耐除草劑棉花GGK2的遺傳穩(wěn)定性分析及性狀鑒定

梁成真，臧有義，孟志剛，王遠，MUBASHIR Abbas，何海焱，周琪，魏云曉，張銳，郭三堆

耐除草劑棉花GGK2的遺傳穩(wěn)定性分析及性狀鑒定

梁成真，臧有義，孟志剛，王遠，MUBASHIR Abbas，何海焱，周琪，魏云曉，張銳，郭三堆

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081

【目的】明確轉(zhuǎn)基因耐除草劑棉花GGK2的遺傳穩(wěn)定性和營養(yǎng)品質(zhì)等性狀，為其產(chǎn)業(yè)化應用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐?！痉椒ā酷槍嶒炇遗嘤男滦湍统輨┟藁℅GK2，選取其T3、T4、T5代開展試驗研究。利用特異性PCR和Southern blot開展基因組整合穩(wěn)定性分析；利用實時熒光定量PCR、ELISA和膠體金試紙條開展表達穩(wěn)定性分析；通過田間噴施草甘膦測試其除草劑耐受穩(wěn)定性，以及依據(jù)相關(guān)國際或國內(nèi)行業(yè)標準進行棉籽營養(yǎng)成分分析等?！窘Y(jié)果】抗除草劑基因和，以及篩選標記基因以單拷貝形式整合到棉花GGK2基因組D10染色體，且能夠在T3、T4、T5代轉(zhuǎn)基因棉花中穩(wěn)定遺傳，同時發(fā)現(xiàn)基因組中不含有遺傳轉(zhuǎn)化載體的骨架片段。表達分析發(fā)現(xiàn)、和3個基因在棉花GGK2的不同時期、不同組織部位均有表達，其中，葉片中的表達量相對較高。四葉期、盛花期、吐絮期3個蛋白在葉片中表達量分別介于128.7—192.4 μg·g-1、24.4—35.0 μg·g-1和17.0—23.9 μg·g-1鮮重，利用GR79 EPSPS單克隆抗體制備的膠體金試紙條可以對田間棉花GGK2葉片實現(xiàn)快速鑒定。除草劑耐受性分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2可耐受4倍生產(chǎn)使用劑量的草甘膦除草劑。T3—T5不同世代棉花噴施除草劑后均未發(fā)現(xiàn)受害癥狀，而且整個生育期的生長發(fā)育未受影響。棉籽營養(yǎng)成分分析表明，來源于新疆、河北和河南種植的GGK2棉籽中，水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、維生素及脂肪酸含量與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g無顯著差異，各指標的含量水平均位于ILSI數(shù)據(jù)庫報道的范圍內(nèi)?！窘Y(jié)論】轉(zhuǎn)基因棉花新種質(zhì)GGK2的耐除草劑性狀遺傳穩(wěn)定性好、除草劑耐受能力強、籽粒營養(yǎng)成分與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g無顯著差異，在耐除草劑棉花生物育種具有重要的應用價值且產(chǎn)業(yè)化前景好。

棉花；GGK2；耐除草劑；草甘膦；遺傳穩(wěn)定性

0 引言

【研究意義】國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的成功應用，為棉花生物育種提供了重要的方向[1]。然而，與美國等發(fā)達國家相比，中國耐除草劑棉花研發(fā)和應用明顯滯后，目前尚沒有自主知識產(chǎn)權(quán)的耐除草劑棉花產(chǎn)業(yè)化應用[1-2]。團隊前期培育了新型耐除草劑棉花GGK2，田間測試可耐受4倍以上生產(chǎn)用草甘膦除草劑的濃度[2]，具有較好的應用前景。因此，開展轉(zhuǎn)基因棉花GGK2遺傳穩(wěn)定性研究，加快其轉(zhuǎn)基因生物安全性評價對中國棉花產(chǎn)業(yè)“提質(zhì)增效”具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】雜草防治是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一項重大難題。全球廣泛分布的雜草有30 000余種，因適應性強，繁殖力旺盛，雜草造成的直接經(jīng)濟損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)值的13%[3]。雜草不僅與作物爭奪水分和養(yǎng)分，而且滋生病害和蟲害，嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)作物帶來極大的危害[3-4]。中國農(nóng)田雜草有580余種，其中，惡性雜草15種，主要雜草31種，雜草發(fā)生面積約9 000萬hm2[5-6]。利用化學方法控制雜草省工且高效，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可或缺的一部分[6]，各類除草劑的產(chǎn)量和年銷售量已躍居農(nóng)藥之首。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導型除草劑，作用于植物內(nèi)莽草酸合成途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS），阻斷植物芳香族氨基酸的生物合成途徑，最終導致植物死亡[6-8]。草甘膦除草劑最初由美國Monsanto公司注冊生產(chǎn)，由于其理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效廣譜、低毒低殘留、環(huán)境安全，對大多數(shù)植物具有廣譜滅生性，至今已在世界100多個國家生產(chǎn)使用，是目前生產(chǎn)上使用最廣泛的除草劑[7-8]。自1996年Monsanto公司推出第一例商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種GTS40-3-2以來，轉(zhuǎn)基因作物種類已增加到10種左右、種植國家達到26個、種植面積擴大了100多倍[9]。目前，抗蟲和耐除草劑性狀是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化應用的主要性狀，其中，具有耐除草劑性狀的作物占全部轉(zhuǎn)基因作物種植面積的80%左右[10-11]。商業(yè)化應用的耐除草劑作物主要通過將導入體內(nèi)，從而獲得草甘膦除草劑抗性[12-13]。近年來，中國耐除草劑作物研究取得了一定的進展，但是目前尚未進入產(chǎn)業(yè)化應用[2, 14]。棉花是重要的天然纖維作物，也是重要的油料作物，具有極高的經(jīng)濟價值[15-18]。中國既是棉花生產(chǎn)大國，也是消費大國，棉花對中國經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)民增收具有重要的意義[19]。棉田雜草不僅嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且增加了棉花生產(chǎn)投入，雜草防治投入約占棉花生產(chǎn)人工成本的20%[20-21]。新型耐除草劑棉花GGK2通過共表達2個不同作用機制的耐草甘膦基因和，進一步獲得了高抗草甘膦、低殘留的性狀[2]。其中，GR79 EPSPS蛋白對草甘膦分子親和能力低，可以克服除草劑的競爭性抑制作用，從而避免草甘膦除草劑對植物的致死效應[22]。GAT蛋白可以乙?；莞熟Ⅳ然纬蔁o毒的乙?；莞熟ⅲ瑥亩鰪娒藁℅GK2草甘膦耐受性[23]?！颈狙芯壳腥朦c】轉(zhuǎn)基因生物安全性評價是基因工程產(chǎn)品商業(yè)化應用的必經(jīng)之路，而遺傳穩(wěn)定性研究是轉(zhuǎn)基因生物安全性評價的重要環(huán)節(jié)之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究詳細分析轉(zhuǎn)基因棉花GGK2不同世代的遺傳穩(wěn)定性，包括目的基因整合位點、基因表達、蛋白表達、草甘膦耐受性及籽粒中的營養(yǎng)成分等，為轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的產(chǎn)業(yè)化應用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因受體品種柯字棉312（Coker312），以及T3、T4、T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2均由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所棉花分子育種實驗室保存。用于基因整合穩(wěn)定性、表達穩(wěn)定性和草甘膦抗性穩(wěn)定性分析的試驗材料，種植于中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所廊坊試驗基地。用于測定營養(yǎng)品質(zhì)的試驗材料，分別種植于河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所試驗基地（2021年）、河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗基地（2021年）、新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所試驗基地（2021年）。

1.2 試驗方法

1.2.1 特異性PCR檢測 提取T3—T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2和對照材料柯字棉312的葉片基因組DNA，分別利用、、的引物和位點特異性引物進行PCR擴增（附表1）。棉花基因組提取參考文獻[24]。

1.2.2 Southern blot檢測 提取T3—T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2和對照材料柯字棉312的葉片基因組DNA，每個探針選擇3種不同的內(nèi)切酶酶切GGK2和柯字棉312基因組DNA，37 ℃完全酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜。探針、探針、探針和載體骨架探針引物見電子附表1，探針標記按照PCR DIG Probe Synthesis Kit說明書進行。Southern blot試驗按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ說明書進行操作。利用超靈敏多功能成像儀進行DNA雜交信號圖像分析。

1.2.3 熒光定量PCR檢測（qRT-PCR） 利用Trizol試劑法提取T3—T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2和柯字棉312的葉片RNA，取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋10倍以后進行qRT-PCR[25]。qRT-PCR使用C1000TM Thermal Cycler （CFX96 real-time system, BioRad, USA）進行，采用Comparative Ct的方法處理數(shù)據(jù)。以為內(nèi)參基因，每個基因進行3次重復。

1.2.4 ELISA檢測 選取T3—T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2和柯字棉312四葉期、盛花期、吐絮期3個時期葉片進行總蛋白提取，每個組織3次生物學重復。樣品經(jīng)液氮研磨后，稱量0.1 g樣品加入1 mL樣品提取緩沖液，同時，用2 mL樣品提取緩沖液稀釋標準品。使用北京華大蛋白研發(fā)中心有限公司生產(chǎn)的GR79 EPSPS和GAT蛋白抗體，檢測GR79 EPSPS、GAT蛋白質(zhì)的表達量。利用Thermo MK3酶標儀分析不同樣品的吸光值，根據(jù)標準蛋白質(zhì)的濃度及光密度值讀數(shù)，擬合出標準曲線方程，計算各組織中GR79 EPSPS和GAT蛋白質(zhì)的表達量。

1.2.5 草甘膦耐受性檢測 依據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測耐除草劑棉花第1部分：除草劑耐受性抗除草劑棉花》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第423號-14-2021），對轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的田間目標除草劑（草甘膦）耐受性進行檢測。草甘膦除草劑施用量分別為農(nóng)藥登記標簽中劑量的1倍（787.5 g·hm-2）、2倍（1 575 g·hm-2）、4倍（3 150 g·hm-2），按推薦時間施用。分別在用藥1、2和4周調(diào)查和記錄成苗率、植株高度和藥害癥狀，藥害癥狀分級參考GB/T19780.42。

1.2.6 種子營養(yǎng)成分分析 在河北廊坊、河南安陽和新疆阿克蘇3個地區(qū)的試驗材料中分別隨機選取50株，收獲中上部棉鈴，對收獲的棉花扎花、脫絨，將光籽烘干后粉碎，測定棉籽粉中的營養(yǎng)成分，包括水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、維生素和脂肪酸，以及棉酚和植酸酶等含量。營養(yǎng)成分含量定義參考ILSI數(shù)據(jù)庫。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，利用SAS 9.4數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用成組法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2特異性PCR分析

前期研究表明，棉花GGK2中T-DNA以單插入位點整合到基因組D10染色體（20 274 732— 20 274 752 bp）[2]，根據(jù)插入位點基因組左右邊界序列信息，設(shè)計位點特異性鑒定引物（附表1）。目的基因PCR擴增結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2在T3、T4、T5代均可以檢測到理論大小一致的和及篩選標記基因擴增條帶（圖1）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中目的基因以單插入位點方式整合于基因組中并在轉(zhuǎn)基因后代穩(wěn)定遺傳。

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的Southern blot分析

分別依據(jù)、和表達盒序列設(shè)計特異性探針（圖2-A），每個探針對應3種不同內(nèi)切酶切割的棉花GGK2 T3、T4、T53個世代基因組，以遺傳轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒為陽性對照。探針1選擇dⅢ、RⅠ和HⅠ內(nèi)切酶（圖2-B），探針2選擇RⅠ、Ⅰ和Ⅰ內(nèi)切酶（圖2-C），探針3選擇dⅢ、RⅠ和I內(nèi)切酶（圖2-D）。Southern blot雜交結(jié)果表明（圖2），探針1—3在棉花GGK2 T3—T5中均檢測到一條特異性雜交條帶，且T3—T5不同世代之間條帶大小完全一致。相反，陰性對照柯字棉312未檢測到雜交條帶。以上結(jié)果進一步證明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中T-DNA以單拷貝形式整合到基因組且在不同世代間穩(wěn)定遺傳。

為了檢測是否有植物表達載體骨架整合到棉花GGK2基因組，設(shè)計2個覆蓋載體骨架的探針。Southern blot結(jié)果表明，棉花GGK2基因組DNA不存在載體骨架片段的插入（圖2-E—F）。為了驗證上述結(jié)果，進一步對棉花GGK2進行全基因測序分析，獲得與Southern blot一致的結(jié)果。證明GGK2中、和組成的T-DNA以單拷貝形式整合到棉花基因組且不含有其他外源DNA片段。

GR79 EPSPS FP引物和RP引物理論擴增大小為645 bp；GAT FP引物和RP引物理論擴增大小為466 bp；NPTII FP引物和RP引物理論擴增大小為760 bp；RB FP+LB RP引物擴增片段大小810 bp；RB FP+LB RP引物擴增片段大小420 bp。Coker312：柯字棉312，作為陰性對照；DNA Ladder：DNA指示Marker；陽性對照：GR79GAT質(zhì)粒。T3、T4、T5指轉(zhuǎn)基因棉花GGK2 T3—T5代純合株系。下同

A：限制性內(nèi)切酶位點及特異性探針的位置。B：特異性探針1雜交結(jié)果。內(nèi)切酶為HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ。C：特異性探針2雜交結(jié)果。內(nèi)切酶為EcoRⅠ、NheⅠ和BamHⅠ。D：特異性探針3雜交結(jié)果。內(nèi)切酶為HindⅢ、BamHⅠ和NheⅠ。E：特異性探針4雜交結(jié)果。內(nèi)切酶為HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ。F：特異性探針5雜交結(jié)果。內(nèi)切酶為HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中目的基因表達分析

qRT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2根、莖、葉等組織均可檢測到、和的表達，其中，葉片中表達量最高。對棉花GGK2 T3、T4、T5代四葉期進一步檢測，發(fā)現(xiàn)在3個代際間均可檢測到、和的表達，而且表達水平無顯著差異（圖3-A—C），進一步證明目的基因在轉(zhuǎn)基因棉花GGK2不同代際之間表達穩(wěn)定。

A：GR79 EPSPS；B：GAT；C：NPTII。不同小字母表示不同轉(zhuǎn)基因株系之間的差異顯著性（P＜0.05）。下同

2.4 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中目的蛋白定量分析

ELISA檢測結(jié)果表明，除了棉花纖維之外，T3、T4、T5轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的葉、根、莖、花蕾、花、棉鈴和棉籽中的GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ蛋白均高效表達，且T3—T5轉(zhuǎn)基因棉花中相同組織相同發(fā)育階段表達量基本一致。研究還發(fā)現(xiàn)，葉片中目標蛋白含量顯著高于其他組織，其中，四葉期、盛花期、吐絮期葉片中GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ蛋白含量范圍依次為128.7—192.4 μg·g-1鮮重（GR79 EPSPS）（圖4-A）、24.4—35.0 μg·g-1鮮重（GAT）（圖4-B）、17.0—23.9 μg·g-1鮮重（NPTⅡ）（圖4-C），同一蛋白在3個代際間含量無顯著差異。相反，受體對照柯字棉312中未檢測到3個蛋白的表達。同時，為了快速方便地鑒定轉(zhuǎn)基因棉花GGK2，利用GR79 EPSPS抗體膠體金試紙條對田間棉花GGK2進行了快速檢測鑒定，棉花GGK2及其衍生材料中均可以檢測出目標蛋白表達，而未在對照柯字棉312檢測到（圖4-D）。

2.5 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的草甘膦耐受性分析

草甘膦田間耐受性測試結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2在噴施生產(chǎn)用劑量1倍（787.5 g·hm-2）、2倍（1 575 g·hm-2）和4倍（3 150 g·hm-2）的草甘膦后，均未表現(xiàn)出受害癥狀，對照柯字棉312則全部死亡。尤其是噴施草甘膦除草劑2周和4周后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ湛伦置?12全部死亡，而T3、T4、T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2均正常生長，其株高、葉片受害率與噴施清水的GGK2對照組無顯著差異，3個代際間草甘膦抗性表現(xiàn)穩(wěn)定（表1）。因此，證明棉花GGK2的耐除草劑性狀穩(wěn)定遺傳，可以滿足生產(chǎn)應用的需要。

2.6 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的營養(yǎng)成分分析

前期研究表明，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的主要農(nóng)藝性狀和受體對照柯字棉312無顯著差異，株高、果枝數(shù)、棉桃數(shù)、纖維品質(zhì)和產(chǎn)量等性狀在不同世代穩(wěn)定遺傳[2]。進一步分析T3—T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的棉籽營養(yǎng)成分，結(jié)果表明，GGK2不同世代種子之間水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、維生素E、維生素B2及11種脂肪酸含量基本一致，而且營養(yǎng)成分均位于ILSI數(shù)據(jù)庫報道的含量范圍之內(nèi)（表2）。此外，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M柯字棉312相比較，棉花GGK2棉酚和植酸酶含量也未發(fā)生任何非預期和具有生物學意義的重大改變（表2）。

ELLS轉(zhuǎn)基因棉花GGK2 T3、T4、T5代目的基因蛋白GR79 EPSPS（A）、GAT（B）和NPTⅡ（C）在四葉期、盛花期和吐絮期表達穩(wěn)定性。D：轉(zhuǎn)基因棉花GGK2 T3—T5代膠體金試紙條檢測。箭頭所示為目的條帶。PC：陽性對照，NC：陰性對照

表1 T3、T4、T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的草甘膦耐受性

表2 T3、T4、T5代轉(zhuǎn)基因棉花GGK2營養(yǎng)成分分析

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2后代穩(wěn)定遺傳有重要的應用潛力

國產(chǎn)抗蟲棉推廣應用25年以來，中國基本解決了棉鈴蟲危害，棉花單產(chǎn)居世界前列，優(yōu)質(zhì)進程也明顯加快[1]。近年來，草害上升為棉花生產(chǎn)的主要危害之一。雜草不僅與棉花爭奪水分和養(yǎng)分，滋生病害和蟲害，而且影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)[14-15]。隨著人工成本的提高，傳統(tǒng)人工除草費用嚴重增加了棉花生產(chǎn)成本。因此，發(fā)展自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑棉花是中國棉花產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

轉(zhuǎn)基因作物不同世代的外源基因DNA整合位點、基因表達、蛋白表達、目的性狀以及營養(yǎng)品質(zhì)等遺傳穩(wěn)定性分析，是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要組成部分，也是商業(yè)化應用的前提[25]。轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中T-DNA包含2個目的基因（和）與一個篩選標記基因（）[2]，T-DNA片段以單拷貝形式整合到基因組。整合位點既沒有破壞棉花內(nèi)源基因，也未導致周圍基因的表達變化，因此，未造成任何農(nóng)藝性狀的改變。本研究通過對連續(xù)3代嚴格自交的轉(zhuǎn)基因棉花GGK2進行檢測，結(jié)果表明，外源目的基因穩(wěn)定地整合到棉花基因組中，而且目的基因的拷貝數(shù)、表達水平、蛋白表達量、除草劑抗性和棉籽營養(yǎng)品質(zhì)等在3代之間無顯著差異，證明了轉(zhuǎn)基因棉花GGK2是一個高耐受草甘膦除草劑并且可以穩(wěn)定遺傳的新型抗除草劑生物育種材料，具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。

3.2 轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的后代性狀穩(wěn)定不存在安全風險

“多基因疊加”是增強抗性和防止抗性風險產(chǎn)生的重要手段[26-28]。轉(zhuǎn)基因棉花GGK2中同時轉(zhuǎn)入2個抗除草劑基因和，在雙基因協(xié)同作用下棉花GGK2可耐中劑量4倍草甘膦噴施，而且農(nóng)藝性狀不受影響。由于GAT蛋白可以乙?；莞熟⒊蔀橐阴２莞熟?，噴施除草劑15 d后轉(zhuǎn)基因棉花GGK2葉片中草甘膦殘留降低80%以上[2]，種子中檢測不到草甘膦殘留。除了棉纖維是重要的紡織原料，棉籽還是食用油和飼料的重要加工原料[15-16, 29-30]。對于非有意改變營養(yǎng)特性的轉(zhuǎn)基因作物，營養(yǎng)成分分析是評估轉(zhuǎn)基因過程是否造成任何非預期后果的“證據(jù)權(quán)重”的內(nèi)容之一[31]。對轉(zhuǎn)基因棉花GGK2棉籽進行了營養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明，所有的營養(yǎng)成分均位于ILSI數(shù)據(jù)庫報道的含量范圍之內(nèi)，因此，轉(zhuǎn)基因棉花GGK2在成分、安全性、健康性和其他相關(guān)指標與目前種植、銷售和使用的棉花實質(zhì)等同。

抗蟲和抗除草劑是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最成功的2個應用案例[21, 32]。草甘膦自1971年誕生以來，年消耗量約8億kg，成為全世界第一大除草劑[7-8]。目前，全球80%以上的轉(zhuǎn)基因作物是抗除草劑品種，抗除草劑作物在美洲國家廣泛種植[33-34]。中國抗蟲棉技術(shù)應用全球領(lǐng)先，成為生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中成功應用的一面旗幟[21]。近年來，人工除草成本的上漲嚴重增加了棉花生產(chǎn)成本[35]。同時，自主知識產(chǎn)權(quán)抗除草劑棉花研發(fā)和商業(yè)化應用滯后成為我國棉花生產(chǎn)中的重要短板。轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的成功研發(fā)和應用，將加快我國棉花抗除草劑育種進程。此外，抗蟲棉在中國推廣種植以來，已培育200多個的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗蟲棉品種[21]，未來育種家可以利用這些品種和抗除草劑棉花GGK2有效地開展聯(lián)合育種，快速培育抗蟲抗除草劑優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)棉花新品種。而且抗蟲棉的大面積推廣種植，使得棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成了較好的群眾基礎(chǔ)，將有利于抗除草劑棉花的商業(yè)化推廣應用。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因棉花GGK2的外源基因以單拷貝形式整合到棉花基因組中并在不同代際間穩(wěn)定遺傳。其中，2個目的蛋白GR79 EPSPS和GAT以及篩選標記蛋白NPTⅡ在植株不同時期、不同組織部位均有表達，且在葉片中的表達量相對較高。轉(zhuǎn)基因棉花GGK2可耐受田間使用中劑量4倍的草甘膦除草劑，而且不同地點和不同代際間GGK2農(nóng)藝性狀和棉籽中營養(yǎng)成分沒有顯著差異。表明轉(zhuǎn)基因棉花GGK2分子特征、農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)成分等遺傳穩(wěn)定，是棉花生物育種重要的種質(zhì)資源。

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Identification of Target Traits and Genetic Stability of Transgenic Cotton GGK2

LIANG Chengzhen, ZANG Youyi, MENG Zhigang, WANG Yuan, Mubashir Abbas, HE HaiYan, ZHOU Qi, Wei Yunxiao, ZHANG Rui, GUO Sandui

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【Objective】The objective of this study is to confirm the target traits and genetic stability of transgenic glyphosate- resistant cotton GGK2 and provide technical support for its commercialization.【Method】T3, T4, and T5transgenic cotton plants GGK2 were subjected to insertion site-specific PCR, Southern blot, ELISA, bioassays in the laboratory and field, analysis of target herbicide tolerance, and investigation of nutritional constituents.【Result】The results indicated that the target genes, GR79 EPSPS and GAT, were integrated into the cotton genome as single copies and stably inherited in GGK2 plants. In GGK2 cotton,,, andproteins were expressed at different stages and in different tissues, with relatively high expression levels in the leaves. At the four-leaf stage, bud stage and boll opening stag, the expression levels in leaves were 128.7-192.4 μg·g-1, 24.4-35.0 μg·g-1, and 17.0-23.9 μg·g-1fresh weight for,, and, respectively. In the field, transgenic cotton GGK2 tolerated up to four times the recommended medium dose of glyphosate application. No significant differences were observed in agronomic traits and nutritional constituents compared to the control, Coker312.【Conclusion】These data demonstrate that transgenic cotton GGK2 is genetically stable and highly resistant to herbicides. Therefore, it can be utilized for breeding high-glyphosate- resistant commercial cotton varieties.

cotton; GGK2; herbicide tolerance; glyphosate; genetic stability

2023-01-17；

2023-02-23

國家重大科技專項（2016ZX08005-004）、國家自然科學基金（32072115和31771850）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程

通信作者梁成真，E-mail：liangchengzhen@caas.cn。通信作者張銳，E-mail：zhangrui@caas.cn。通信作者郭三堆，E-mail：guosandui@caas.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.002

（責任編輯 李莉）