煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在卵母細(xì)胞成熟及受精激活中的作用

黃麗雙，劉蕓

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心,福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院,福州 350025)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)簡稱輔酶Ⅱ,廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中尤其是線粒體內(nèi),作為電子轉(zhuǎn)移載體為人們所熟知。線粒體NADP的產(chǎn)生依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶2(NAD kinase 2,NADK2)對NAD的磷酸化[1]。NADP參與線粒體中三磷酸腺苷(ATP)的合成[2],為卵母細(xì)胞受精、胚胎發(fā)育提供所需能量。此外,NADP(H)與NAD(H)對細(xì)胞質(zhì)與線粒體中的氧化還原電勢共同發(fā)揮雙向性作用[3],并進(jìn)一步影響胚胎氧化應(yīng)激水平及其發(fā)育狀況;作為多種細(xì)胞內(nèi)生物酶的底物,NADP可直接調(diào)節(jié)酶的作用[4]。線粒體鈣振蕩與卵母細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩息息相關(guān),NADP在線粒體鈣活動(dòng)中的作用機(jī)制缺乏相關(guān)研究。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),NADP在海星卵母細(xì)胞受精之前就能有效誘導(dǎo)胞漿內(nèi)Ca2+升高[5],但其機(jī)制未明,值得進(jìn)一步研究。

一、NADP參與卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎早期發(fā)育過程中的能量調(diào)節(jié)

線粒體是卵母細(xì)胞胞質(zhì)中含量最豐富的細(xì)胞器。生物氧化的場所在線粒體,由呼吸鏈傳遞。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)-泛醌還原酶位于線粒體的內(nèi)側(cè),還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)常位于線粒體的外側(cè),與NADH具有相同的功能。呼吸鏈中電子由NADPH傳遞給泛醌,線粒體中的NADH/NADPH在氧化磷酸化作用下生成ATP[6]。

NADP參與線粒體呼吸鏈?zhǔn)锹涯讣?xì)胞及早期胚胎所需能量的最直接來源。在胚胎的生發(fā)泡破裂及第一極體的排出這兩個(gè)重要細(xì)胞事件中可觀察到ATP峰的產(chǎn)生。受精后,第二極體排出及原核形成過程中,NADP通過ATP的合成來參與受精過程中的這兩項(xiàng)生理活動(dòng)。在第二極體排出過程中,細(xì)胞質(zhì)的分裂需要微絲協(xié)助并消耗能量;而在雌雄原核的核膜、核孔復(fù)合體的重構(gòu)過程中,也同樣需要微管微絲的協(xié)助并消耗能量[7-8]。已有研究表明,在卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中,ATP含量低會導(dǎo)致染色體分離異常,非整倍體形成[9]。此外,ATP不足還會降低卵母細(xì)胞質(zhì)量,更導(dǎo)致植入前胚胎質(zhì)量及種植率的下降。相反,卵母細(xì)胞和胚胎中ATP含量越高,生殖助孕的患者妊娠結(jié)局越好[10]。來自卵母細(xì)胞線粒體移植的研究證實(shí),將年輕婦女的卵母細(xì)胞線粒體移植到老齡婦女的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中,后者的ATP含量明顯升高,并改善了卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育能力[11]?？梢?線粒體的活性與含量不僅決定卵母細(xì)胞質(zhì)量,還影響卵母細(xì)胞受精及發(fā)育能力,而NADP作為線粒體產(chǎn)能的底物,對卵母細(xì)胞意義重大。

二、NADP對胚胎氧化應(yīng)激水平及其發(fā)育狀況的影響

NADPH作為強(qiáng)還原劑在合成代謝途徑中發(fā)生,NADP/NADPH可反應(yīng)活細(xì)胞中氧化還原電勢[12]。NADP/NADPH比率保持較低,有助于活性氧(ROS)的清除[8,13]。從生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期至MⅡ期(第2次減數(shù)分裂),直至8細(xì)胞之前的胚胎多利用磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)進(jìn)行葡萄糖代謝,并產(chǎn)生NADPH。NADPH可合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)保護(hù)細(xì)胞免受ROS損傷[14]。囊胚期時(shí)胚胎糖酵解阻滯緩解,葡萄糖通過糖酵解途徑氧化生成ATP,同時(shí)產(chǎn)生ROS[15]。線粒體是產(chǎn)生內(nèi)源性ROS的主要場所,也是ROS攻擊的主要靶點(diǎn)。生理狀態(tài)下,ROS在卵母細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的作用,增強(qiáng)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能;但過量ROS對線粒體有毒性作用,主要表現(xiàn)為線粒體膜磷脂被氧化和電子傳遞鏈被破壞,從而影響細(xì)胞色素C氧化酶和ATP合成酶的活性,使氧化磷酸化不能正常進(jìn)行,ATP產(chǎn)生迅速減少,并引起線粒體進(jìn)一步的損傷[15],從而可導(dǎo)致卵母細(xì)胞脆弱性增加,導(dǎo)致紡錘體不穩(wěn)定、染色體異常、端?？s短以及衰老的卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降[16]。研究顯示,高蔗糖飲食的嚙齒動(dòng)物與禁食的嚙齒動(dòng)物相比,胞質(zhì)溶膠中的未結(jié)合NADP/NADPH比率增加近五倍至八倍[17];而肥胖中常見的脂質(zhì)和吡啶核苷酸代謝紊亂會損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣吸收,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、破壞鈣穩(wěn)態(tài)[18-19]。在衰老、腫瘤與炎癥反應(yīng)過程中,無論是病理機(jī)制研究或是治療,NADP作為NAD的代謝產(chǎn)物,其抗氧化、修復(fù)作用越來越受各個(gè)領(lǐng)域的關(guān)注[20]。

三、NADP參與卵母細(xì)胞內(nèi)多種代謝通路的調(diào)節(jié)

NADP參與卵母細(xì)胞氧化代謝相關(guān)途徑。Downs等[21]在1999年研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用NADP依賴酶抑制劑作用于PPP時(shí),小鼠卵丘復(fù)合物(COC)成熟度降低,這意味著該途徑的葡萄糖代謝對減數(shù)分裂誘導(dǎo)至關(guān)重要。此外,在牛COC及豬COC中同樣有報(bào)道,PPP通路影響卵細(xì)胞核成熟等進(jìn)而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量[22-23],PPP可能參與減數(shù)分裂所有階段的進(jìn)展,包括減數(shù)分裂的恢復(fù)、MI～MⅡ過渡和受精后減數(shù)分裂的恢復(fù)[23]。有研究發(fā)現(xiàn),NADP處理后的體外成熟牛卵母細(xì)胞雖然完成了減數(shù)分裂和胞質(zhì)成熟過程,但NADP通過刺激PPP通路增加氧化和線粒體活性,并延遲線粒體遷移,使囊胚形成率下降[24];同樣地,關(guān)于豬COC的體外成熟培養(yǎng)研究中也得出了與上述牛卵母細(xì)胞較為一致的結(jié)果[25],提示NADP的添加影響了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

據(jù)報(bào)道,在體外成熟的牛卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中,參與氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)的NADP依賴的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)單位保持恒定,并在卵母細(xì)胞中檢測到高NADP-IDH活性;另外,添加異檸檬酸+NADP的成熟培養(yǎng)基可增加成熟卵母細(xì)胞的百分比,而將NADP換成檸檬酸鹽的情況下,不能提高卵母細(xì)胞的成熟率,說明NADP在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要作用[26]。

四、NADP對卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子的作用

NADP是煙酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP)的類似物,還是NAADP的前體,CD38催化NADP合成NAADP[27]。NAADP也是第二信使,可從細(xì)胞內(nèi)鈣庫動(dòng)員鈣離子,調(diào)節(jié)鈣離子信號傳導(dǎo)。目前研究結(jié)果顯示,NAADP介導(dǎo)的Ca2+動(dòng)員可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的Ca2+動(dòng)員完全不同,是一種來源于酸性細(xì)胞器上的ATP依賴性的Ca2+攝取,可能有未知機(jī)制參與其中[28-30]。研究發(fā)現(xiàn),NADP通過CD38合成的NAADP可介導(dǎo)溶酶體Ca2+信號失調(diào),造成神經(jīng)元功能障礙,在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[31];但NADP本身在神經(jīng)退行性疾病中的作用有待進(jìn)一步發(fā)掘。Takahashi等[5]研究發(fā)現(xiàn),在生發(fā)泡破裂(GVBD)前的成熟卵母細(xì)胞存在三磷酸肌醇誘導(dǎo)的鈣釋放(IICR)以外的Ca2+釋放機(jī)制,依賴于NADP的鈣釋放;成熟卵母細(xì)胞中NADP依賴性Ca2+釋放本身并不能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟,其發(fā)展可能歸因于成熟相關(guān)的胞漿Ca2+和pH值的增加,該過程可能代表卵母細(xì)胞對促卵母細(xì)胞成熟激素的生理反應(yīng)。

線粒體Ca2+攝取的主要來源為卵母細(xì)胞內(nèi)作為鈣儲庫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間Ca2+傳遞異?？赏瑫r(shí)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體應(yīng)激,在卵泡的選擇性發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮間接作用[32]。但NADP作為線粒體氧化磷酸化底物,在其中的作用機(jī)制缺乏相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn),線粒體可調(diào)節(jié)受精過程中的鈣振蕩,通過增加鈣振蕩來誘發(fā)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[33-35],而線粒體產(chǎn)生ATP又可以支持胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子迅速轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,維持鈣振蕩正常模式[36-37]。同時(shí),線粒體在Ca2+振蕩過程中吸收Ca2+,啟動(dòng)自身振蕩,刺激線粒體氧化還原狀態(tài),增加GV期卵母細(xì)胞的ATP水平[38];線粒體Ca2+超載可導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激和減數(shù)分裂恢復(fù)延遲[39]。研究發(fā)現(xiàn),Erastin和CGP37157均可顯著抑制線粒體Ca2+通道,可使卵母細(xì)胞原核形成發(fā)育受阻[40]。已有許多研究發(fā)現(xiàn)衰老對鈣振蕩模式的影響,如老化影響鈣瞬變的頻率、振幅、持續(xù)時(shí)間和鈣離子增加/減少的動(dòng)力學(xué)、鈣離子振蕩的總持續(xù)時(shí)間。近年來研究者們發(fā)現(xiàn)衰老會降低線粒體的功能,影響受精后卵母細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的分布,從而影響ATP依賴的Ca2+瞬變的產(chǎn)生,并由此解釋Ca2+振蕩模式的一些改變[41]。

綜上所述,NADP不僅于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)表現(xiàn)得相當(dāng)活躍,是細(xì)胞內(nèi)新陳代謝良好的表征,而且對于早期胚胎細(xì)胞中的氧化還原電勢平衡也起到了很重要的作用,是抵御胚胎氧化損傷的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中,NADP可充當(dāng)NAADP合成底物誘發(fā)鈣信號,在海星卵母細(xì)胞中也可引發(fā)鈣釋放,其具體作用機(jī)制不明。此外,NADP還可通過線粒體調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩、維持鈣穩(wěn)態(tài)。我們有充足的理由相信,NADP在卵母細(xì)胞成熟及受精激活過程中起到了至關(guān)重要的作用。然而,目前有關(guān)NADP對卵母細(xì)胞的直接影響的報(bào)道仍較少,尤其是NADP影響卵母細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩模式的作用機(jī)制仍未可知。進(jìn)一步探究NADP對卵母細(xì)胞成熟、受精激活的具體作用機(jī)制有助于增進(jìn)對卵母細(xì)胞發(fā)育的了解。