秦嶺大熊貓骨髓、牙髓和脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定

馬永杰,趙鵬鵬,龔素華,沈潔娜,張丹輝,靳亞平,雷穎虎*,林鵬飛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.秦嶺大熊貓研究中心,陜西樓觀臺 710402)

大熊貓是世界生物多樣性保護的旗艦物種,秦嶺大熊貓是大熊貓的重要亞種種群,具有獨特的形態(tài)特征和遺傳特性。秦嶺大熊貓作為大熊貓的獨立亞種,以圓頭短尾、憨態(tài)圓潤聞名于世,極高的觀賞價值賦予了秦嶺大熊貓?zhí)赜械摹巴饨皇姑?這使得保護秦嶺大熊貓亞種獨有的遺傳多樣性成為了新的使命。

據(jù)第四次全國大熊貓調(diào)查結(jié)果顯示,秦嶺大熊貓約有345只,而其他地區(qū)的野生大熊貓約有1519只。從保護大熊貓種群及遺傳多樣性角度出發(fā),秦嶺大熊貓則更為珍貴和瀕危。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有明顯的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫調(diào)節(jié)能力及無異基因移植排斥反應(yīng)與致瘤性等優(yōu)良生物學(xué)特性,在體外培養(yǎng)下間充質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞,是種質(zhì)資源保護中最有保護價值的細(xì)胞資源[1]?？焖侔l(fā)展的細(xì)胞技術(shù)為MSCs在種質(zhì)資源保存的研究中提供了新方向,同時,MSCs廣泛的來源,簡單的分離方法,充分顯示了其做為種質(zhì)資源的可行性。目前,MSCs作為優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源已在牛、豬、小熊貓、北京油雞等多種動物上展開保護[2-4]。在大熊貓細(xì)胞庫的建立中,目前僅報道有骨髓與臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞庫、膈肌與皮膚組織來源的成纖維細(xì)胞庫[5-6],而對大熊貓其他組織來源的MSCs目前尚無研究。本試驗通過分離培養(yǎng)秦嶺大熊貓不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)鑒定后對其進行保存,為秦嶺大熊貓生命科學(xué)基礎(chǔ)研究以及今后在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供珍貴的材料和種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 牙髓、骨髓和脂肪組織來源于陜西省秦嶺大熊貓研究中心妊娠106 d的流產(chǎn)大熊貓?zhí)骸?/p>

1.1.2 主要試劑 間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒(HUXMA-90042),成骨誘導(dǎo)分化試劑盒(HUXMF-90021),成脂誘導(dǎo)分化試劑盒(HUXMA-90031),廣州賽業(yè)生物科技公司產(chǎn)品;RNA Trizol,購自日本Takara公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,加拿大ABM公司產(chǎn)品;CCK-8試劑盒,日本同仁化學(xué)(CK04)產(chǎn)品;細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒,上海碧云天公司產(chǎn)品(C0602);0.25%胰蛋白酶,DMSO,美國Sigma公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,加拿大ABM公司產(chǎn)品;蘇木素,北京索萊寶公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(371),分光光度計(Nanodrop One),美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(101M),日本Nikon公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 4200),上海天能科技有限公司產(chǎn)品;電泳儀(BG-Power 300),PCR儀(S1000),美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 秦嶺大熊貓骨髓MSCs的分離 無菌生理鹽水沖洗大熊貓流產(chǎn)胎兒3～5次,浸泡于75%酒精60～90 s,用含5×三抗PBS清洗3～5次,置于裝有5×三抗PBS的無菌保溫瓶中并迅速送至實驗室,送至實驗室后再次重復(fù)以上清洗步驟。

在超凈工作臺中,用眼科剪和眼科鑷取出大熊貓死胎股骨,剪開股骨頭暴露骨髓腔;用1 mL注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)液后反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液于35 mm培養(yǎng)皿中;將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱,24 h后觀察;將未貼壁的細(xì)胞移至一新的35 mm培養(yǎng)皿,每日觀察細(xì)胞貼壁和生長狀態(tài)。

1.2.2 秦嶺大熊貓脂肪MSCs與牙髓MSCs的分離 在超凈工作臺中,用眼科剪和眼科鑷取大熊貓死胎的皮下脂肪組織與牙周組織并剪碎至1 mm3大小,將剪碎的組織塊分別轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中,加入4～5倍組織體積的5 mg/mL Ⅳ型膠原酶;脂肪組織37℃消化35～45 min,每5 min吹打一次,消化至組織塊為絮狀物時終止消化;牙周組織37℃消化15 min終止;分別向牙周組織與脂肪組織中加入6～8 mL培養(yǎng)液重懸后,1000 r/min離心4 min,棄去上清;加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸沉淀,轉(zhuǎn)移至各培養(yǎng)皿中,靜置1～2 min,待部分未消化組織塊貼壁后,緩慢加入DMEM/F12培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中,每日觀察細(xì)胞貼壁和生長狀態(tài)。

1.3 秦嶺大熊貓MSCs增殖能力檢測

將融合度達到80～90%的第3代大熊貓MSCs進行消化并計數(shù),并按照1×104細(xì)胞/孔密度接種至96孔培養(yǎng)板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日棄去原培養(yǎng)液,加入100 μL新的培養(yǎng)液和10 μL CCK-8工作液,培養(yǎng)箱中孵育2 h后,于酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度,記錄并繪制生長曲線。

1.4 秦嶺大熊貓MSCs表面標(biāo)志分子檢測

1.4.1 RT-PCR分析 使用Trizol試劑分離總RNA,然后使用5X All-In-One RT MasterMix進行反轉(zhuǎn)錄,采用AccuRT Genomic DNA Removal Kit進行PCR檢測。根據(jù)GenBank公布的大熊貓基因序列,利用Primer 5軟件設(shè)計引物,序列見表1。

1.4.2 秦嶺大熊貓MSCs分化潛能檢測

1.4.2.1 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能檢測 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液A的配制:配制前6 h溶解各組分,在175 mL DMEM/F12培養(yǎng)液中加入20 mL FBS、2 mL雙抗、2 mL L-谷氨酰胺、400 μL胰島素、200 μL IBMX、200 μL羅格列酮和200 μL地塞米松,混勻后分裝。

成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液B的配制:配制前6 h溶解各組分,在175 mL DMEM/F12培養(yǎng)液中加入20 mL FBS、2 mL雙抗、2 mL L-谷氨酰胺和400 μL胰島素,混勻后分裝。

培養(yǎng)皿的包被:在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入600 μL 0.1%明膠,輕搖使其均勻覆蓋底部,1 h后棄去明膠,晾干后即可使用;將融合度達90%的第3代MSCs消化后計數(shù),按照2×104細(xì)胞/孔接種于包被后的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入800 μL DMEM/F12培養(yǎng)液,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每兩天觀察一次并換液;待細(xì)胞融合度達100%時,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗兩次后,加入700 μL提前預(yù)熱好的成脂誘導(dǎo)液A;誘導(dǎo)72 h后,棄去成脂誘導(dǎo)液A,加入700 μL成脂誘導(dǎo)液B,誘導(dǎo)24 h后棄去成脂誘導(dǎo)液B;按照上述步驟3和4重復(fù)誘導(dǎo)分化4次,直至出現(xiàn)脂滴,停止誘導(dǎo);棄去誘導(dǎo)液,PBS清洗兩次,4%多聚甲醛室溫條件下固定30 min,棄去固定液,PBS清洗兩次,加入油紅O染色20 min,PBS清洗后觀察拍照。

1.4.2.2 成骨誘導(dǎo)分化潛能檢測 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液的配制:配制前6 h溶解各組分,在175 mL DMEM/F12培養(yǎng)液中加入20 mL FBS、2 mL雙抗、2 mL L-谷氨酰胺、2 mL β-甘油磷酸鈉、400 μL抗壞血酸和20 μL地塞米松,混勻后分裝。將秦嶺大熊貓MSCs按照2×104細(xì)胞/孔接種于明膠包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入DMEM/F12培養(yǎng)液后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細(xì)胞融合度達到90%時,棄去培養(yǎng)液加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,每3 d換液1次;誘導(dǎo)3周后,棄去成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定,PBS清洗2次,茜素紅染色20 min,染色結(jié)束后PBS清洗2次,拍照觀察。

1.4.2.3 成軟骨誘導(dǎo)分化潛能檢測 成軟骨誘導(dǎo)分化預(yù)混液的配制:配制前6 h溶解各組分,在97 mL DMEM/F12培養(yǎng)液中加入1 mL ITS添加物、300 μL抗壞血酸、100 μL脯氨酸、100 μL丙酮酸鈉和10 μL地塞米松,混勻后分裝。成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液的配制:按體積比1∶100在1 mL預(yù)混液中加入10 μL TGF-β3配制成完全誘導(dǎo)液。收集1～2×106個秦嶺大熊貓MSCs轉(zhuǎn)移至15 mL無菌離心管中,900 r/min離心4 min后,棄去上清并加入1 mL預(yù)混液重懸,重復(fù)離心并棄去上清;加入1 mL完全誘導(dǎo)液,900 r/min離心4 min后,將離心管的管蓋擰松轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中;培養(yǎng)48 h后,輕彈離心管底部使細(xì)胞沉淀重懸;每隔2～3 d換液1次;持續(xù)誘導(dǎo)3～4周后,形成軟骨球;將軟骨球取出,PBS清洗后,4%多聚甲醛固定30 min;用50%、75%、80%、95%和無水酒精梯度脫水10 min;加入二甲苯和無水乙醇混勻液(體積比1∶1)浸泡2 h后,加入二甲苯浸泡1.5 h,更換二甲苯后繼續(xù)浸泡1 h;去除二甲苯,加入二甲苯和石蠟混勻液(體積比1∶1),40℃烘箱中放置40 min;將軟骨球浸于石蠟中,55℃烘箱放置30 min,然后進行石蠟包埋;石蠟切片后,進行常規(guī)脫蠟處理;滴加阿利辛藍染液,于37℃條件染色1 h,自來水沖洗切片5 min,晾干,顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 秦嶺大熊貓不同組織來源MSCs形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 骨髓來源MSCs 大熊貓骨髓沖洗液在接種培養(yǎng)后4 d,可觀察到MSCs大量遷出(圖1a);傳代后的第1代MSCs呈長梭形、短梭形以及三角形等形狀(圖1b);當(dāng)傳代至第4代時,細(xì)胞形態(tài)均為長梭形,聚集生長呈漩渦狀,生長速度加快(圖1c);傳代至第10代時,MSCs形態(tài)呈扁平不規(guī)則形狀,增殖速度明顯下降(圖1d)。

a.原代細(xì)胞;b.第1代細(xì)胞;c.第4代細(xì)胞;d.第10代細(xì)胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the tenth passage圖1 秦嶺大熊貓骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞不同代次的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of bone marrow-derived mesenchymal stem cell of Qinling giant panda in different cell passages

2.1.2 牙髓來源MSCs 大熊貓牙髓組織接種后3 d,可觀察到組織周圍有梭狀細(xì)胞遷出(圖2a);圖2b為原代細(xì)胞傳代后2 d,細(xì)胞多呈三角形和多邊形,生長較為緩慢;圖2c為第4代細(xì)胞,細(xì)胞呈長梭形,細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀生長特點;傳代至第8代時,細(xì)胞生長速度顯著減慢,形態(tài)發(fā)生變化,部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失,逐漸死亡(圖2d)。

a.原代細(xì)胞;b.第1代細(xì)胞;c.第4代細(xì)胞;d.第8代細(xì)胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the 8th passage圖2 秦嶺大熊貓牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞不同代次的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of dental pulp-derived mesenchymal stem cells of Qinling giant panda in different cell passages

2.1.3 脂肪來源MSCs 大熊貓脂肪組織消化接種后7 d時,細(xì)胞融合度可達80%以上,細(xì)胞多呈長梭形、圓球狀,成纖維樣細(xì)胞聚集現(xiàn)象明顯(圖3a);原代細(xì)胞傳代后,此時細(xì)胞呈三角形和梭形(圖3b);當(dāng)傳代至第4代時,細(xì)胞增殖速度加快,細(xì)胞形態(tài)均一呈漩渦狀生長(圖3c);第10代細(xì)胞增殖能力明顯降低,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖3d)。

a.原代細(xì)胞;b.第1代細(xì)胞;c.第4代細(xì)胞;d.第10代細(xì)胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the tenth passage圖3 秦嶺大熊貓脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞不同代次的形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cell of Qinling giant panda in different cell passages

2.2 秦嶺大熊貓不同組織來源MSCs增殖能力分析

采用CCK-8法對第3代骨髓、牙髓和脂肪組織來源MSCs的增殖能力進行檢測,如圖4所示,3種MSCs在傳代后2 d開始迅速增殖,進入對數(shù)生長期,5 d時達到平臺期,細(xì)胞的生長曲線整體均呈現(xiàn)典型的“S”型曲線。

a.骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞;b.牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞s;c.脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞a.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; b.Dental pulp-derived mesenchymal stem cells; c.Adipose-derived mesenchymal stem cells圖4 秦嶺大熊貓不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力檢測Fig.4 The proliferation ability of mesenchymal stem cell isolated from different tissues of Qinling giant panda

2.3 秦嶺大熊貓不同組織來源MSCs表面標(biāo)志物檢測

CD73與CD90為MSCs的特異性標(biāo)志物,CD31和CD34為造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。如圖5所示,大熊貓骨髓來源MSCs表達CD73、CD90、SCFR和SOX-2,不表達CD34。大熊貓牙髓來源MSCs表達SCFR、CD90和CD73,不表達CD34和CD31(圖5b)。大熊貓脂肪來源MSCs表達CD73、CD90和GNL3,不表達CD34和CD31(圖5c)。上述結(jié)果表明,本試驗分離獲得的3種細(xì)胞均為MSCs。

a.骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞;b.牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞;c.脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞a.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; b.Dental pulp-derived mesenchymal stem cells; c.Adipose-derived mesenchymal stem cells圖5 秦嶺大熊貓不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測Fig.5 The surface markers of mesenchymal stem cells isolated from different tissues of Qinling giant panda

2.4 秦嶺大熊貓不同組織來源MSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果

如圖6所示,本試驗分離獲得的骨髓、牙髓和脂肪組織來源MSCs,成脂誘導(dǎo)后可被油紅O染為紅色,成骨誘導(dǎo)后可被茜素紅染為紅色,成軟骨誘導(dǎo)后可被阿利辛藍成功染色,表明3種MSCs具有多向分化潛能。

a,d,g.采用油紅O染色評估間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)能力;b,e,g.采用茜素紅染色評估間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)能力;c,f,i.采用阿利辛藍染色評估間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)能力(bar=100 μm);a,b,c.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;d,e,f.牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞;g,h,i.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞a,d,g.The adipogenic induction of mesenchymal stem cells detected by Oil Red O staining; b,e,g.The osteogenic induction of mesenchymal stem cells detected by Alizarin Red staining; c,f,i.The chondrogenic inducibility of mesenchymal stem cells detected by Alicia Blue staining (bar=100 μm);a,b,c.Bone marrow mesenchymal stem cells;d,e,f.Dental pulp mesenchymal stem cell; g,h,i.Adipose mesenchymal stem cells圖6 秦嶺大熊貓不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果Fig.6 Induction differentiation ability of mesenchymal stem cells isolated from different tissues of Qinling giant panda

3 討論

大熊貓脂肪組織和牙周組織體積較大,本試驗通過組織塊法和5 mg/mL膠原酶消化法先后處理組織來分離細(xì)胞,可加快細(xì)胞遷出時間,有效縮短獲得原代細(xì)胞時間。從大熊貓骨髓、脂肪和牙髓組織中獲得的MSCs形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似,當(dāng)細(xì)胞融合度高時呈渦旋狀排列,與此前報道過的大熊貓臍帶來源MSCs形態(tài)相似[7]。本試驗中利用MSCs的貼壁特性進行分離純化,最終獲得大熊貓MSCs。

MSCs在體外擴增時會出現(xiàn)衰老及干細(xì)胞特性程序性丟失,這可以與MSCs多次傳代后緩慢生長和分化能力降低有關(guān)[8]。本試驗發(fā)現(xiàn)大熊貓不同組織來源第3代MSCs傳代后2 d進入快速擴增期,6 d達到平臺期;骨髓、脂肪及牙髓來源的MSCs在第8～10代時,表現(xiàn)出增殖能力減弱,細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則形。

大熊貓MSCs的鑒定受到諸多因素的限制。大熊貓MSCs特異性表面標(biāo)志物研究較少,相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)未見權(quán)威報道。根據(jù)國際細(xì)胞治療協(xié)會(ISCT)最低標(biāo)準(zhǔn),本試驗通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化試驗和檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子來鑒定是否為間充質(zhì)干細(xì)胞。已有研究表明,未發(fā)現(xiàn)大熊貓?zhí)禺愋钥贵w來測試表面標(biāo)志物,相關(guān)抗體并未商業(yè)化[7]。因此,在本研究中,RT-PCR用于檢測特定表面標(biāo)志物的表達。

本試驗在骨髓來源MSCs的表型鑒定中,檢測結(jié)果顯示CD73、CD90、SCFR和SOX-2表達陽性,與Yuliang Liu等[9]在大熊貓骨髓MSCs的研究結(jié)果基本一致。在脂肪來源MSCs的表型鑒定中,大熊貓脂肪MSCs陽性表達CD73、CD90及GNL3;在人類脂肪MSCs的表型鑒定中,通常穩(wěn)定表達CD13、CD73、CD44及CD90,CD105表達并不穩(wěn)定[10]。在牙髓來源的MSCs表面標(biāo)志檢測中,大熊貓牙髓MSCs表達SCFR、CD73和CD90,陰性表達為CD34和SOX-2;在人類牙髓MSCs表型研究中,其表面標(biāo)志物具有非專一性,可同時表達多種細(xì)胞的標(biāo)志,包括CD73、CD44、CD90和CD105,來自不同組織的MSCs可能表達不同的特異性表面標(biāo)志物,其分子機制有待研究[11]。

研究表明,MSCs是由具有不同分化特征的異質(zhì)細(xì)胞群組成,從嚙齒動物和人類中分離的MSCs可以分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞[12-14]。在本試驗中,大熊貓不同組織來源的MSCs均被成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,表明其具有多向分化的潛能。

本試驗通過組織塊和酶消化法處理秦嶺大熊貓骨髓、牙髓和脂肪組織,獲得了各組織來源的MSCs。秦嶺大熊貓不同組織來源MSCs表達不同表面標(biāo)志基因,其中骨髓來源MSCs陽性表達為CD73、CD90、SOX-2和SCFR,陰性表達為CD34;牙髓來源MSCSs表面標(biāo)志物中陽性表達為SCFR、CD90和CD73,陰性表達為CD34和CD31;大熊貓脂肪來源MSCS表面標(biāo)志物中陽性表達為CD73、CD90和GNL3,陰性表達為CD34和CD31。對秦嶺大熊貓骨髓、牙髓和脂肪來源MSCs誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示其均具有多向分化的潛能,為大熊貓的種質(zhì)資源保護與干細(xì)胞治療奠定了種子細(xì)胞基礎(chǔ)。