杜仲水提物改善動(dòng)物睡眠障礙作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驗(yàn)證

呂夢(mèng)圓,柴學(xué)軍,崔恩慧,張露露,朱曉巖,陳樹(shù)林,趙善廷*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,陜西西安 710000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是一種落葉喬木,別名思仲,在我國(guó)有著悠久的藥用歷史,主要是以樹(shù)皮入藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載,杜仲性溫,味甘,歸肝、腎經(jīng),具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎的功效等[4]。在臨床實(shí)踐中杜仲具有良好的改善睡眠作用,大劑量[20～25g/(kg×d)]的杜仲煎劑對(duì)犬進(jìn)行灌胃,能使其安靜、貪睡,不易受外界刺激[5]。然而,杜仲改善睡眠障礙的分子作用機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)探究杜仲改善睡眠障礙的作用機(jī)制,為杜仲用于治療睡眠障礙的臨床應(yīng)用和降低畜禽應(yīng)激,提高畜禽生產(chǎn)性能和免疫力提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,https://www.tcmsp-e.com/);Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),GeneCards綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/);Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/);人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https://omim.org/);STRING11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/);PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB,https://www.rcsb.org/);David6.8在線平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp); VENNY2.1.0網(wǎng)頁(yè)版(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html);Cytoscape 3.8.0軟件;ANY-maze軟件;Graphpad Prism 8.0.2軟件;SPSS 26.0軟件。

1.2 藥物與試劑

對(duì)氯苯丙氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;杜仲水提物,陜西全昌榮生物科技有限公司產(chǎn)品;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量試劑盒,Accurate Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只2月齡ICR雄性小鼠,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010,小鼠買(mǎi)回后飼養(yǎng)于22-24℃、濕度為60%±10%的環(huán)境中,光照/黑暗各12 h,小鼠可自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用經(jīng)過(guò)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):SCXK[SHAAN]2017-003)。

2 方法

2.1 杜仲相關(guān)靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18和血腦屏障(blood-brain barrier,BBB) ≥-0.03,獲取杜仲的主要有效活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)[6]。整合杜仲有效化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)后,刪除重復(fù)靶點(diǎn),獲得杜仲作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集,并利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將杜仲作用靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

2.2 睡眠障礙相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以睡眠障礙“Sleep disorders”為關(guān)鍵詞,分別在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行疾病相關(guān)潛在靶點(diǎn)的檢索。在 GeneCards綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中,Relevance score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系密切,故根據(jù)經(jīng)驗(yàn),若靶點(diǎn)數(shù)目過(guò)多,則取Relevance score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為睡眠障礙潛在靶點(diǎn)[7]。合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果后,刪除重復(fù)值即為睡眠障礙靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點(diǎn)的篩選

利用VENNY2.1.0網(wǎng)頁(yè)將杜仲成分作用靶點(diǎn)和睡眠障礙靶點(diǎn)取交集。之后將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.5 數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)定生物種類為智人(Homosapiens), 最小互相作用閾值為中等可信度“medium confidence(0.4)”,其余均為默認(rèn)設(shè)置,構(gòu)建杜仲治療睡眠障礙蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI network)并下載PPI 網(wǎng)絡(luò)的 TSV 格式文件,運(yùn)用 Cytoscape3.8.0軟件對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,根據(jù)結(jié)果篩選出杜仲改善睡眠障礙的核心靶點(diǎn)。

2.4 靶點(diǎn)GO功能及KEGG通路富集分析

將2.3獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David6.8在線平臺(tái),物種設(shè)置為智人(Homosapiens),進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能分析,以研究杜仲改善睡眠障礙的主要生物功能,包括可能存在的生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF);進(jìn)行 KEGG 通路富集分析,以研究杜仲改善睡眠障礙的主要信號(hào)通路。

2.5 成分-靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

利用Cytoscape3.8.0版本軟件構(gòu)建杜仲成分-睡眠障礙靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,選擇度值排名前2的具有水溶性的杜仲成分,在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載其 2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入至Chem3D 20.0.0.41軟件中以最小能量進(jìn)行3D轉(zhuǎn)換。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載杜仲改善睡眠障礙核心靶點(diǎn)的三維晶體結(jié)構(gòu),經(jīng)Pymol2.4.0軟件去除水分子和配體,導(dǎo)入至AutoDuckTools1.5.7進(jìn)行加氫、分配電荷后保存為pdbqt格式文件。將上述兩部分文件經(jīng)AutoDuck4.2.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 睡眠障礙模型建立與分組給藥 30只2月齡ICR雄性小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為3組,每組10只,分別為正常對(duì)照組、睡眠障礙組、杜仲組。除正常對(duì)照組外,其余2組小鼠每日腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)溶液450 mg/kg,連續(xù)注射2 d,正常對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。第一次腹腔注射PCPA后24～48 h,睡眠障礙組小鼠活動(dòng)量增多,攻擊性增強(qiáng),身上出現(xiàn)多處明顯創(chuàng)傷,體重下降,與正常對(duì)照組小鼠相比差異明顯。造模完成后,正常對(duì)照組和睡眠障礙組小鼠每日灌胃1次生理鹽水(1 mL/100 g),杜仲組的小鼠按1 mL/100 g每日灌胃杜仲水提物溶液(將杜仲水提物粉末加入蒸餾水配成400 mg/mL的溶液)。按照上述灌胃方法,連續(xù)灌胃5 d。

2.6.2 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 最后一次灌胃結(jié)束1 h后,進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。從同一角落將小鼠放于長(zhǎng)為50 cm,寬為50 cm,高為30 cm的曠場(chǎng)反應(yīng)箱中,并使用攝像機(jī)記錄每只小鼠進(jìn)入曠場(chǎng)后的運(yùn)動(dòng)軌跡。每只小鼠的測(cè)試時(shí)間為5 min,測(cè)試完成后使用75%的乙醇清潔曠場(chǎng)反應(yīng)箱。使用ANY-mazeTM視頻跟蹤系統(tǒng)分析小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡。

2.6.3 熒光定量PCR檢測(cè) 使用TRIzol試劑提取小鼠下丘腦組織總RNA。之后,使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒,將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為熒光定量PCR的模板,采用Bio-Rad CFX 96TM Real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)使用熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。引物如下:DRD2,F:5′-ACCTGTCCTGGTACGATGATG-3′,R:5′-GCATGGCATAGTAGTTGTAGTGG-3′; GABRA1,F:5′-AAAAGTCGGGGTCTCTCTGAC-3′,R:5′-CAGTCGGTCCAAAATTCTTGTGA-3′; GAPDH,F:5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTGCA-3′,R:5′-GTGGTCCAGGGTTTTTTACTCC-3′。在計(jì)算基因表達(dá)時(shí)采用三次測(cè)量的平均周期閾值(Ct)值,并使用GAPDH作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCt法測(cè)定目標(biāo)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。

2.6.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間顯著性檢驗(yàn),組間比較采用最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 8.0.2軟件將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(mean±SME)繪制成圖。

3 結(jié)果

3.1 杜仲“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選,并剔除沒(méi)有靶基因的活性成分,共獲得杜仲有效化合物13個(gè),包括cyclopamine(環(huán)巴胺)、yangambin(鵝掌楸樹(shù)脂酚B二甲醚)等,見(jiàn)表1(按DL由大到小排列)。去除各活性成分重復(fù)作用靶點(diǎn)后,共獲得杜仲作用靶點(diǎn)89個(gè)。

表1 杜仲活性成分Table 1 Active components of Eucommia ulmoides Oliver

3.2 睡眠障礙相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)Gene Cards綜合數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到睡眠障礙靶點(diǎn)7 621個(gè),根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Relevance score大于中位數(shù)2.824300289的目標(biāo)靶點(diǎn)為睡眠障礙潛在靶點(diǎn),共獲得睡眠障礙潛在靶點(diǎn)3 799個(gè)。通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到睡眠障礙潛在基因596個(gè),去除兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)值后,共獲得睡眠障礙靶點(diǎn)4276個(gè)。

3.3 杜仲改善睡眠障礙交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選所得的杜仲靶點(diǎn)和睡眠障礙靶點(diǎn)輸入VENNY2.1.0網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行分析,共獲得交集靶點(diǎn)32個(gè)。由此可見(jiàn),杜仲對(duì)睡眠障礙有一定的改善作用,交集靶點(diǎn)可能是杜仲改善睡眠障礙的核心靶點(diǎn)。將32個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.5 數(shù)據(jù)庫(kù),隱藏游離節(jié)點(diǎn)后,保存該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)的TSV格式文件,并導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果如表2所示,度值排名前4的靶點(diǎn)分別為HTR3A、GABRA1、DRD2、GABRA2,提示這些靶點(diǎn)可能是杜仲改善睡眠障礙的核心靶點(diǎn)。

表2 杜仲改善睡眠障礙的核心靶點(diǎn)Table 2 The key targets of Eucommia ulmoides Oliver for improving sleep disorders

3.4 靶點(diǎn)GO功能及KEGG通路富集分析

將23個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David6.8在線平臺(tái),進(jìn)行GO分析,以P<0.01為篩選條件,共獲得GO富集條目108條,其中包括生物過(guò)程(BP)69條,細(xì)胞組分(CC)21條和分子功能(MF)18條。根據(jù)P值從小到大進(jìn)行篩選,交集靶點(diǎn)參與的生物過(guò)程主要包括化學(xué)性突觸傳遞、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路偶聯(lián)環(huán)核苷酸第二信使、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等;細(xì)胞組成主要包括突觸、質(zhì)膜的組成成分等;分子功能主要包括神經(jīng)遞質(zhì)受體的活化、G蛋白偶聯(lián)的5-羥色胺受體的活化、5-羥色胺的結(jié)合、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體的活化等。

對(duì)23個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,根據(jù)P<0.01共篩選得到 11 條顯著信號(hào)通路。根據(jù)P值從小到大排列,杜仲治療睡眠障礙的靶點(diǎn)主要涉及以下KEGG通路:神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Taste transduction)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)等。

3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

構(gòu)建杜仲成分-睡眠障礙靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果圖1所示,藍(lán)色為杜仲成分,紫色為睡眠障礙靶點(diǎn),綠色為代謝通路。其中度值排名前2的具有水溶性的杜仲成分分別是Tabernemontanine(煙堿單寧)和Epiquinidine(表奎寧定)。由于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有適用的GABRA2的三維晶體結(jié)構(gòu),故將2種化合物分別與其余3個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果見(jiàn)表3,結(jié)合能越小,對(duì)接效果越好。結(jié)果顯示,這兩種化合物與DRD2靶點(diǎn)和GABRA1靶點(diǎn)的結(jié)合能均為負(fù)數(shù),結(jié)合良好。

DRD1,多巴胺D1受體;DRD2,多巴胺D2受體;DRD3,多巴胺D3受體;DRD4,多巴胺D4受體;DRD5,多巴胺D5受體; GABRA2,γ-氨基丁酸受體α2亞基;GABRA1,γ-氨基丁酸受體α1亞基; NOS3,內(nèi)皮型一氧化氮合成酶;GABRA5,γ-氨基丁酸受體α5亞基;CASQ2,肌集鈣蛋白2; CHRM5,毒蕈堿型乙酰膽堿能受體M5; CALM1,鈣調(diào)蛋白1;HTR1D,五羥色胺1D受體;PHKA2,磷酸化酶激酶α2亞基;GABRA3,γ-氨基丁酸受體α3亞基; HTR2B,五羥色胺2B受體; HTR3A,五羥色胺3A受體HTR1B,五羥色胺1B受體;HTR2C,五羥色胺2C受體;HTR2A,五羥色胺2A受體;HTR7,五羥色胺7受體DRD1,D(1) dopamine receptor; DRD2,D(2) dopamine receptor; DRD3,D(3) dopamine receptor; DRD4,D(4) dopamine receptor; DRD5,D(5) dopamine receptor; GABRA2,Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-2; GABRA1,Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1; NOS3,Nitric oxide synthase 3; GABRA5,Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-5; CASQ2,Calsequestrin-2; CHRM5,Muscarinic acetylcholine receptor M5; CALM1,Calmodulin-1; HTR1D,5-hydroxytryptamine receptor 1D; PHKA2,phosphorylase kinase regulatory subunit alpha-2; GABRA3,Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-3; HTR2B,5-hydroxytryptamine receptor 2B; HTR3A,5-hydroxytryptamine receptor 3A;HTR1B,5-hydroxytryptamine receptor1B; HTR2C,5-hydroxytryptamine receptor 2C; HTR2A,5-hydroxytryptamine receptor 2A; HTR7,5-hydroxytryptamine receptor圖1 杜仲成分-睡眠障礙靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Eucommia constituents-sleep disorder targets-pathways network

表3 分子對(duì)接結(jié)果Table 3 The results of molecular docking

3.6 動(dòng)物試驗(yàn)

3.6.1 杜仲對(duì)睡眠障礙小鼠行為學(xué)的影響 經(jīng)過(guò)ANY-mazeTM視頻跟蹤系統(tǒng)分析,各組小鼠的曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與正常對(duì)照組相比,睡眠障礙組小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、平均移動(dòng)速度和中央?yún)^(qū)域移動(dòng)距離均顯著增加(P<0.05)。與睡眠障礙組小鼠相比,杜仲組小鼠運(yùn)動(dòng)總距離和平均移動(dòng)速度顯著減小(P<0.01),更接近正常對(duì)照組, 中央?yún)^(qū)域移動(dòng)距離略有減小,但差異并不顯著(P>0.05)。

1.正常對(duì)照組;2.睡眠障礙組;3.杜仲組1.Control group; 2.Sleep disorders group; 3.Eucommia ulmoides Oliver group圖2 各組小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of the open field test for each group of mice

3.6.2 杜仲對(duì)睡眠障礙小鼠下丘腦DRD2、GABRA1 基因mRNA表達(dá)水平的影響 如圖3(A)所示,與正常對(duì)照組小鼠相比,睡眠障礙組小鼠下丘腦DRD2基因的mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與睡眠障礙組小鼠相比,杜仲組小鼠下丘腦DRD2基因的mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),幾乎下降到與正常對(duì)照組相似的水平。圖3(B)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組小鼠相比,睡眠障礙組小鼠下丘腦GABRA1基因的mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與睡眠障礙組小鼠相比,杜仲組小鼠下丘腦GABRA1基因的mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),甚至超過(guò)了正常對(duì)照組。

1.正常對(duì)照組;2.睡眠障礙組;3.杜仲組1.Control group; 2.Sleep disorders group; 3.Eucommia ulmoides Oliver group圖3 各組小鼠下丘腦DRD2、GABRA1基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The results of mRNA expression levels of DRD2 and GABRA1 genes in hypothalamus of each group of mice

4 討論

《素問(wèn)·生氣通天論》中記載,“陽(yáng)氣者,精則養(yǎng)神”。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為陽(yáng)氣具有養(yǎng)神、安神的作用,陽(yáng)氣不足時(shí)將導(dǎo)致神氣不寧,進(jìn)而引發(fā)睡眠障礙[8]。清代醫(yī)者鄭壽全在《醫(yī)法圓通》中寫(xiě)道“有因腎陽(yáng)衰而不能啟真水上升以交于心,心氣即不得不降,故不臥”,可見(jiàn)心腎不交將導(dǎo)致不寐[9]。杜仲性溫,具有溫補(bǔ)肝腎的作用,在改善睡眠的中藥處方中出現(xiàn)頻率較高[10]。然而杜仲改善睡眠障礙的具體作用機(jī)制尚未闡明。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),經(jīng)過(guò)篩選,共獲得包括煙堿單寧、表奎寧定等13個(gè)杜仲有效化合物, 32個(gè)藥物靶點(diǎn)基因。后經(jīng)PPI蛋白互作分析,獲得4個(gè)核心靶點(diǎn)HTR3A、GABRA1、DRD2和GABRA2。經(jīng)過(guò)GO和KEGG分析,預(yù)測(cè)到杜仲改善睡眠障礙可能參與的生物過(guò)程有化學(xué)性突觸傳遞等69個(gè),參與的分子功能主要包括神經(jīng)遞質(zhì)受體活化等18個(gè),參與的代謝通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路等11條。使用Cytoscape 軟件構(gòu)建杜仲成分-睡眠障礙靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),篩選出杜仲調(diào)節(jié)睡眠障礙的主要化合物為煙堿單寧和表奎寧定。分子對(duì)接結(jié)果顯示這兩種化合物與DRD2靶點(diǎn)和GABRA1靶點(diǎn)均結(jié)合良好。這表明杜仲有效成分可能通過(guò)調(diào)控DRD2和GABRA1基因的表達(dá)發(fā)揮作用。DRD2是編碼多巴胺D2受體的基因,GABRA1是編碼GABAA受體α亞基的基因。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果,我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。目前,腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)是國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的研究藥物改善睡眠作用的動(dòng)物模型[17]。PCPA是一種色氨酸羥化酶(TPH)的抑制劑,可以抑制5羥色胺(5-HT)的合成,造成睡眠障礙[18]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估動(dòng)物的焦慮和自發(fā)活動(dòng)水平[19]。在本研究中,與睡眠障礙組相比,杜仲水提物顯著減少了失眠小鼠的運(yùn)動(dòng)量(P<0.05),表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)靜效果。熒光定量PCR結(jié)果提示,杜仲有效成分通過(guò)調(diào)節(jié)DRD2和GABRA1基因的表達(dá),發(fā)揮鎮(zhèn)靜和緩解焦慮的作用。

畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中常發(fā)生動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng),后者會(huì)導(dǎo)致睡眠障礙,不但降低動(dòng)物機(jī)體免疫力,導(dǎo)致動(dòng)物易感染疾病,而且會(huì)引起動(dòng)物體重下降,影響畜禽肉蛋奶生產(chǎn)性能。本研究結(jié)果表明,中藥杜仲水提物可以通過(guò)調(diào)控DRD2和GABRA1基因的表達(dá)改善動(dòng)物睡眠障礙,為將杜仲水提物開(kāi)發(fā)為動(dòng)物飼料添加劑用于降低應(yīng)激提高畜禽免疫力和生產(chǎn)性能提供了依據(jù)。