細(xì)胞病變(CPE)情況(表2),采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒的組織半數(shù)感染量(TCID50)為1×10-7.66/100 μL。

表2 F4代PRV分離株TCID50測(cè)定結(jié)果Table 2 The TCID50 determination results of F4 PRV isolate

2.5 病毒LD50測(cè)定結(jié)果

將培養(yǎng)的F4代PRV病毒液進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋(10-1～10-6),腳掌注射接種昆明小鼠,第3天小鼠表現(xiàn)奇癢癥狀,不斷啃咬注射部位,皮膚出血、毛發(fā)蓬亂和脫落,第4天開始出現(xiàn)死亡,注射相同劑量DMEM培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組小鼠無任何異常表現(xiàn)。記錄昆明小鼠死亡的數(shù)量(表3),根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒的半數(shù)致死量(LD50)為1×10-4.85/100 μL。

表3 F4代PRV分離株LD50測(cè)定結(jié)果Table 3 The LD50 determination results of F4 PRV isolate

3 討論

豬偽狂犬病病毒是皰疹病毒科成員,呈近圓形,外殼包被有囊膜,病毒顆粒及核衣殼大小為150～180 nm,包涵體呈晶格狀排列[1],其感染范圍廣泛、致病性較強(qiáng),自然條件下可使多種家畜和野生動(dòng)物感染發(fā)病。我國豬群普遍存在PRV野毒感染,并呈散發(fā)性流行[9],給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。PRV Bartha k61弱毒疫苗在規(guī)?；i場(chǎng)的廣泛應(yīng)用,使豬偽狂犬病得到了較好控制[4]。但隨著2012年以來PRV在全國范圍再次廣泛流行,相關(guān)研究也證實(shí)了PRV變異毒株的出現(xiàn)[10]。廣西地區(qū)流行的PRV毒株為我國主要流行的變異株,與國內(nèi)近期分離的毒株同源性較高[11]。

對(duì)于新出現(xiàn)的PRV變異毒株的侵襲,傳統(tǒng)的疫苗已不能提供完全的保護(hù)[12],現(xiàn)今主要通過接種基因缺失疫苗來進(jìn)行防控[13]。美國等發(fā)達(dá)國家利用gE基因缺失疫苗及其配套的診斷方法對(duì)其進(jìn)行控制和根除,但豬偽狂犬病仍在許多國家屢見不鮮[4]。目前,分子流行病學(xué)調(diào)查常用對(duì)PRV全基因組或某個(gè)特定區(qū)域核苷酸(如gE基因)進(jìn)行測(cè)序和變異分析,繪制遺傳進(jìn)化樹來追溯其起源[11]。張文通等[14]合成了1對(duì)gE基因的引物,擴(kuò)增出PRV gE基因核酸片段,表明發(fā)病豬場(chǎng)存在PRV野毒株。趙鴻遠(yuǎn)等[15]通過對(duì)PRV變異株gE基因序列分析,均發(fā)現(xiàn)在其第48和第492位點(diǎn)存在1個(gè)天冬氨酸插入的分子特征。劉芳等[16]對(duì)廣西5株P(guān)RV gE序列分析,得出了廣西PRV流行毒株與當(dāng)前我國主要流行的病毒株遺傳關(guān)系較近的結(jié)論。本研究采樣的病死仔豬共2頭,分別采集其腦組織和扁桃體4份病料,PCR檢測(cè)結(jié)果中7、8、9、11泳道擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶為非特異性條帶,經(jīng)測(cè)序并非PCV2、PPV的基因序列。取1份PCR檢測(cè)結(jié)果為PRV核酸陽性的樣品進(jìn)行病毒的分離,最終成功分離得到一株P(guān)RV,并對(duì)其gE基因序列進(jìn)行分析,確定其為當(dāng)前廣西地區(qū)流行的PRV變異毒株。

PRV主要引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等癥狀,新生仔豬也常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及腹瀉等癥狀,同時(shí)也侵害仔豬的免疫系統(tǒng)[2],可以繼發(fā)感染PRRSV、PCV2、PPV、CSFV等病毒,因此本研究對(duì)采集的病料進(jìn)行了幾種豬常見病毒病病原的PCR檢測(cè),但未見其他病毒混合感染。對(duì)于豬偽狂犬病,目前沒有特效藥物進(jìn)行治療和防控,唯一采取方式是緊急接種疫苗[2],隱性感染豬的存在會(huì)對(duì)整個(gè)豬群的健康造成嚴(yán)重威脅[17]。因此,要從根本上降低PRV變異株帶來的風(fēng)險(xiǎn),必須重點(diǎn)做好凈化控制工作[18],還要從環(huán)境、管理、免疫、用藥等多方面采取綜合處理措施[19]。本研究從廣西貴港某豬場(chǎng)病死仔豬的腦組織和扁桃體中分離得到一株P(guān)RV,并對(duì)該病毒株進(jìn)行了鑒定和病原特性分析,為廣西地區(qū)PRV流行病學(xué)調(diào)查、病原學(xué)研究及診斷鑒定等工作提供了參考依據(jù)。