略陽(yáng)烏雞褐殼蛋殼顏色量化體系的建立和遺傳基礎(chǔ)分析

陳球，黃晶晶，王哲鵬

略陽(yáng)烏雞褐殼蛋殼顏色量化體系的建立和遺傳基礎(chǔ)分析

陳球，黃晶晶，王哲鵬

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100

【背景】褐殼蛋殼顏色與蛋殼強(qiáng)度、蛋內(nèi)抗菌肽含量、血斑肉斑和孵化率有密切聯(lián)系，是影響蛋品質(zhì)和銷售的一個(gè)重要的指標(biāo)。然而，一些地方雞因選育程度低，存在蛋色偏淺、均勻度差等不足，給雞蛋的銷售和品牌的打造造成不利影響?！灸康摹刻接懸月躁?yáng)烏雞為對(duì)象，建立能靈敏度量蛋殼顏色變異的量化體系，估計(jì)品種特異性蛋殼顏色的遺傳力，篩選參與蛋殼顏色調(diào)控的候選基因，為略陽(yáng)烏雞褐殼蛋殼顏色選育奠定理論基礎(chǔ)。【方法】在略陽(yáng)烏雞蛋用系62個(gè)半同胞家系中選取841只母雞，每只雞收集3枚蛋，用L*a*b色度體系量化蛋殼顏色。在貝葉斯框架下，用馬爾可夫鏈蒙特卡羅（Markov Chain Monte Carlo, MCMC）算法計(jì)算各色度指標(biāo)的后驗(yàn)遺傳力。用逆γ分布指定育種值和殘差方差的先驗(yàn)分布。執(zhí)行130 000迭代，棄去前30 000次迭代結(jié)果，按間隔100存儲(chǔ)迭代結(jié)果，獲得各方差組分的后驗(yàn)分布和各指標(biāo)的后驗(yàn)遺傳力。選取產(chǎn)淺褐殼、褐殼、淺綠殼的母雞各8只，每只雞收集3枚蛋用于蛋殼色素含量的測(cè)定。用原卟啉和膽綠素標(biāo)準(zhǔn)品建立濃度與吸光度值的回歸關(guān)系，分別在670 nm和412 nm處測(cè)定膽綠素和原卟啉的吸光度，用回歸法求得待測(cè)樣本兩種蛋殼色素的濃度。采集褐殼（n=8）和淺褐殼（n=8）母雞的蛋殼腺，用qPCR法檢測(cè)和在蛋殼腺中的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】在3個(gè)色度指標(biāo)中，a值遞減的變化規(guī)律與褐色向綠色調(diào)過渡的視覺觀感吻合度最高。L值和b值能夠反映褐殼顏色深淺的變化，但在區(qū)分褐色和綠色調(diào)上存在較大誤差。L值和b值分布呈現(xiàn)出較高的集中度，50%的樣本的L值和b值集中分布于73.3—79.1和13.1—18.2之間，而a值分布更為分散，50%的樣本分布于1.4—7.1之間。與上述分布特征保持一致，a值的變異系數(shù)88.2%要高于L值5.7%和b值24.0%。遺傳力估計(jì)結(jié)果顯示，a值主要受遺傳效應(yīng)調(diào)控（h2=0.77），而L值（h2=0.46）和b值（h2=0.37）受環(huán)境效應(yīng)影響更大。在蛋殼色素和蛋殼顏色之間，原卟啉濃度與3個(gè)色度指標(biāo)均存在強(qiáng)相關(guān)關(guān)系（L:=-0.86，a:=0.73, b:=0.88），但膽綠素濃度僅與a值存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)（=-0.73）。和是兩個(gè)催化原卟啉前體物合成的酶。表達(dá)結(jié)果顯示，在褐殼雞中的表達(dá)水平是淺褐殼的1.5倍（＜0.05），但的表達(dá)量無顯著差異（＞0.05）?！窘Y(jié)論】原卟啉是影響略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的關(guān)鍵色素，而是與蛋殼原卟啉含量和褐殼顏色顯著關(guān)聯(lián)的候選基因。a值是量化略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色準(zhǔn)確度和靈敏度最高的指標(biāo)，且具有較高的遺傳力。對(duì)a值向上選擇，有望在提高褐殼顏色深度和均勻度方面取得較大選擇反應(yīng)。

略陽(yáng)烏雞；蛋殼顏色；L*a*b色度空間；遺傳力；；

0 引言

【研究意義】褐殼蛋因蛋殼質(zhì)量好、蛋內(nèi)抗菌蛋白含量高、孵化率高，在我國(guó)禽蛋市場(chǎng)中占主導(dǎo)地位[1-4]。但是，一些地方雞由于選育程度低，蛋殼顏色存在較大的變異，給雞蛋的銷售和品牌的創(chuàng)立造成極為不利的影響。在闡明蛋殼顏色遺傳調(diào)節(jié)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立科學(xué)的育種方案，培育蛋色均一、色澤美觀的褐殼品種，對(duì)地方雞資源的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在野生鳥類中，蛋殼顏色是變異十分豐富的一個(gè)性狀[5]。它在偽裝[6]、阻擋太陽(yáng)輻射[7]、調(diào)節(jié)蛋溫[8]、增加蛋殼強(qiáng)度[9]和吸引雄鳥參與孵化[10]等方面發(fā)揮了重要的作用。在家禽中，由于人工選擇，蛋殼顏色被固定為白殼、粉殼、褐殼、綠殼幾種顏色。蛋殼顏色是由沉積于蛋殼中的色素引起。原卟啉Ⅸ和膽綠素Ⅸ是兩種主要的蛋殼色素，前者負(fù)責(zé)紅褐的蛋殼著色，后者負(fù)責(zé)藍(lán)綠的蛋殼著色[11]。這些色素在蛋形成的最后階段由蛋殼腺分泌到蛋殼上，引起各種顏色、各種斑紋的蛋殼著色[11-12]。雖然年齡、藥物、疾病、應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)等非遺傳因素對(duì)蛋殼顏色均可產(chǎn)生不同程度的影響[1,13]，但蛋殼顏色仍屬于主要受遺傳效應(yīng)調(diào)控的性狀。雞和鴨的綠殼表型均被證實(shí)是由色素轉(zhuǎn)運(yùn)基因突變引起，屬于單基因控制的顯性性狀[14-15]。但是，褐殼的遺傳機(jī)制目前尚不清楚。通過QTL定位，研究人員在雞的1、2、4和11號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)4個(gè)QTL與蛋殼顏色有關(guān)[16-18]。蛋殼腺表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，原卟啉前體物合成基因、和轉(zhuǎn)運(yùn)基因、、在深褐殼和淺褐殼間均存在顯著表達(dá)差異[19-20]。但是，Zheng等[21]在比較白殼、粉殼和褐殼雞和的表達(dá)量時(shí)卻并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。在用尼卡巴嗪構(gòu)建的褐殼蛋褪色模型中，、、的表達(dá)量與蛋殼顏色變化關(guān)系也未得到證實(shí)，只有的差異表達(dá)的結(jié)果得到重復(fù)[22]。除了蛋殼腺差異表達(dá)基因外，肝臟差異表達(dá)基因與蛋殼原卟啉合成和褐殼著色也有密切聯(lián)系[23]。鑒于QTL定位和表達(dá)研究難以鎖定主效基因，研究人員通過估計(jì)蛋殼顏色的遺傳力對(duì)遺傳效應(yīng)的總體作用進(jìn)行了定量評(píng)估。在用L*a*b體系量化蛋殼顏色后，研究人員在橫斑洛克、洛島紅及白來航與東鄉(xiāng)綠殼雞的雜交群體中獲得了較高的色度指標(biāo)遺傳力估計(jì)結(jié)果（L：0.64—0.74，a：0.42—0.64，b：0.55—0.6）[24-25]，Cavero等在羅曼褐中發(fā)現(xiàn)褐殼表型為中等遺傳力（0.33—0.46）性狀[26]，但Kamanli在橫斑洛克中估計(jì)的色度指標(biāo)遺傳力僅為0.2左右[27]。這些研究表明，與單基因調(diào)控的綠殼表型相比，褐殼有著更為復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)。在不同品種，甚至不同環(huán)境下，對(duì)褐殼顏色發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的遺傳機(jī)制可能并不相同。【本研究切入點(diǎn)】略陽(yáng)烏雞是一個(gè)產(chǎn)自陜西略陽(yáng)縣一帶的地方品種。該品種因蛋肉品質(zhì)優(yōu)良、藥食同源等優(yōu)點(diǎn)而深受消費(fèi)者的喜愛[28]。略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色以褐色調(diào)為主，有少部分個(gè)體產(chǎn)顏色偏綠的蛋。蛋殼顏色在整個(gè)產(chǎn)蛋周期中維持穩(wěn)定，但在個(gè)體之間呈現(xiàn)出由淺到深的連續(xù)性變異。這些表型特征肯定了遺傳效應(yīng)對(duì)蛋殼顏色的決定作用。但是，我們尚缺乏對(duì)遺傳效應(yīng)的定量認(rèn)識(shí)，也不清楚之前報(bào)道的候選基因與褐殼顏色的關(guān)系在略陽(yáng)烏雞中是否也存在。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在用L*a*b體系量化略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的基礎(chǔ)上，研究了3個(gè)色度指標(biāo)的分布特征和與蛋殼色素含量的相關(guān)性，估計(jì)了L, a, b值的遺傳力，分析了和表達(dá)量與褐殼顏色深淺的關(guān)系，期望建立對(duì)蛋殼顏色變化有較高靈敏度和準(zhǔn)確度的量化體系，獲得品種特異性色度指標(biāo)遺傳力估計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)參與略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色調(diào)控的候選基因，為略陽(yáng)烏雞褐殼性狀的選育提純奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 略陽(yáng)烏雞的飼養(yǎng)

從略陽(yáng)烏雞蛋用系核心群四世代62個(gè)半同胞家系中隨機(jī)選取841只母雞。四世代母雞出殼時(shí)間為2019年12月，淘汰時(shí)間為2020年10月，在略陽(yáng)縣龍昊烏雞種源繁育中心飼養(yǎng)。育雛期（0—6周齡）采用籠養(yǎng)育雛，養(yǎng)殖密度為40—60只/m2，育雛溫度28—33 ℃，4周齡脫溫，光照時(shí)間18—22 h。在10周齡，將青年雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋雞舍。在產(chǎn)蛋周期內(nèi)，雞舍維持16 h恒定光照，單籠養(yǎng)殖，自由采食、飲水。育雛期（0—6周齡）用全價(jià)配合料（楊凌海大飼料）飼喂，青年期和產(chǎn)蛋期用35%濃縮料（楊凌海大飼料）、60%玉米和5%麩皮混合飼喂，粗蛋白16%—20%，能量12 MJ·kg-1，粗纖維＜5%，鈣0.8%—3.5%，氯化鈉0.7%—1.8%，蛋氨酸＞0.45%，粗灰分＜8%。

1.2 蛋殼顏色的測(cè)定

本研究用L*a*b色度體系量化蛋殼顏色，L為亮度值，取值范圍為0—100，L值越大反映物體的顏色越白，反之越黑；a值為紅綠度值，無取值范圍限制，正值表示物體顏色偏紅，負(fù)值表示顏色偏綠；b值為藍(lán)黃度值，無取值范圍限制，正值表示顏色偏黃，負(fù)值為顏色偏藍(lán)。蛋殼顏色的L, a, b值用MiniScan EZ 4000便攜式分光光度計(jì)（Hunter Associates Laboratory，Inc.）在D65光源和10°入射角條件下測(cè)定。在母雞32周齡時(shí)，每只雞測(cè)定3枚蛋，3枚蛋L, a, b測(cè)定結(jié)果的平均值作為該樣本蛋殼顏色的代表值，用于后續(xù)分析。蛋殼顏色測(cè)定時(shí)間為2020年7月，在略陽(yáng)縣龍昊烏雞種源繁育中心測(cè)定。

1.3 L, a, b值遺傳力估計(jì)

本研究用單變量動(dòng)物模型y=Xb+Za+e估計(jì)L, a, b值的遺傳力，y為L(zhǎng), a, b測(cè)定值向量，X為設(shè)計(jì)矩陣，b為色度指標(biāo)群體均值，Z為育種值效應(yīng)設(shè)計(jì)矩陣，a為各色度指標(biāo)的育種值，e為誤差項(xiàng)[29]。各色度指標(biāo)后驗(yàn)遺傳力在貝葉斯框架下用馬爾科夫鏈蒙特卡洛（Markov Chain Monte Carlo，簡(jiǎn)稱MCMC）算法進(jìn)行估計(jì)，運(yùn)算過程由R語言MCMCglmm軟件完成[30]。育種值及殘差項(xiàng)方差的先驗(yàn)分布由逆γ分布指定，逆γ分布的參數(shù)分別為V=1，nu=0.002[31]。MCMC迭代參數(shù)為nitt=130 000，burnin=30 000，thin=100[31]。迭代結(jié)束后，用posterior.mode命令計(jì)算遺傳力后驗(yàn)分布眾數(shù)，用HPDinterval命令計(jì)算遺傳力的95%置信區(qū)間[31]。

1.4 蛋殼色素含量測(cè)定

從四世代略陽(yáng)烏雞中依據(jù)主觀顏色評(píng)定，挑選產(chǎn)淺褐殼、褐殼和綠殼蛋的略陽(yáng)烏雞各8只。每只雞收集連續(xù)產(chǎn)出的3枚蛋，分離蛋殼，測(cè)定蛋殼原卟啉和膽綠素濃度。3枚蛋的平均值作為該樣本蛋殼色素濃度的代表值。敲破雞蛋，棄蛋液，剝離蛋殼膜，用去離子水洗凈蛋殼，置65 ℃烘箱過夜干燥。每枚蛋稱取0.25 g蛋殼，置于4 mL蛋殼溶解液（無水甲醇﹕37.5%的鹽酸=2﹕1）中，室溫避光過夜，直至蛋殼完全溶解[32]。3 500 r/min離心45 min，取上清液，避光保存?zhèn)錅y(cè)。

將4 mg原卟啉Ⅺ標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）溶解于4 mL蛋殼溶解液中，配成1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液。取0.12 mL儲(chǔ)液與1.88 mL蛋殼溶解液混合配成1×標(biāo)樣（0.06 mg·mL-1），按2倍稀釋倍數(shù)依次稀釋前一標(biāo)樣，配制2-1（0.03 mg·mL-1）— 2-9（0.000117 mg·L-1）標(biāo)樣。將4 mg膽綠素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）溶解于4 mL蛋殼溶解液中配成膽綠素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液。將0.087 mL儲(chǔ)液與1.913 mL蛋殼溶解液混合配成1×膽綠素標(biāo)樣（0.043 mg·mL-1）。按2倍稀釋倍數(shù)依次稀釋前一標(biāo)樣，獲得2-1（0.0215 mg·mL-1）—2-9（0.000084 mg·L-1）標(biāo)樣。取200 μL樣品，用酶標(biāo)儀（BioTek）在412 nm處測(cè)定原卟啉吸光度值，在670 nm處測(cè)定膽綠素吸光度值[32]。依據(jù)標(biāo)樣建立的吸光值與濃度回歸方程，計(jì)算待測(cè)樣本原卟啉和膽綠素的濃度。原卟啉和膽綠素濃度用μg·g-1蛋殼表示。蛋殼色素含量測(cè)定時(shí)間為2021年1月，在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科研平臺(tái)測(cè)定。

1.5 CPOX和ALAS1在蛋殼腺中的表達(dá)量檢測(cè)

將上述參與蛋殼色素濃度測(cè)定的淺褐殼（n=8）和褐殼（n=8）雞宰殺，采集蛋殼腺，置1 mL RNAstore（康為世紀(jì)）中，剪碎組織，在4 ℃浸泡過夜后置-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。取大約100 mg組織樣，吸干RNAstore，用TRNzol Universal總RNA 提取試劑（天根）按操作說明提取蛋殼腺總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，用NanoDrop2000（ThermoFisher Scientific）分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA，用SumOnetube RT Mixture Ⅲ（Summer Biotech）反轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說明合成cDNA。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)和在蛋殼腺中的表達(dá)量。qPCR反應(yīng)體系由1 μL cDNA, 10 μL 2×FastHotstart SYBR QPCR Mixture （Summer Biotech）, 0.4 μL正鏈引物（10 μmol·L-1），0.4 μL反鏈引物（10 μmol·L-1）和8.2 μL ddH2O組成。擴(kuò)增引物為5′-GAGAGGACGGTATGTGGAGT -3′和5′-TTTGGGATTGCGGAGAAC-3′，擴(kuò)增引物為5′-GCATCTATGTCCAAGCAATC-3′和5′-CA ACATCCTTCCATGTAGCC-3′，持家基因擴(kuò)增引物為5′-ATACACAGAGGACCAGGTTG-3′和5′- AAACTCATTGTCATACCAGG-3′。qPCR在LightCycler? 96 System熒光定量PCR儀（Roche）中進(jìn)行。qPCR反應(yīng)條件為95℃變性2 min，（95℃變性10 s，60℃退火10 s，60℃延伸30 s）×40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后執(zhí)行qPCR儀默認(rèn)融解曲線程序，驗(yàn)證qPCR擴(kuò)增的特異性。每個(gè)樣品執(zhí)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以為內(nèi)參基因，以淺褐殼組為對(duì)照，用2-ΔΔCt法以相對(duì)于淺褐殼組表達(dá)倍數(shù)的形式呈現(xiàn)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果。和表達(dá)量檢測(cè)時(shí)間為2020年12月，在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科研平臺(tái)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的量化和變異研究

略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色以褐色調(diào)為主，從褐殼、淺褐殼、白殼到淺綠殼呈現(xiàn)出連續(xù)性變異的特征（圖1-A）。在用L*a*b體系量化蛋殼顏色后，研究發(fā)現(xiàn)a值不僅能靈敏地捕捉到褐殼顏色逐漸變淺的變化規(guī)律，而且能準(zhǔn)確區(qū)分褐色和綠色調(diào)，其逐漸遞減的變化趨勢(shì)與褐殼→淺褐殼→白殼→淺綠殼的視覺觀感最為接近。L值隨褐殼顏色變淺逐漸增大，b值逐漸減?。?#—6#樣本），但L值和b值并不能準(zhǔn)確區(qū)分褐色和綠色調(diào)。例如，3#和12#、5#和10#的L值和b值較為接近，但在視覺觀感上二者呈現(xiàn)為完全不同的色調(diào)；8#和9#顏色較為接近，但b值相差1倍之多。

除了分析色度指標(biāo)與主觀視覺觀感的吻合度外，研究也在大樣本（n=841）內(nèi)分析了色度指標(biāo)的群體分布特征（圖1-B）。L值變異范圍為59.7—89.8，均值為76.0±0.15，50%的樣本的L值集中于73.3—79.1之間。a值變異范圍為-6.7—15.5，均值為4.3±0.13，50%的樣本的a值集中于1.4—7.1之間。b值變異范圍為4.5—26.9，均值為15.6±0.13，50%的樣本的b值集中于13.1—18.2之間。在3個(gè)色度指標(biāo)中，a值的變異系數(shù)為88.2%，顯著高于L值（5.7%）和b值（24.0%）的變異系數(shù)。

A：略陽(yáng)烏雞蛋代表性蛋殼顏色。紅綠色圈內(nèi)標(biāo)注的數(shù)字代表各枚蛋的a值，黃藍(lán)色圈內(nèi)的數(shù)字代表b值，白黑色圈內(nèi)的數(shù)字代表L值；B：略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色（n=841）L, a, b值分布。LBC=Lüeyang Black-boned Chicken

2.2 蛋殼顏色L、a和b值遺傳力估計(jì)

略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色表現(xiàn)出連續(xù)性變異特征，符合數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)。為了定量評(píng)估遺傳效應(yīng)對(duì)略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色變異的決定性，本研究在量化蛋殼顏色的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步估計(jì)了L, a, b值的遺傳力。在3個(gè)色度指標(biāo)中，L值和b值維持中等偏低遺傳力，遺傳力估計(jì)結(jié)果為0.46和0.37。a值維持了較高遺傳力，估計(jì)結(jié)果為0.77。3個(gè)色度指標(biāo)遺傳力估計(jì)精度較為接近，95%置信區(qū)間寬度均為0.4左右（圖2）。

曲線描繪1000個(gè)后驗(yàn)遺傳力概率分布，圖上方數(shù)字指各顏色指標(biāo)后驗(yàn)遺傳力眾數(shù)，括號(hào)中的數(shù)字為各指標(biāo)后驗(yàn)遺傳力的95%置信區(qū)間

2.3 蛋殼原卟啉和膽綠素含量與L, a, b值的相關(guān)性

為了闡明蛋殼色素濃度與略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色變異的關(guān)系，本研究分析了蛋殼原卟啉和膽綠素濃度與L, a, b值的相關(guān)性。原卟啉的濃度與L值存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)性，與a值和b值均呈現(xiàn)出強(qiáng)正相關(guān)性（圖3）。蛋殼膽綠素濃度與a值呈現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)性，但與L值和b值的相關(guān)關(guān)系均不顯著（圖3）。

2.4 CPOX和ALAS1表達(dá)量與褐殼顏色深淺的關(guān)系

已知原卟啉是影響略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的關(guān)鍵色素。為了篩選出調(diào)控略陽(yáng)烏雞褐殼顏色的候選基因，本研究比較了原卟啉前體物合成酶基因和在褐殼和淺褐殼間的表達(dá)差異。褐殼的L值顯著低于淺褐殼，a值、b值和原卟啉含量均顯著高于淺褐殼（表1），支持所選樣本蛋殼顏色量化和原卟啉含量測(cè)定結(jié)果與視覺觀感一致，樣本具有代表性。在褐殼雞蛋殼腺的表達(dá)水平是淺褐殼雞的（1.5±0.4）倍，但表達(dá)水平在褐殼和淺褐殼組間無顯著差異（圖4）。

圖中每個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)樣本，直線為回歸直線，灰色帶為回歸直線95%置信區(qū)間。圖上方數(shù)字為相關(guān)系數(shù)（r）和相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的P值

表1 褐殼和淺褐殼蛋殼顏色指標(biāo)和原卟啉含量的比較

每個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)樣本，星號(hào)代表組內(nèi)均值（n=8），星號(hào)兩側(cè)直線代表標(biāo)準(zhǔn)誤，圖上數(shù)字代表組間差異顯著檢驗(yàn)的P值

3 討論

3.1 a值是捕捉蛋殼顏色變異性靈敏度最高的指標(biāo)

鑒于略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色連續(xù)性變異的特點(diǎn)，建立一種能夠準(zhǔn)確度量蛋殼顏色變異，且數(shù)值變化與視覺觀感保持一致的量化方法，是研究其遺傳基礎(chǔ)的前提。在用L*a*b色度體系對(duì)略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的變異情況進(jìn)行定量分析后，本研究發(fā)現(xiàn)L值和b值雖然受個(gè)別極值影響呈現(xiàn)出較寬的變異范圍，但50%的樣本的L值和b值集中于一個(gè)較窄取值區(qū)間內(nèi)，而a值在變異范圍內(nèi)分布更為均勻，其變異系數(shù)（88.2%）也明顯高于L值（5.7%）和b值（24.3%）。Kamanli[27]在橫斑洛克雞、Sasaki等[16]在白來航與洛島紅的F2雜交群體、Goger等[25]在洛島紅中均發(fā)現(xiàn)，a值的變異系數(shù)（74.97%，40.2%，34.9%）要明顯高于L值（9.22%，6.3%，5.76%）和b值（14.67%，27%，7.55%）。在羅曼褐蛋殼顏色隨產(chǎn)蛋時(shí)間變化的研究中， a值變化幅度也要明顯高于L值和b值[26]。這些研究表明a值在響應(yīng)褐殼顏色變化的靈敏度方面要高于L值和b值，是量化蛋殼顏色變異、用于蛋殼顏色選育的理想指標(biāo)[34]。

3.2 原卟啉是影響略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的關(guān)鍵色素

Wang等[32]在分析綠殼蛋和褐殼蛋蛋殼色素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種色素同時(shí)存在于綠殼和褐殼蛋中，但褐殼蛋的原卟啉含量顯著高于綠殼蛋，而膽綠素含量顯著低于綠殼蛋。這些結(jié)果支持對(duì)綠殼和褐殼蛋的著色而言，兩種色素都在發(fā)揮作用，但可能有主次之分，即一種色素決定主色調(diào)，另一種色素起修飾作用。在綠殼蛋中，隨著原卟啉含量的升高，綠殼蛋的蛋殼顏色將由淺藍(lán)向藍(lán)綠、橄欖綠變化[35]。略陽(yáng)烏雞褐殼顏色表現(xiàn)出連續(xù)性變異的特征，且顏色偏淺的蛋略帶有綠色光澤。通過相關(guān)分析，本研究發(fā)現(xiàn)原卟啉濃度與3個(gè)色度指標(biāo)均存在強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，但膽綠素僅與a值存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。原卟啉相關(guān)分析結(jié)果與Zeng等[36]報(bào)道的結(jié)果一致，但膽綠素的結(jié)果與Zeng等[36]報(bào)道的結(jié)果有所不同，在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞中膽綠素與L值（=-0.67）和b值（=0.48）也存在顯著的相關(guān)關(guān)系。Li等[34]在分析長(zhǎng)順雞不同顏色蛋殼色素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，原卟啉在褐殼中的含量顯著高于綠殼，但膽綠素在褐殼和綠殼組間并無差異。這些結(jié)果說明，在略陽(yáng)烏雞中，原卟啉對(duì)蛋殼顏色的調(diào)節(jié)作用要大于膽綠素，而膽綠素所引起的細(xì)微變化只有靈敏度更高的a值能捕獲到。東鄉(xiāng)雞綠殼顏色的深度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于略陽(yáng)烏雞，在膽綠素的含量和蛋殼顏色的變異上可能產(chǎn)生更大幅度的變化。因此，這種變化在L和b值上也能反映出來。

在羅曼褐蛋雞中，褐殼理想的蛋色標(biāo)準(zhǔn)為L(zhǎng)=60，a=20，b=30[26]。略陽(yáng)烏雞蛋顏色（L=76.0±4.4，a=4.3±3.8，b=15.6±3.8）與此標(biāo)準(zhǔn)仍有較大差距。鑒于原卟啉含量與L、a、b值間的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，通過育種和營(yíng)養(yǎng)手段提高原卟啉含量是促使略陽(yáng)烏雞褐殼蛋色朝向理想蛋色標(biāo)準(zhǔn)靠近的有效手段。

3.3 CPOX是影響略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色的一個(gè)候選基因

在原卟啉合成通路中，ALAS1是催化甘氨酸和琥珀酰輔酶A合成δ-氨基乙酰丙酸的限速酶，而CPOX是促化糞卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)化為原卟啉原Ⅲ的酶[22]。盡管（位于12號(hào)染色體上）和（1號(hào)染色體）基因均未落在已知的蛋殼顏色QTL內(nèi)[16-18]，但鑒于這兩個(gè)候選基因在原卟啉前體物合成中的重要作用，它們?nèi)杂锌赡茏鳛槭苤餍?yīng)基因調(diào)控的下游基因參與褐殼蛋色的調(diào)控。Samiullah等[22]發(fā)現(xiàn)抗球蟲藥尼卡巴嗪主要通過下調(diào)致使褐殼顏色變淺。Li等[19]和Lu等[20]發(fā)現(xiàn)和在深褐殼樣本中的表達(dá)水平顯著高于淺褐殼。本研究發(fā)現(xiàn)在深褐殼中的表達(dá)量顯著高于淺褐殼組，而并未呈現(xiàn)這種表達(dá)差異。在蛋殼腺中的表達(dá)水平隨蛋的形成而變化，而的表達(dá)量在蛋形成的整個(gè)過程中維持恒定[22]。為此，本研究推測(cè)表達(dá)的時(shí)間依賴性增大了表達(dá)量比較的難度，即在無法保證樣本采集時(shí)間一致性的情況下將很難消除采樣時(shí)間不同造成的試驗(yàn)誤差，發(fā)現(xiàn)組間表達(dá)差異。盡管如此，本研究所取得的結(jié)果證實(shí)是與略陽(yáng)烏雞蛋殼中原卟啉含量和褐殼顏色深淺密切相關(guān)的一個(gè)候選基因。

3.4 3個(gè)色度指標(biāo)遺傳力的差異

本研究發(fā)現(xiàn)略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色L值（h2=0.46）和b值（h2=0.37）的遺傳力估計(jì)結(jié)果均位于前人報(bào)道的遺傳力估計(jì)范圍（L值：h2=0.2—0.65，b值：h2=0.22—0.64）內(nèi)，但a值遺傳力（h2=0.77）高于目前已報(bào)道的結(jié)果（a值：h2=0.21—0.74）[24-27]。此外，前人報(bào)道的3個(gè)色度指標(biāo)的遺傳力較為接近[26,27]，但本研究所得a值遺傳力要明顯高于L值和b值，與Goger等[25]在洛島紅中估計(jì)的結(jié)果（a值：h2=0.74 vs. L值：h2=0.37和b值：h2=0.64）較為接近。本研究推測(cè)a值遺傳力高可能與以下兩方面原因有關(guān)：第一、a值能響應(yīng)于膽綠素含量變化。在3個(gè)色度指標(biāo)中，a值是唯一一個(gè)能對(duì)膽綠素含量變化做出靈敏反應(yīng)的色度指標(biāo)。膽綠素在蛋殼中的沉積及其引起的綠殼色澤主要受遺傳效應(yīng)調(diào)控[14-15,35]。因此，在引起a值變異的因素中，遺傳效應(yīng)將起著非常重要的作用。第二、a值度量蛋殼顏色變化的高靈敏度。本研究基于半同胞數(shù)據(jù)用單變量動(dòng)物性模型估計(jì)遺傳力。高遺傳力性狀在表型方面應(yīng)該表現(xiàn)出家系內(nèi)具有較高的一致性，但家系間存在較大的差異。a值較高的靈敏性和較大的變異系數(shù)表明，它更有可能捕捉到家系間蛋色的遺傳差異，獲得較高的遺傳方差和遺傳力估計(jì)結(jié)果。

相對(duì)于蛋殼綠色調(diào)主要受基因調(diào)控的特點(diǎn)，褐殼蛋殼顏色有著更為復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，且易受年齡、藥物、疾病、應(yīng)激、產(chǎn)蛋時(shí)間等多種非遺因素的影響[1,13]。Li等[19]發(fā)現(xiàn)L值與原卟啉含量存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系，并建議L值作為度量褐殼蛋顏色深淺和原卟啉含量的一個(gè)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)除了L值外，b值也與原卟啉含量存在強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究推測(cè)L值和b值遺傳力偏低可能與褐殼復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)和易受環(huán)境影響的特點(diǎn)有關(guān)。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)a值是量化略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色準(zhǔn)確度和靈敏度最高的色度指標(biāo)，且主要受遺傳效應(yīng)調(diào)控。對(duì)a值向上選擇，將有望在褐殼深度和均勻度上取得較大遺傳進(jìn)展。鑒于a值與蛋殼色素間的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，將a值作為蛋殼色素含量的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)，在基因定位之類的大樣本研究中將為蛋殼色素含量不易測(cè)定、成本高提供一種解決方案。原卟啉是決定略陽(yáng)烏雞蛋殼顏色變異的關(guān)鍵色素，是與原卟啉濃度和褐殼顏色深淺顯著關(guān)聯(lián)的一個(gè)候選基因。

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Establishment of Quantization Method and Genetic Basis Analysis of Brown Eggshell Color in the Lüeyang Black-Boned Chicken

CHEN Qiu, HUANG JingJing, WANG ZhePeng

College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

【Background】Brown eggshell color is closely relevant to eggshell strength, concentrations of egg white antimicrobial protein and yolk carotenoid, blood and meat spots, and hatchability, and is an important index affecting quality and sale of eggs. However, due to absence of selection for eggshell color, color of brown eggs that some indigenous breeds lay is light and highly variable, which has an adverse effect on sale of eggs and creation of egg brands. 【Objective】The aims of this study are to establish a quantization method that could accurately and sensitively capture the variation of eggshell color, to estimate breed-specific heritability of eggshell color and to identify candidate genes associated with eggshell color in the Lüeyang black-boned chicken (LBC), so as to provide a theoretic basis for genetic improvement of LBC eggshell color. 【Method】841 hens from 62 half-sibling families of LBC breeding population were selected. Three eggs were collected from each hen, and then the eggshell color was quantified using the L*a*b color space, and posterior heritabilities of L, a, and b values were estimated in a Bayesian framework using the Markov Chain Monte Carlo (MCMC) algorithm. The prior distributions of breeding value and residual variances were set using an inverse-Gamma distribution. MCMC performed 130 000 iterations, dropped 30 000 iterations at the beginning and stored one every 100 iterations to obtain posterior distributions of variance components and posterior heritability estimates of color indexes. Hens that laid light brown (n=8), brown (n=8) and light blue (n=8) eggs were selected from LBC population. Three eggs were collected from each hen for the measurement of eggshell pigment, and the absorbance values were measured at 670 nm for biliverdin and at 412 nm for protoporphyrin. The concentrations of protoporphyrin and biliverdin were calculated by regression equations, which were fitted using absorbances and concentrations of standard samples. Shell glands of brown- (n=8) and light brown-shelled (n=8) hens were collected. Expression levels ofandin shell glands were detected using qPCR. 【Result】Among three color indexes, a* value kept a high consistency with the change of eggshell color based on subjective perception as a* value generally decreased with transition of egg color from brown to green hues. L and b values could accurately reflect the change of egg color from light to dark brown, but L and b values were unable to discriminate between brown and green hues reliably. L and b values showed low variation as L and b values of 50% of samples were distributed between 73.3-79.1 and 13.1-18.2. In contrast, a* values were evenly distributed among the samples as a* values of 50% of samples ranged from 1.4 to 7.1. In line with the distribution characteristics, the coefficient of variation (88.2%) of a value was higher than ones of L (5.7%) and b (24.0%) values. Estimation results of heritability showed that a* value (h2=0.77) was predominately affected by genetic factors. In contrast, L (h2=0.46) and b (h2=0.37) values were controlled by environmental effect to larger extents. For the relationship of eggshell pigment and color, protoporphyrin concentration had a strong correlation with all of three color indexes (L:=-0.86, a:=0.73, b:=0.88). But biliverdin concentration showed a strong (=-0.73) negative correlation with a* value alone.andwere two key enzymes that catalyze the biosynthensis of protoporphyrin precursors. Expression results showed that expression levels ofin shell glands of brown-shelled chickens were 1.5-fold higher (＜0.05) than that in shell glands of light brown-shelled chickens.had no significant (＞0.05) difference between brown- and light brown-shelled chickens.【Conclusion】These results indicated that protoporphyrin was the key pigment affecting LBC eggshell color, andwas a candidate associated with protoporphyrin concentration and color of brown eggs. The a* value was an optimal index quantifying eggshell color of LBC with high accuracy and sensitivity. In view of high heritability estimate of a* value, it was possible to increase brown hue and uniformity of LBC eggshell color via positive selection of a* value.

Lüeyang black-boned chicken; eggshell color; L*a*b color space; heritability;;

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.017

2022-08-02；

2022-11-29

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021NY-028）、陜西省農(nóng)業(yè)廳專項(xiàng)計(jì)劃畜禽新品種培育—略陽(yáng)雞（K3031222058）

陳球，E-mail：chenqiu_960625@163.com。通信作者王哲鵬，Tel：029-87091960；E-mail：wangzhepeng-001@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）