馬泰勒蟲的檢測(cè)及基因型分析

溫麗翠,李才善,葛曉敏,吐熱古麗·阿力木,劉凱強(qiáng),特列克·庫拉別克,巴音查汗·蓋力克

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

馬泰勒蟲(Theileiaequi)隸屬于泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileia),與馬駑巴貝斯蟲共屬馬梨形蟲,是寄生在馬屬動(dòng)物的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和紅細(xì)胞內(nèi)的一種蜱傳血液原蟲[1],也是導(dǎo)致馬梨形蟲病的主要病原[2],但馬泰勒蟲的危害遠(yuǎn)高于馬駑巴貝斯蟲[3]。感染馬泰勒蟲的馬匹會(huì)表現(xiàn)出食欲下降,體溫升高,黏膜充血,精神不振的臨床癥狀,若不及時(shí)治療,則會(huì)出現(xiàn)腹瀉,腸絞痛,嚴(yán)重時(shí),會(huì)發(fā)生心律失常,共濟(jì)失調(diào)、癲癇等病癥。馬泰勒蟲病多呈急性經(jīng)過,發(fā)病率和病死率較高[4],尤其對(duì)外來引進(jìn)的馬屬動(dòng)物危害更大,是制約發(fā)展中國家馬屬動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的原蟲病之一[5]。

馬泰勒蟲病在不同的國家流行程度不同。例如,SANT C[6]等人通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法對(duì)特立尼達(dá)的111匹馬進(jìn)行馬泰勒蟲檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有24.3%的馬被感染;Torres R[7]等人利用套式PCR方法對(duì)智利賽馬場(chǎng)的457個(gè)樣本進(jìn)行馬泰勒蟲檢測(cè),其感染率高達(dá)53.6%;Salas D R[8]等人通過PCR方法對(duì)墨西哥韋拉克魯斯州馬的100份樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示有18.0%的馬中存在T.equi。馬匹感染馬泰勒蟲后成為無癥狀病原攜帶者,制約它們的跨境活動(dòng)。我國馬匹數(shù)量位居世界第二,近年來,關(guān)于馬泰勒蟲流行病學(xué)的報(bào)道增多。在國內(nèi),孫秀濤[9]對(duì)廣西省部分馬匹進(jìn)行了T.equi的相關(guān)報(bào)道。新疆地區(qū)馬術(shù)運(yùn)動(dòng)蓬勃發(fā)展,為促進(jìn)國內(nèi)馬匹種類繁育發(fā)展搭建了平臺(tái),但馬泰勒蟲病一直是阻礙當(dāng)?shù)伛R產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一種不可忽視的地方病[10]。新疆伊犁是全國重要的運(yùn)動(dòng)馬及傳統(tǒng)馬的輸出基地之一[11],也是伊犁馬主產(chǎn)區(qū)[12]。馬泰勒蟲病在伊犁地區(qū)也是常見的家畜原蟲病。據(jù)文獻(xiàn)記載,2017年楊紅霞[13]等人的報(bào)道了馬泰勒蟲病導(dǎo)致伊犁一孕馬死亡。2022年史倩云[14]等人在昭蘇采樣過程中也發(fā)現(xiàn)了一例馬泰勒蟲病例。

由上述報(bào)道可知,馬泰勒蟲病在世界范圍內(nèi)各地區(qū)流行,在新疆的部分地區(qū)也時(shí)有發(fā)生,但是關(guān)于馬泰勒蟲病在旅游景點(diǎn)的報(bào)道及馬泰勒蟲基因型的研究較少,因此,本研究對(duì)在烏魯木齊周邊某旅游景點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的一例疑似馬泰勒蟲病的病例進(jìn)行血涂片檢查和PCR檢測(cè),并從基因?qū)用嫣接懥宋覈鸟R泰勒蟲病基因型類型,旨在為馬泰勒蟲基因型致病性的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 2022年5月,烏魯木齊周邊某旅游景點(diǎn)出現(xiàn)一匹在2021年9月份左右,從伊犁昭蘇某團(tuán)場(chǎng)購入的6歲母馬發(fā)病。采集疑似患馬的耳緣靜脈血和全血。主訴:此馬于3個(gè)月前出現(xiàn)發(fā)燒,鼻流黃白色鼻涕并伴有出血,排尿呈紅黃色,食欲減退,精神萎靡,血液稀薄,黏性下降。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒,購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司;PCR試劑,購自北京鼎國昌盛生物公司;快速吉姆薩染色試劑盒,購自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 體式顯微鏡(M205A型),德國Leica公司產(chǎn)品;生物顯微鏡(ECLIPSE E200型),日本Nikon公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司;凝膠成像儀(GelDocXR型),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;電子天平(PL303 型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀診斷 視診觀察患病馬匹的精神狀態(tài),飲食,排糞、排尿情況,觸診結(jié)膜有無充血或黃染,軀體是否出現(xiàn)水腫,并給患馬測(cè)量體溫。

1.2.2 血涂片檢查 從耳緣靜脈采集血液,滴在干凈載玻片上,用另一玻片推展成薄膜。按照瑞士染液說明書方法進(jìn)行染色。染色后將血涂片自然晾干,滴香柏油在油鏡下觀察。

1.2.3 馬泰勒蟲18S rRNA基因檢測(cè) 參照血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒操作說明書提取患馬核酸,置-20 ℃冰箱備用保存。引物參照羅金等[15]擴(kuò)增馬泰勒蟲18S rRNA基因目的片段使用的引物,進(jìn)行本病例馬泰勒蟲病的PCR檢測(cè)。具體的引物信息為F:5′-TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3′;R:5′-CCTCAAAGTAAACGTCG- TCATG-3′,引物合成委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。采用13 μL反應(yīng)體系,以獲得的DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃/53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)次數(shù)30;72 ℃再延伸,10 min,PCR體系設(shè)立如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of PCR

1.2.4 馬泰勒蟲基因型分析 參考Ratzon D K[16]等人基于18S rRNA進(jìn)行馬泰勒蟲基因型分析的序列信息,以牛環(huán)形泰勒18S rRNA基因(登錄號(hào):JQ743636)為外群,使用MAFFT V7.487進(jìn)行序列比對(duì),以Trimal V 1.2rev59中的參數(shù)-Automated1進(jìn)行序列裁剪,使用MEGA X篩選最佳模型為K2+G,以最大似然法(Maximum Likelihood,ML),Bootstrap=1000進(jìn)行基于馬泰勒蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 患馬臨床檢查

經(jīng)診斷發(fā)現(xiàn),患病馬匹體溫升高(41.2 ℃)、不食、精神沉郁、呼吸急促、流鼻涕、伴有貧血、比較消瘦、被毛雜亂無光,在其鬃毛處發(fā)現(xiàn)疑似蜱蟲叮咬的痕跡。

2.2 血涂片

通過瑞士染色發(fā)現(xiàn)紫色的圓形類蟲體(圓環(huán)形、橢圓形),頂端呈現(xiàn)點(diǎn)狀的紫色,中間呈現(xiàn)空心圓狀,為馬泰勒蟲,結(jié)果見圖1。

圖1 馬泰勒蟲血涂片(×1 000)Fig.1 The blood smear of T.equi(×1 000)

2.3 馬泰勒蟲18S rRNA檢測(cè)

經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將提取的患馬核酸一組3個(gè)重復(fù),1個(gè)陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)512 bp大小的目的片段,結(jié)果見圖2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～3.馬泰勒蟲PCR產(chǎn)物;4.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000; 1-3.T.equi PCR products; 4.Negative control圖2 馬泰勒蟲18S RNA序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 18S rRNA sequence amplification result of T.equi

2.4 馬泰勒蟲基因型結(jié)果分析

以先前進(jìn)行馬泰勒蟲A、B、C、D、E基因型分型的序列為參考,馬泰勒蟲基因型分析發(fā)現(xiàn),新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲的基因型以A 型和E 型為主。C和D基因組同聚一大支,親緣關(guān)系較近,B和E基因型聚為一支親緣關(guān)系較近,而A基因型相對(duì)獨(dú)立。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)我國周邊國家馬泰勒蟲基因型屬于E型,其中哈薩克斯坦株(MN857677),沙特阿拉伯株(LC431546),俄羅斯株(MG551915),西班牙株(AY534882)和甘肅株(MH651217)5個(gè)地區(qū)都聚集在E基因型,新疆尼勒克株(ON384628)與俄羅斯株(MG551915)聚為一支,親緣關(guān)系較近,昭蘇株(OL589499)等疆內(nèi)馬泰勒蟲也匯聚在E型,本研究檢測(cè)出該患馬的馬泰勒蟲屬A型,與其同源性較高的,隸屬新疆伊犁地區(qū)的昭蘇、尼勒克等地的代表性馬泰勒蟲屬E型,未見有屬B、C、D基因型的序列。具體見圖3。

3 討論

馬泰勒蟲是由中間宿主蜱傳播,寄生于馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲,分布廣泛[17]。在養(yǎng)殖牧馬和賽馬的地區(qū),馬泰勒蟲病普遍流行,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)。本文探究了伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲基因型類型及分布情況,對(duì)烏市周邊某旅游景點(diǎn)一例疑似感染馬泰勒蟲病的馬匹進(jìn)行診斷及基因型析,綜合確診該馬患有馬泰勒蟲病,新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲基因型為A型和E型,E型居多,隸屬新疆伊犁地區(qū)的昭蘇、尼勒克等地的代表性馬泰勒蟲屬E型,未見有屬B、C、D基因型的序列。此外,我國周邊國家哈薩克斯坦株,沙特阿拉伯株,俄羅斯株,西班牙株和甘肅株5個(gè)地區(qū)都聚集在E基因型?；谶@些主要流行基因型的研究,對(duì)于開發(fā)馬泰勒蟲病新的診斷工具和疫苗起關(guān)鍵作用。烏市某旅游景點(diǎn)產(chǎn)生馬泰勒蟲病是由于基層人員對(duì)該病的防控意識(shí)不足,對(duì)該病的治療也沒有較好的治療辦法,一旦有新出生馬匹或外來馬匹引入該地區(qū)時(shí),則極易發(fā)生急性感染,嚴(yán)重時(shí)患畜可能直接死亡,從而對(duì)該景區(qū)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

馬泰勒蟲病尚無特效疫苗可用,主要以預(yù)防為主。防治本病的關(guān)鍵在于消滅馬體表和周圍環(huán)境中的硬蜱,切斷傳播途徑[18]。在蜱的活躍季節(jié),采用人工滅蜱和藥物滅蜱相結(jié)合的方法,經(jīng)常檢查畜體體表,定期對(duì)畜體體表和圈舍徹底噴灑消毒。對(duì)外來馬匹要嚴(yán)格進(jìn)行檢疫,防止帶蟲馬進(jìn)入。上述建議可以為旅游景點(diǎn)馬泰勒蟲的防治提供參考,必要時(shí)結(jié)合藥物治療。常用防治梨形蟲病的藥物主要以西藥為主,此外,中藥因安全環(huán)保、低耐藥性的特點(diǎn)也被廣泛應(yīng)用于梨形蟲病的防治。然而,患病馬匹即使后期治療也可能成為新宿主,作為傳染源傳播給其他馬屬動(dòng)物。因此,在治療過程,除了對(duì)癥治療外,應(yīng)更加重視臨床治愈后的護(hù)理,同時(shí)增強(qiáng)馬匹自身的抵抗力。本研究可為新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲遺傳進(jìn)化分析及基因型與治病特性間關(guān)系研究提供理論依據(jù),在今后馬匹飼養(yǎng)管理中,可根據(jù)本文提供方法進(jìn)行馬泰勒蟲病的預(yù)防,為大城市旅游健康發(fā)展提供指導(dǎo)意義。