非梗阻性無(wú)精子癥與正常人睪丸間質(zhì)細(xì)胞差異表達(dá)基因及核心基因的生物信息學(xué)分析

薛雨非，師帥，柳祖波，余蔓妮

(金華市人民醫(yī)院生殖中心,金華 321000)

大約10%～15%的育齡夫婦罹患不孕不育,其中男性不育約占35%～50%[1]。男性不育與性功能障礙、精索靜脈曲張、生殖系統(tǒng)感染、內(nèi)分泌、梗阻性無(wú)精子癥(OA)、非梗阻性無(wú)精子癥(NOA)等密切相關(guān)[2]。NOA在男性中的發(fā)病率約為1%,占不育男性的10%～15%,是男性不育最為重要的病因之一[3]。NOA研究較多的包括染色體異常、Y染色體微缺失和表觀遺傳學(xué)等,但大約70%的NOA原因仍然是未知的。NOA患者睪丸的病理特征是沒(méi)有或很少生精細(xì)胞,但10%的患者通過(guò)手術(shù)可以發(fā)現(xiàn)生精細(xì)胞,并通過(guò)輔助生殖技術(shù)可能獲得生育[4]。

精子發(fā)生依賴(lài)于睪丸細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定,睪丸的微環(huán)境改變可能會(huì)影響生育能力[5]。目前我們對(duì)睪丸細(xì)胞微環(huán)境的了解有限,微環(huán)境細(xì)胞的異質(zhì)性,以及在分子水平上NOA患者與正?？缮巳褐g細(xì)胞類(lèi)型的差異知之甚少,這都影響我們對(duì)NOA發(fā)病機(jī)制的理解。單細(xì)胞RNA測(cè)序的快速發(fā)展使我們能夠更好研究睪丸的單個(gè)細(xì)胞群。以往的大多數(shù)研究都針對(duì)生殖細(xì)胞群本身,較少研究睪丸的微環(huán)境體細(xì)胞群[6]。最近一項(xiàng)關(guān)于青春期人類(lèi)睪丸單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究揭示了睪丸體細(xì)胞的發(fā)育變化[7];另一項(xiàng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究揭示了睪丸支持細(xì)胞在NOA中的關(guān)鍵作用。尚未見(jiàn)有關(guān)睪丸間質(zhì)細(xì)胞群和NOA的關(guān)聯(lián)性研究[8]。

為探討睪丸間質(zhì)細(xì)胞群在NOA患者睪丸精子發(fā)生障礙中的作用,本文通過(guò)整合分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的多個(gè)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù),鑒定出在NOA患者中占比較高的細(xì)胞,然后分析這類(lèi)細(xì)胞在NOA患者和正?？缮巳褐g的差異表達(dá)基因,緊接著對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析,最后通過(guò)差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和鑒定出核心基因。本研究結(jié)果有助于探討睪丸細(xì)胞微環(huán)境對(duì)精子發(fā)生的作用和潛在的NOA發(fā)病新機(jī)制,為后續(xù)NOA細(xì)胞微環(huán)境研究和核心基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

資料和方法

一、數(shù)據(jù)來(lái)源

GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是一個(gè)全球免費(fèi)的公共基因組數(shù)據(jù)庫(kù),包含豐富的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)。本次研究的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于GSE149512數(shù)據(jù)集,選取無(wú)生精障礙的人群為正常組,NOA患者為NOA組。

二、研究方法

1.單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的細(xì)胞聚類(lèi)和注釋以及差異表達(dá)基因的篩選:運(yùn)用R軟件(版本4.02)中的Seurat包(版本4.0)整合分析GSE149512的數(shù)集,經(jīng)過(guò)一系列的數(shù)據(jù)過(guò)濾、質(zhì)控、歸一化、主成份分析,并采用非線性降維UMAP的方法進(jìn)行細(xì)胞聚類(lèi)分析。通過(guò)Find All Markers函數(shù),獲取細(xì)胞聚類(lèi)的Marker基因,并查詢(xún)Human Cell Landscape(HPL)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)胞注釋,并繪制差異表達(dá)基因的可視化熱圖。

2.差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG通路分析:運(yùn)用Cytoscape軟件(3.6.1版)的ClueGO和CluePedia插件對(duì)差異表達(dá)基因的進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析。

3.蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的鑒定:通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org),構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),并且把互作綜合評(píng)分定為大于等于0.4;隨后,將String分析后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,再次可視化PPI網(wǎng)絡(luò);然后,運(yùn)用CytoHubba插件中的5種運(yùn)算方法(Degree、DMNC、EPC、MCC、MNC)識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因;選取75個(gè)核心基因(每種算法中前15個(gè)核心基因)繪制韋恩圖。

結(jié) 果

一、單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集的整合分析

整合GSE149512數(shù)據(jù)集,最終形成1個(gè)由39 392個(gè)細(xì)胞、40 210個(gè)基因、31個(gè)聚類(lèi)細(xì)胞構(gòu)成的數(shù)據(jù)集(圖1A)。其中,NOA組有17 415個(gè)細(xì)胞,正常組有21 977個(gè)細(xì)胞,聚類(lèi)細(xì)胞的分布情況見(jiàn)圖2B。通過(guò)Find All Markers函數(shù)識(shí)別出聚類(lèi)細(xì)胞的Marker基因,結(jié)合HPL數(shù)據(jù)庫(kù),31個(gè)聚類(lèi)細(xì)胞鑒定為10種類(lèi)型睪丸細(xì)胞(圖1C)。NOA組的細(xì)胞主要由體細(xì)胞構(gòu)成,其睪丸間質(zhì)細(xì)胞占比最高,為44.4%(7 736/17 415)(圖1D、E)。

二、兩組間睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的差異表達(dá)基因分析

睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要由5個(gè)聚類(lèi)細(xì)胞(聚類(lèi)0、3、5、15、22)和11 284個(gè)細(xì)胞構(gòu)成,其中NOA組的睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要由聚類(lèi)0和聚類(lèi)3細(xì)胞構(gòu)成(圖2A、B)。接著,提取數(shù)據(jù)集的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)分類(lèi),經(jīng)過(guò)質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)化,降維后出現(xiàn)10個(gè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞聚類(lèi)(圖2C),并顯示出NOA組和正常組中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞有顯著差異(圖2D、E)。我們進(jìn)一步通過(guò)條件為P<0.01、avg LogFC>1的過(guò)濾方式,分析兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞的差異表達(dá)基因情況,總共得到145個(gè)差異表達(dá)基因:與正常組相比較,NOA組上調(diào)的基因82個(gè),下調(diào)的基因63個(gè)。熱圖顯示30個(gè)差異顯著的基因(圖2F)。

A:整合數(shù)據(jù)中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分布;B:兩組間睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分布;C:再聚類(lèi)后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分布;D:兩組間細(xì)胞聚類(lèi)的分布;E:兩組間睪丸間質(zhì)細(xì)胞的差異;F:熱圖。圖2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞在NOA和正常人群中的差異表達(dá)基因分析

三、差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

為了探究睪丸間質(zhì)細(xì)胞在正常人群和NOA人群的差異,我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示,在生物學(xué)過(guò)程方面,睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮作用較多,且在免疫抗原提呈功能方面也發(fā)揮著重要作用;在細(xì)胞組分方面,主要在細(xì)胞膜、胞質(zhì)和核糖體中發(fā)揮作用;在分子功能方面,主要發(fā)揮細(xì)胞周期蛋白激酶的調(diào)控、核苷核酸的鏈接等作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示,主要通過(guò)病毒感染,炎癥細(xì)胞因子等通路發(fā)揮顯著作用(圖3)。

A:生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果;B:細(xì)胞組分分析結(jié)果;C:分子功能分析結(jié)果;D:KEGG通路分析結(jié)果。圖3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

四、構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)和鑒定核心基因

我們將這些差異表達(dá)基因映射到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),然后,將這些交互網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)重新導(dǎo)入到Cytoscape軟件中,最終構(gòu)成了158個(gè)點(diǎn)和2 132條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4A);我們通過(guò)CytoHubba插件中的5種分類(lèi)算法,獲取每種算法Top 15的核心基因(圖4B～F);最后,整合這些基因,在3種算法以上重疊出現(xiàn)的基因有以下 10個(gè):RPS2、RPS3、RPS9、RPS11、RPS12、RPS27A、RPL7、RPL8、RPL37、UBA52,這10個(gè)基因被認(rèn)為是核心基因(表1、圖4 G),這些基因基本屬于核糖體蛋白類(lèi)基因,其中RPS11基因在4種算法中均有出現(xiàn)。

表1 10個(gè)核心基因的信息匯總列表

A:PPI網(wǎng)絡(luò)圖(紫色圓圈基因是候選關(guān)鍵基因);B:依據(jù)Degree算法遴選出的前15基因;C:依據(jù)DMNC算法遴選出的前15基因;D:依據(jù)EPC算法遴選出的前15基因;E:依據(jù)MCC算法遴選出的前15基因;F:依據(jù)MNC算法遴選出的前15基因;G:韋恩圖。圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心基因的鑒定

討 論

一、NOA患者不易早期診斷

睪丸體細(xì)胞微環(huán)境對(duì)生殖細(xì)胞的作用,就像土壤對(duì)種子發(fā)芽的作用一樣,為精子發(fā)生提供必要的支持和營(yíng)養(yǎng)成分[19]。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明人類(lèi)睪丸體細(xì)胞群具有高度異質(zhì)性,但是我們對(duì)睪丸微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)的認(rèn)識(shí)仍很有限,影響了對(duì)男性不育的理解[20]。在我們國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究中,生育障礙的男性大約23.5%是由于染色體異常和Y染色體微缺失造成的,大部分的NOA患者存在病因未明的現(xiàn)狀[21]。但是大部分患者診斷為NOA時(shí),已經(jīng)到了育齡階段,很少在青春期能診斷明確,因此關(guān)鍵差異表達(dá)基因有潛力為NOA的早期診斷提供有力的手段。

二、睪丸間質(zhì)細(xì)胞在精子發(fā)生中起到重要作用

睪丸體細(xì)胞群包括間質(zhì)細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和支持細(xì)胞,構(gòu)成睪丸的細(xì)胞微環(huán)境或生態(tài)位,在正常精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用[22]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸間質(zhì)的重要組成部分[23-24],通過(guò)分泌雄性激素參與調(diào)控精子發(fā)生,并可以通過(guò)影響白介素1α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)、抑制素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)、胰島素樣肽3(INSL3)、雌激素和甲狀腺激素等生長(zhǎng)因子和類(lèi)固醇激素發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-26]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良和不發(fā)育為睪丸間質(zhì)細(xì)胞先天性發(fā)育不良和不發(fā)育,不能合成與分泌睪酮,致使生殖管道與外生殖道女性化,已被認(rèn)為是男性假兩性畸形的原因之一。成年型的睪丸間質(zhì)細(xì)胞不發(fā)育亦被描述,其發(fā)病率尚不清。睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能受損可導(dǎo)致雄激素分泌異常,并影響性別分化、性腺發(fā)育和精子發(fā)生。我們研究發(fā)現(xiàn),GSE149512資料庫(kù)中關(guān)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)占比非常高(44.4%),間接證明了其在精子發(fā)生中的重要性。

三、兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞存在差異

分析NOA和正常人群睪丸間質(zhì)細(xì)胞間共有145個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)的基因82個(gè)、下調(diào)的基因63個(gè)。GO富集分析結(jié)果顯示,這些差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞質(zhì)的核糖體中發(fā)揮細(xì)胞周期蛋白激酶的調(diào)控、核苷核酸的鏈接等分子功能。KEGG通路分析顯示,主要富集在炎癥細(xì)胞因子等通路。隨后繼續(xù)使用差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),整合5種算法的前15個(gè)基因,最終獲取到10個(gè)核心基因,這10個(gè)基因主要是核糖體蛋白相關(guān)的基因。核糖體是高度復(fù)雜的翻譯機(jī)器,已被證明在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成方面具有異質(zhì)性,其主要通過(guò)共翻譯方式調(diào)控男性生殖細(xì)胞特異性蛋白的折疊,這些蛋白對(duì)精子的形成至關(guān)重要。在我們的研究中,RPS11出現(xiàn)的頻次最高,預(yù)示著RPS11可能通過(guò)睪丸間質(zhì)細(xì)胞影響精子的發(fā)生。RPS11是核糖體小亞基40S的組成部分,屬于核糖體蛋白S17p家族,由RPS11基因所編碼,主要存在于真核生物中[27]。該基因與小核糖核酸基因U35B共同轉(zhuǎn)錄,后者位于第3內(nèi)含子中。正如編碼核糖體蛋白的基因所特有的那樣,這個(gè)基因有多個(gè)加工過(guò)的假基因,分散在整個(gè)基因組中。其相關(guān)機(jī)制是肽鏈延長(zhǎng)和CAP帽結(jié)合形成復(fù)合物后激活mRNA,并隨后與43S結(jié)合發(fā)揮其作用。目前鮮見(jiàn)報(bào)道RPS11和男性不育之間的相關(guān)性研究,Bansal等[28]研究表明,與正常對(duì)照組比較,弱精子癥組的RPS11顯著降低,無(wú)精子癥組顯著升高。本文結(jié)果與上述結(jié)果一致,并精準(zhǔn)提示,RPS11基因的差異表達(dá)主要體現(xiàn)在睪丸間質(zhì)細(xì)胞。

本文的不足主要是只分析了NOA組比例最高的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,未能全面分析睪丸體細(xì)胞,此外通過(guò)生物信息學(xué)鑒定的核心基因亦未通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。后期我們將針對(duì)這些不足,更加全面的分析NOA和正常人群在不同睪丸體細(xì)胞的差異表達(dá)基因,及其相關(guān)功能驗(yàn)證。