正交試驗法優(yōu)選蜜升麻的炮制工藝研究*

卞 理，李文強(qiáng)

（1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇 南通 226000；2.南通三越中藥飲片有限公司，江蘇 南通 226371）

升麻為毛莨科植物大三葉升麻（Cimicifuga heracleifoliaKom.）、興安升麻[Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.]或升麻（Cimicifuga foetidaL.）的干燥根莖。歷代本草中記載有凈制、切制、酒制、鹽制、醋制、黃精汁制、姜汁制、炒黃、蒸制、焙、蜜炙11種炮制方法和品種，然而傳承至今的僅有升麻、蜜升麻、升麻炭、酒升麻、炒升麻5種[1]。升麻生用升散作用甚強(qiáng)，以解表透疹、清熱解毒之力勝；蜜炙后辛散作用減弱，升陽作用緩和而較持久，并且對胃的刺激性減弱[2-3]。

2020年版《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》[4]規(guī)定，蜜炙后升麻中酚酸類化合物異阿魏酸含量應(yīng)比生品升麻高，但實驗研究和生產(chǎn)實際表明，與升麻生品比較，蜜升麻中異阿魏酸含量明顯降低[5]。經(jīng)蜜炙后，升麻中異阿魏酸的含量會發(fā)生改變，這對于升麻質(zhì)量檢測、藥用價值和臨床療效都有很大影響。為盡可能地降低這種變化，以保證其質(zhì)量和藥效，本研究通過正交試驗，以加熱溫度、加熱時間、悶潤時間作為考察因素，每一因素設(shè)4個水平，以蜜升麻中的異阿魏酸含量、性狀外觀評分的綜合評分作為指標(biāo)進(jìn)行考察，確定蜜炙法炮制升麻的最佳炮制工藝，以期為蜜升麻的炮制生產(chǎn)及炮制工藝的研究提供指導(dǎo)意義和數(shù)據(jù)支持[6-9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BT125D型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；FA2004型萬分之一分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器儀器）；AP-01P型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Uitimate3000型高效液相色譜儀（賽默飛Thermo Fisher Scientific）；YFR-3503型電磁爐（佛山市俏廚電器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（南通儀器嘉程有限公司）。

1.2 藥物與試劑 升麻飲片（批號：220411，產(chǎn)地：黑龍江）購自黑龍江國藥藥材有限公司，經(jīng)南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心龔旭東主任中藥師鑒定為興安升麻[Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.]的干燥根及根莖。異阿魏酸對照品（批號：111698-201904，純度：99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷、甲醇、乙醇均為分析純，乙腈為HPLC級（≥99.9%），磷酸為優(yōu)級純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蜜升麻的制備 取煉蜜約62.5 g用適量開水稀釋，加入升麻飲片250 g，攪拌均勻，悶潤60 min。電磁爐炒藥鍋進(jìn)行預(yù)熱，加熱溫度為100 ℃時倒入悶潤好的升麻飲片，計時并不停翻炒，炒至90 s時取出，晾涼[10]。

2.2 異阿魏酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 Syncronis C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水（75∶25），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；檢測波長為321 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取異阿魏酸對照品5.06 mg置于25 mL容量瓶中，加10%乙醇稀釋至刻度線，超聲處理30 min，得到質(zhì)量濃度為202.40 μg/mL的異阿魏酸對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取蜜升麻粉末（過二號篩）約0.5 g，置具塞錐形瓶中，用移液管精密加入10%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，100 ℃水浴加熱回流2.5 h，取出，在冷水中放冷，再稱定質(zhì)量，用膠頭滴管滴加10%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用玻璃漏斗和濾紙過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。異阿魏酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按異阿魏酸計算不低于5 000，說明在選定的色譜條件下，測定效果良好。

圖1 HPLC 圖

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取質(zhì)量濃度為202.40 μg/mL異阿魏酸對照品溶液適量，依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.81、2.02、4.05、8.10、20.24、101.20、202.40 μg/mL的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值。以異阿魏酸對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=4 542.25X+1 052.1（r=0.999 8），表明異阿魏酸在0.81～202.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積值。結(jié)果峰面積的RSD值為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，每次10 μL，記錄峰面積值。結(jié)果峰面積的RSD值為0.78%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 重復(fù)性試驗 取蜜升麻粉末，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值。結(jié)果峰面積的RSD值為1.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗 取蜜升麻粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入精密量取的一定體積異阿魏酸對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值。結(jié)果異阿魏酸的平均加樣回收率為101.50%，RSD值為1.66%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。（見表1）

表1 異阿魏酸加樣回收率試驗結(jié)果 （n＝6）

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗設(shè)計 取16份升麻飲片，每份250 g[11-12]。按“2.1”項下方法制備蜜升麻。以蜜升麻的異阿魏酸含量和性狀外觀評分的綜合評分為指標(biāo)，選擇加熱溫度（A）、加熱時間（B）、悶潤時間（C）3個指標(biāo)作為考察因素，每一因素設(shè)4個水平，設(shè)計正交試驗。蜜升麻工藝因素水平表見表2。

表2 蜜升麻工藝因素水平表

2.3.2 考察指標(biāo)

2.3.2.1 異阿魏酸含量 按照“2.2”項下異阿魏酸含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 蜜升麻工藝正交試驗結(jié)果

2.3.2.2 性狀外觀評分 參照1988年版《全國中藥炮制規(guī)范》[13]蜜升麻“性狀”項下規(guī)定：形如升麻片，表面黃棕色或棕褐色，味甜而微苦。將性狀外觀評分標(biāo)準(zhǔn)確定為：黃棕色或棕褐色有光澤為9～15分，黃色或深棕褐色略有光澤為4～8分，黃白色或棕黑色無光澤為1～3分；不粘手為9～15分，略粘手為4～8分，粘手為1～3分；蜜味濃為7～10分，有蜜味為4～6分，蜜味淡為1～3分。40分為總分，評分結(jié)果見表3。

2.3.2.3 綜合評分 設(shè)定綜合評分滿分為100分，異阿魏酸含量、性狀外觀評分權(quán)重系數(shù)分別為60、40分。評分如下：性狀外觀評分以40分為最高分進(jìn)行評分；綜合評分=異阿魏酸含量/樣品中異阿魏酸最高含量×60+性狀外觀評分。

2.3.3 正交試驗結(jié)果 根據(jù)表3的正交試驗結(jié)果可知，極差值的大小順序為A＞B＞C，即各影響因素的主次順序為加熱溫度、加熱時間、悶潤時間。A、B、C各水平的最大值分別為K2、K2、K3，最優(yōu)組合方案為A2B2C3，即加熱溫度為100 ℃、加熱時間為90 s、悶潤時間為90 min。由表4的方差分析結(jié)果可知，加熱溫度對試驗結(jié)果具有顯著影響，加熱時間、悶潤時間對試驗結(jié)果影響不顯著。

表4 蜜升麻正交試驗方差分析

2.3.4 驗證試驗 分別精密稱取3份蜜升麻粉末，按“2.3.3”得出的最佳炮制工藝條件進(jìn)行驗證試驗，測定異阿魏酸含量、性狀外觀評分及綜合評分。結(jié)果顯示異阿魏酸平均含量為0.26%，RSD為2.25%；性狀外觀平均評分為37分，RSD為3.09%；綜合平均評分為96.56分，RSD為1.30%，表明蜜升麻炮制工藝穩(wěn)定、可靠。（見表5）

表5 蜜升麻驗證試驗結(jié)果 （n=3）

3 討論

酚酸類化合物異阿魏酸為升麻主要活性成分之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，蜜炙過程可使升麻中異阿魏酸含量升高[15]。張慧芳等[16]猜測可能是因為升麻中酚酸類化合物多以酸酯的形式存在，在炮制過程中其酸酯類成分水解生成有機(jī)酸和醇類，從而使異阿魏酸含量升高。但同時，張淑娟等[17]研究表明蜜炙升麻中異阿魏酸含量低于生品。2020年版《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》[4]規(guī)定，升麻蜜炙后所含異阿魏酸（C10H10O4）含量不得少于0.20%，比2020年版《中華人民共和國藥典》[18]中所規(guī)定生品升麻中異阿魏酸含量不得少于0.10%有所升高。升麻中異阿魏酸的含量經(jīng)蜜炙后會改變，這對于升麻質(zhì)量檢測、藥用價值和臨床療效都有很大影響[19-20]。正交試驗結(jié)果顯示，本研究最優(yōu)炮制工藝條件下（加熱溫度100 ℃、加熱時間90 s、悶潤時間90min）制備的各組蜜升麻中異阿魏酸含量均符合2020年版《中華人民共和國藥典》及《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》規(guī)定。

蜜炙法是中藥炮制傳統(tǒng)方法之一，是將凈選或切制后的藥物加入一定量煉蜜拌炒的方法，為蜜制方法之一，傳統(tǒng)的蜜炙方法有蜜浸法、蜜蒸法、蜜煎法、酥蜜法、蜜焙法、蜜炙法等[21-22]。目前還存在以下問題：（1）《中華人民共和國藥典》及地方炮制規(guī)范中蜜炙工藝均沒有具體參數(shù)，所用加熱溫度、加熱時間及悶潤時間均沒有明確規(guī)定，炮制中一直沿用的“文火”“中火”“武火”均無量化指標(biāo)，蜜炙藥物火候難以掌握；（2）使用煉蜜大多沒有按照規(guī)范的“嫩蜜”“中蜜”“老蜜”分級，只有籠統(tǒng)的生蜜、蜜液、蜜、煉蜜等規(guī)定，其炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也各有不同；（3）稀釋煉蜜所加開水量未有具體說明，容易造成久炒不干、產(chǎn)品含水量不達(dá)標(biāo)、貯藏過程中發(fā)霉變質(zhì)等現(xiàn)象；（4）各生產(chǎn)單位炮制水平不一、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問題，導(dǎo)致市場上流通的飲片質(zhì)量參差不齊，臨床療效受到嚴(yán)重影響。

本研究探索并優(yōu)選出蜜升麻的最佳炮制工藝，以期為升麻蜜炙方法的研究、中藥炮制規(guī)范化進(jìn)程的推進(jìn)及市場中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一提供依據(jù)。