兒茶素對金黃色葡萄球菌脂磷壁酸誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎的影響

于井成,付志新,沈菩秀,黃先凱,龍小川,王新莊*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046;2.河南省科學(xué)技術(shù)情報中心,河南鄭州 450003;3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

奶牛乳腺炎是奶牛生產(chǎn)中的常見病,可造成牧場及企業(yè)的巨大經(jīng)濟損失,嚴重制約奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,奶牛乳腺炎導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量減少,產(chǎn)奶品質(zhì)下降,生長發(fā)育緩慢,繁殖力降低,產(chǎn)奶年限縮短和死亡淘汰率上升,同時還因為治療以及預(yù)防不當(dāng)造成乳中獸藥和抗生素的殘留,危機人類的身體健康以及污染環(huán)境,導(dǎo)致環(huán)境安全問題日益突出[1]。乳腺炎是由微生物感染和理化刺激引起的奶牛乳腺炎癥,其特點是乳中體細胞尤其是白細胞增多,以及乳腺組織發(fā)生病理變化[2]。奶牛乳腺炎的主要的致病原因其一是由于病原微生物的感染,分為接觸傳染性病原菌和環(huán)境性病原菌,前者主要有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌等,后者主要是革蘭氏陰性菌,如大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等[3-4]。引發(fā)奶牛乳房炎的主要病原微生物之一是金黃色葡萄球菌,而LTA(lipoteichoic acid)是金黃色葡萄球菌細胞壁的主要組成成分之一,可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答。LTA能激活炎癥細胞從而引起炎癥反應(yīng),是引起炎癥的關(guān)鍵細胞毒性因子[5]。

兒茶素類化合物廣泛分布于綠茶等多種食物和藥用植物中,普遍具有生物活性,其活性成分為兒茶素和表兒茶素等。現(xiàn)有文獻表明,綠茶中所含兒茶素的抗氧化活性及其對預(yù)防疾病的能力很大程度上取決于分子中的結(jié)構(gòu)基團以及羥基的數(shù)量,可保護心腦血管,降低炎癥反應(yīng)(如降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的繼發(fā)性炎癥),降低纖維化,減少中性粒細胞和肥大細胞浸潤等[6];也有研究表明攝入的兒茶素可以通過抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的分泌和NF-κB通路的磷酸化水平來改善PM2.5誘導(dǎo)的小鼠全身炎癥[7];還有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素的抗炎潛能是通過抑制LPS(lipopolysaccharide)刺激細胞中COX2、iNOS、NO和TNF-α等的產(chǎn)生而發(fā)揮作用的,而對這些不同炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的抑制作用似乎是通過抑制NF-κB和MAP激酶激活來介導(dǎo)的[8]。這些表明兒茶素有潛力被開發(fā)成一種治療多種炎癥的抗炎治療藥物,也可以建議在營養(yǎng)制劑中使用兒茶素作為抗炎成分。本試驗通過測量低、中、高濃度的兒茶素的作用效果,探討兒茶素對于小鼠乳腺炎模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 7周齡左右、健康的雌性昆明小鼠購自河南春盈生物公司,室溫下培養(yǎng),自由進食進水。將分娩后5～10 d健康昆明雌鼠分為6組,即對照組(CG)、LTA致炎組(LTA)、LTA+10 mg/kg兒茶素組(D1)、LTA+20 mg/kg兒茶素組(D2)、LTA+30 mg/kg兒茶素組(D3)、LTA+5 mg/kg地塞米松組(DEX),每組3只重復(fù)。

1.1.2 動物倫理 動物實驗開展經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物使用委員會批準。批準文號:2005-0026。

1.1.3 主要試劑 LTA(L2515-5MG,5 mg/mL),西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;兒茶素(154-23-4,HPLC≥98%),四川維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品;超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(G2020-25ML)、4%多聚甲醛固定液(G1101),武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒(E211-02555)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R223-01),南京諾維贊生物科技有限公司產(chǎn)品;RIPA裂解液(M,C05-01001)、蛋白酶抑制劑混合物(哺乳動物,100X,PIC008)、β-actin一抗(bsm-33036M)、β-actin二抗(bs-40296G-HRP)和IκBα(bs-287R),北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;熒光染料Mix(TSE201)和Trizol試劑,北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品;地塞米松(S17003-5g),源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;NF-κB p65一抗(WL01273b)、p-NF-κB p65(WL02169)、p-IκBα(WL02495),萬類生物科技有限公司產(chǎn)品;HRP標記的二抗(Proteintech,SA-00001-2),河南天馳生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 酶標儀(Spark),上海帝肯貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光式分析儀(Tanon-5200),上海天能科技有限公司產(chǎn)品;基因擴增熱循環(huán)儀(Genesy 96T),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;實時熒光定量PCR儀(qTOWER3/G),德國耶拿公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 分娩后5～7 d正常泌乳的雌性小鼠,造模前與仔鼠隔離后按照隨機分配原則隨機分為6組,每組3只,稱重記錄數(shù)據(jù),注射質(zhì)量濃度為1 mg/kg的LTA溶液誘導(dǎo)24 h來建立小鼠乳腺炎試驗?zāi)Ｐ蚚9],具體操作大體同文獻記載[10]并稍作改動,乙醚吸入麻醉小鼠,充分暴露第4對乳腺及周圍皮膚,暴露乳導(dǎo)管,用注射器從小鼠第4對乳腺的乳頭口輕輕插入乳導(dǎo)管內(nèi),輕挑針尖至乳頭正下方的乳池內(nèi)注射LTA溶液。24 h后對藥物處理組腹腔注射質(zhì)量濃度為10 mg/kg、20 mg/kg和30 mg/kg的兒茶素[11]及5 mg/kg的地塞米松[12],藥物處理24 h后,稱量小鼠的體重并記錄。眼球采血:左手保定小鼠,用手術(shù)剪剪除小鼠的胡須,將小鼠倒置,使小鼠的眼球充血并暴露,彎鑷摘除眼球,收集血液于EDTA抗凝管內(nèi),送往武漢塞維爾生物科技有限公司進行血液細胞分析。采血完成后,采用頸椎脫臼法處死,手術(shù)剪剝開皮膚,暴露第3對乳腺,觀察大小,顏色,是否出血腫脹和膿腫的情況,并拍照。一部分進行HE染色,在顯微鏡下觀察組織切片,觀察管泡狀腺和小葉間導(dǎo)管的病變情況;另一部分放到無菌無酶EP管中于-80℃的冰箱冷凍保存,用于后續(xù)試驗。

1.2.2 組織炎癥因子檢測 -80℃冰箱取出小鼠乳腺組織,加入到含有Trizol的無菌無酶EP管內(nèi),隨后每個無菌無酶EP管內(nèi)加入相同數(shù)目和大小的鋼珠,在全自動樣品快速研磨儀中進一步研磨組織。隨后按照Trizol醇沉法來提取組織RNA。提取好的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA,之后進行RT-qPCR (real-time fluorescence quantitative PCR)反應(yīng)。檢測的促炎因子引物如表1所示。

表1 促炎因子引物序列Table 1 Pro-inflammatory factor primer sequences

1.2.3 組織蛋白檢測 取小鼠乳腺組織,加入混合的蛋白裂解液,全自動組織研磨儀進行組織研磨,后置于冰上裂解10～20 min,12 000 r/min,4℃離心10 min,離心結(jié)束吸取上清于新的EP管備用。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)提取到的蛋白濃度,確定各組需加入的蛋白含量。配備10% SDS-PAGE凝膠,完成電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h,封閉結(jié)束后加入稀釋好的待測一抗β-actin、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα和IκBα,β-actin的稀釋比例為1∶5 000,其余的皆為1∶1 000,4℃孵育過夜。TBST清洗3次,10 min/次。用HRP標記的二抗室溫孵育1 h,TBST清洗3次,10 min/次。最后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,Image J軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化及分析

測量小鼠處理前的體重、給藥后準備解剖時的體重。如表2所示,經(jīng)過處理后小鼠的體重都有減少,對照組小鼠未經(jīng)任何處理,體重變化量最少,LTA致炎組小鼠的體重變化最大,LTA+5 mg/kg地塞米松組的小鼠和LTA+20 mg/kg兒茶素組的小鼠體重變化較少。

表2 小鼠體重變化Table 2 Weight changes in mice

2.2 小鼠乳腺剖檢觀察

小鼠經(jīng)眼球采血后處死,剖檢觀察乳腺的顏色、大小、是否充血腫脹等情況,如圖1所示,A為空白對照組的小鼠,乳腺顏色正常呈乳白色且大小形狀正常;B為LTA致炎組的小鼠,乳腺顏色明顯發(fā)紅、可見組織充血腫脹癥狀;C為LTA+5 mg/kg地塞米松組,與LTA組相比,紅腫狀況和血管充血狀況有所緩解;D、E、F分別為LTA+10 mg/kg兒茶素組、LTA+20 mg/kg兒茶素組,LTA+30 mg/kg兒茶素組,3個組可觀察到血管充血癥狀有明顯的減輕且組織腫脹也有所緩解。從整體比較來看,濃度為20 mg/kg的兒茶素具有較好緩解效果。

A.對照組;B.LTA致炎組;C.LTA+5 mg/kg地塞米松組;D.LTA+10 mg/kg兒茶素組;E.LTA+20 mg/kg兒茶素組;F.LTA+30 mg/kg兒茶素組A.control group; B.LTA inflammatory group; C.LTA+ dexamethasone drug treatment group; D.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; E.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; F.LTA+ catechin (30 mg/kg) group圖1 不同處理組小鼠乳腺組織解剖圖Fig.1 Anatomy of mammary gland tissue in different treatment groups

2.3 小鼠血液分析

眼球采血并利用儀器進行血常規(guī)的檢查,各個細胞數(shù)目的參考范圍是根據(jù)檢測儀器三分類血球儀所自帶的結(jié)果。如表3所示,LTA刺激后白細胞、單核細胞等數(shù)目超過正常參考范圍,引起了炎性細胞向病變組織聚集;中濃度劑量的兒茶素治療后,白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)目等總體下降較為明顯;地塞米松治療后白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞數(shù)等處于參考范圍之內(nèi),結(jié)果表明中濃度的兒茶素有一定的治療效果。

表3 血液細胞學(xué)分析數(shù)據(jù)Table 3 Blood cytological analysis data

2.4 HE染色結(jié)果及病理分析

結(jié)果顯示,每組小鼠組織腺泡都有密集增生,局部脂肪組織大小不均勻,有充血、出血、淤血、水腫、變性、增生等基本病理改變,對典型病變部位成像用箭頭標注。如圖2所示,對照組的腺泡顯著密集增生,導(dǎo)管中偶見脫落的細胞,少量細胞破碎。5 mg/kg地塞米松治療后可見腺泡中度增生,分布不均勻;多量腺泡及導(dǎo)管中充滿嗜酸性分泌物,導(dǎo)管中偶見脫落的細胞。LTA致炎組病變最為嚴重,可見腺泡顯著密集增生,分布均勻,較多腺泡及導(dǎo)管中可見嗜酸性分泌物,導(dǎo)管中偶見脫落的細胞,少量細胞壞死,胞核碎裂或溶解,伴有中性粒細胞點狀浸潤;局部可見較多鈣化灶;局部脂肪細胞大小不均勻,少量細胞破碎。LTA+10 mg/kg兒茶素組較LTA致炎組變化略輕,乳腺可見腺泡輕度增生,分布不均勻;腺泡及導(dǎo)管中少見嗜酸性分泌物,導(dǎo)管中偶見脫落的細胞,伴有少量淋巴細胞浸潤,少量細胞破碎。LTA+20 mg/kg兒茶素組可見腺泡中度增生,分布不均勻;多量腺泡及導(dǎo)管中充滿嗜酸性分泌物,較多上皮變性,胞質(zhì)疏松淡染,伴有少量淋巴細胞浸潤,偶見鈣化灶。LTA+30 mg/kg兒茶素組可見腺泡輕度增生,分布不均勻;腺泡及導(dǎo)管中少見嗜酸性分泌物,導(dǎo)管中偶見脫落的細胞,少量上皮變性,胞質(zhì)疏松淡染,伴有中性粒細胞點狀浸潤。結(jié)果表明兒茶素具有一定的治療效果,且低、中濃度的兒茶素具有較好的治療效果。

A.對照組;B.LTA+5 mg/kg地塞米松組;C.LTA致炎組; D.LTA+10 mg/kg兒茶素組;E.LTA+20 mg/kg兒茶素組;F:LTA+30 mg/kg兒茶素組.腺泡及導(dǎo)管中充滿嗜酸性分泌物,導(dǎo)管中脫落的細胞(黑色箭頭);細胞破碎(棕色箭頭);淋巴細胞浸潤(紅色箭頭);鈣化灶(黃色箭頭);細胞壞死,胞核碎裂或溶解(綠色箭頭);上皮變性,胞質(zhì)疏松淡染(藍色箭頭)A.Control group; B.LTA+ dexamethasone drug treatment group; C.LTA group; D.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; E.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; F.LTA+ catechin (30 mg/kg) group.Acinar and catheter filled with eosinophilic secretions,shed cells in catheter (black arrow); Cell fragmentation (brown arrow); Lymphocyte infiltration (red arrow); Calcification foci (yellow arrow); Cell necrosis,nucleus disintegration or lysis (green arrow); Epithelial degeneration,loose cytoplasm light staining (blue arrow)圖2 小鼠乳腺組織H&E染色結(jié)果(20×; 標尺規(guī)格為50 μm)Fig.2 Results of H&E staining of mouse mammary gland tissues (20×; Scale size is 50 μm)

2.5 促炎因子mRNA表達結(jié)果

利用RT-qPCR方法檢測小鼠乳腺組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。結(jié)果表明,與對照組(CG)相比,LTA組小鼠乳腺組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達顯著升高(P<0.05);不同質(zhì)量濃度兒茶素及地塞米松處理后,乳腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平顯著低于LTA組(P<0.05)(圖3)。

CG.對照組;LTA.LTA致炎組;D1.LTA+10 mg/kg兒茶素組;D2.LTA+20 mg/kg兒茶素組;D3.LTA+30 mg/kg兒茶素組;DEX.LTA+5 mg/kg地塞米松組CG.Control group; LTA.LTA inflammatory group; D1.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; D2.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; D3.LTA+ catechin (30 mg/kg) group;DEX.LTA+ dexamethasone drug treatment group圖3 不同處理組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達量Fig.3 mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in different treatment groups

2.6 NF-κB信號通路蛋白表達結(jié)果

蛋白免疫印跡法檢測小鼠乳腺組織中NF-κB信號通路的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比而LTA致炎后表達均上升且高于其他組,LTA+5 mg/kg地塞米松組、LTA+10 mg/kg兒茶素、LTA+20 mg/kg兒茶素和LTA+30 mg/kg兒茶素p-NF-κB p65和p-IκBα的表達均有下降,其中LTA+20 mg/kg兒茶素p-NF-κB p65和p-IκBα的表達下降最明顯(圖4)。表明兒茶素對小鼠的的乳腺炎有治療效果。

CG.對照組; LTA.LTA致炎組; D1.LTA+10 mg/kg兒茶素組;D2.LTA+20 mg/kg兒茶素組;D3.LTA+30 mg/kg兒茶素組;DEX.LTA+5 mg/kg地塞米松組CG.Control group; LTA.LTA inflammatory group; D1.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; D2.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; D3.LTA+ catechin (30 mg/kg) group; DEX.LTA+ dexamethasone drug treatment group圖4 不同處理組NF-κB信號通路中p-p65和p-IκBα蛋白表達(A)、量化分析(B、C)Fig.4 Expressions of p-p65 and p-IκBα proteins in NF-κB signaling pathway in different treatment groups (A),quantitative analysis (B,C)

3 討論

因奶牛的研究成本過大,本試驗采用小鼠為試驗動物來探究兒茶素對奶牛乳腺炎的治療效果。本試驗通過乳導(dǎo)管注射LTA構(gòu)建小鼠乳腺炎模型并對其進行觀察和研究,LTA能夠引起宿主組織器官的炎性病理損傷,常被用作模擬金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)體內(nèi)和體外乳腺。細胞因子是炎癥反應(yīng)的指標,包括促炎癥因子和抗炎癥細胞因子[13]。IL-1β、IL-6和TNF-α是由單核細胞、內(nèi)皮細胞成纖維細胞等炎癥細胞在應(yīng)答感染時產(chǎn)生的促炎因子。IL-1β可趨化并激活中性粒細胞,進一步促進炎癥反應(yīng)的進行。TNF-α在早期的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用,它可引起激發(fā)狀態(tài)的免疫細胞產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì),形成“瀑布式反應(yīng)”,從而引起組織損傷。IL-6具有增強TNF-α損害的作用,誘導(dǎo)T細胞、B細胞淋巴細胞分化,放大炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致組織細胞損傷[14]。NF-κB作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的樞紐,與免疫、細胞凋亡、炎癥等生理過程有著密切聯(lián)系,是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子[15]。Ryu Y H[16]等研究發(fā)現(xiàn)LTA可激活鼠巨噬細胞表面TLR2及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,引起TNF-α和NO的分泌并具有濃度及時間依賴性。推測LTA可通過TLR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將炎癥信號轉(zhuǎn)到細胞內(nèi),并引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,導(dǎo)致炎性因子的分泌和釋放。本實驗結(jié)果表明以LTA作為誘炎物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠乳腺組織,HE染色鏡檢觀察小鼠組織腺泡密集增生,有充血、出血、水腫、變性、增生等病理改變;對于NF-κB信號通路來說LTA誘導(dǎo)后該通路被明顯激活,IL-1β、IL-6、TNF-α促炎因子基因表達極顯著升高(P<0.01)。

目前在臨床上應(yīng)用較為廣泛的藥物是抗生素類藥物,容易導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生、抗生素殘留等問題。治療奶牛乳腺炎的中藥里比較常見的是蒲公英、金銀花、黃芪、連翹和丹參等5味藥,以苯甲醇為輔料制成的蒲公英注射液,還有以蒲公英、連翹、金銀花、黃芪以及黨參等按照科學(xué)的配比制成的乳炎靈注射液等[17]。地塞米松是已發(fā)現(xiàn)的具有治療奶牛乳腺炎作用的藥物之一,具有較強的抗炎、增強血管緊張度、減少血管充血及降低血管通透性的作用,在早期應(yīng)用能抑制多種原因如免疫功能低下及病原生物等引起的炎癥反應(yīng)[18]。兒茶素屬于茶多酚的一種,是茶多酚發(fā)揮作用的主要物質(zhì),在可可、葡萄、茶以及其他許多水果和蔬菜中含量豐富,具有抗菌、抗腫瘤、清除自由基、延緩衰老、抑制肥胖、抗病毒等作用,且有研究證實茶多酚可抑制或殺死金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、百日咳桿菌、痢疾桿菌和霍亂弧菌等[19]。表兒茶素(epicatechin,EC)與表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸(epigallocatechin gallate,EGCG)共同構(gòu)成了兒茶素的主要成分[20]。周露露等證實兒茶素具有足夠的潛力,通過細胞和體液機制調(diào)節(jié)免疫活性,增強機體的抵抗力[21],許君等發(fā)現(xiàn)綠茶兒茶素可調(diào)節(jié)肝富集轉(zhuǎn)錄因子的表達,起到抗乙型肝炎病毒的藥理作用[22]Musial C發(fā)現(xiàn)羥基的數(shù)量和特征結(jié)構(gòu)基團的存在對兒茶素的抗氧化活性存在巨大影響[23]。Bai L發(fā)現(xiàn)綠茶的兒茶素具有廣泛的對革蘭氏陰性菌和陽性菌的抗菌活性[24]。Ohishi T發(fā)現(xiàn)兒茶素中的EGCG可作為抗氧化劑清除活性氧,進而導(dǎo)致NF-κB信號通路受到抑制[25]。因此本實驗通過建立小鼠乳腺炎模型并運用兒茶素進行治療,同時使用已知具有一定治療效果的地塞米松進行對比,探究兒茶素對LTA誘導(dǎo)的乳腺炎的影響,為之后兒茶素新藥的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本試驗結(jié)果表明經(jīng)不同質(zhì)量濃度兒茶素處理后組織損傷有不同程度的緩解,NF-κB信號通路及促炎因子表達受到抑制,綜合結(jié)果表明中濃度(20 mg/kg)的兒茶素對于LTA誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎有較好的治療作用,為治療奶牛乳腺炎的治療提供新的思路。