禽心包積液-肝炎綜合征實驗室診斷技術(shù)與防控

張云丹，袁林，袁標(biāo)，沈德林

（1.息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州息烽551100；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州貴陽550001）

禽心包積液-肝炎綜合征（HHS)是由Ⅰ群禽腺病毒C 種血清4 型( FAdV-4) 引起禽類的一種傳染性強、 發(fā)病率和死亡率較高的急性傳染病，以雞和火雞為主，該病可通過水平和垂直兩種方式傳播，典型的解剖臨床癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重心包積液和肝炎。該病因最早在1987 年，在巴基斯坦安卡拉地區(qū)發(fā)現(xiàn)此病， 因此得名安卡拉病。 目前在我國，該病流行范圍廣，在我國湖北、黑龍江、河南、遼寧等地區(qū)呈大面積流行暴發(fā)，主要臨床癥狀有精神萎靡，被毛粗亂，無光澤，雙眼微閉，拉稀糞，剖檢發(fā)病雞以心包內(nèi)積有大量淡黃色清亮液體，心肌柔軟萎縮，肝臟腫大并伴有炎癥性壞死，肺臟紅腫，腎臟腫大充血，雞群一旦發(fā)病， 成年雞病死率可達30%以上，3～6 周齡的肉雞最為易感，病死率最高達80%，給家禽養(yǎng)殖企業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失和潛在威脅。 為降低家禽養(yǎng)殖企業(yè)感染風(fēng)險，本文就禽心包積液-肝炎綜合征（HHS)的診斷技術(shù)和防控進行闡述，以期為實驗室診斷技術(shù)研究和預(yù)防提供更多理論參考。

1 HHS 臨床癥狀和病理組織學(xué)觀察

1.1 臨床癥狀

FAdV-4 是引起HHS 的病原， 發(fā)病雞一般呈隱性感染，初期正常采食，精神狀態(tài)良好，3～4天后，雞群突然發(fā)病，主要特征是身體搖晃，雙眼微閉，被毛粗亂，行動遲緩，精神萎靡，聚集扎堆。還有研究表明，發(fā)病雞部分有水樣腹瀉，排黃綠色黏稠糞便，部分雞突然倒地并伴有角弓反張等神經(jīng)癥狀，數(shù)分鐘后死亡。

1.2 病理變化觀察

臨床病例經(jīng)剖檢觀察可見呈淡黃色清亮的心包積液，心肌蒼白柔軟伴有瘀血點；肝臟腫大發(fā)黃，并伴有不同程度的出血和壞死，邊緣質(zhì)脆易碎；肺臟水腫充血；腎臟腫大出血；胸腺和法氏囊先腫大后萎縮。 通過顯微病理變化觀察，病毒主要引起肝組織的變化，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體，出現(xiàn)空泡化肝細(xì)胞，肝實質(zhì)中出現(xiàn)不同程度的壞死灶，偶爾可觀察到肝小葉中央部位有細(xì)胞彌漫性腫脹； 而心肌顯微病變不明顯，偶有淋巴細(xì)胞浸潤和血細(xì)胞聚集；有研究發(fā)現(xiàn)，肺臟有灶性壞死，部分區(qū)域有炎性細(xì)胞浸潤；小腸上皮細(xì)胞有壞死脫落， 腸黏膜出現(xiàn)炎癥；腎小管壞死、彌漫性出血，腎間質(zhì)聚集血細(xì)胞；胸腺和法氏囊內(nèi)的淋巴細(xì)胞溶解變性形成空囊狀，胸腺小體溶解。

2 HHS 的實驗室診斷技術(shù)

2.1 病毒的分離與鑒定

病毒的分離鑒定是實驗室常用于確診病毒的重要方法，該方法分離病毒準(zhǔn)確度高、易掌握，是分離病毒確診HHS 的最佳方法之一。 研究表明，Ⅰ群禽腺病毒的培養(yǎng)增殖對動物種屬的選擇有嚴(yán)格要求，一般選同源動物組織細(xì)胞進行分離試驗，如雞胚腎細(xì)胞、雞肝癌細(xì)胞、雛雞腎細(xì)胞等，在這些細(xì)胞中，雞肝癌細(xì)胞中分離效果最佳，能引起明顯的CPE，CPE 主要是細(xì)胞變圓、折光性變強、后死亡脫落等。除了用細(xì)胞分離外，還可以接種SPF 雞胚， 該方法也被廣泛應(yīng)用于Ⅰ群禽腺病毒分離， 接種途徑主要有尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種和卵黃囊接種等，但接種后雞胚一般不出現(xiàn)CPE， 尿囊腔接種病毒后雞胚不死亡。王小輝等研究顯示， 經(jīng)卵黃囊接種的雞胚24 小時后出現(xiàn)死胚，雞胚卷縮矮小，畸形發(fā)育，胚體有充血、肝炎等癥狀。

2.2 血清學(xué)診斷方法

血清學(xué)診斷方法被廣泛用于病毒病的診斷， 目前應(yīng)用于HHS 的血清學(xué)診斷方法包括病毒中和試驗、 瓊脂凝膠擴散試驗和ELISA 等技術(shù)。病毒中和實驗是根據(jù)抗原和抗體結(jié)合原理建立的診斷技術(shù)，可檢測血清中的抗體，也可以從病料中檢測出病毒，可實現(xiàn)對禽腺病毒分離株的鑒定。

瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）是一種檢測抗原或抗體的檢測技術(shù)。 利用可溶性抗原與抗體在1%～2%瓊脂凝膠中自由擴散原理， 發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，并出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線即可診斷。智海東等用禽腺病毒I 型制備瓊脂擴散抗原， 并對抗原的特異性和效價進行優(yōu)化，結(jié)果顯示制備的瓊脂擴散抗原具有良好的特異性，可檢測到1∶8 稀釋的禽腺病毒I 型陽性血清。 AGP 操作簡單，試驗成本低，周期短，被廣泛應(yīng)用于FAdV 的抗體檢測。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）因特異性強，操作簡單、時間短，因此，該方法在實驗室種常用于確診HHS。張曼采用純化的FAdVⅠ流行株制備包被抗原，試驗結(jié)果表明，建立的EISA 檢測方法特異性好，對禽流感病毒、雞新城病毒、沙門氏菌和大腸桿菌等陽性血清檢測結(jié)果都為陰性，敏感性高達1∶1200， 臨床樣本檢測陽性率達到51.3%。

2.3 PCR 檢測方法

PCR 方法是目前在實驗室最常用的一種檢測方法，與其他方法相比，該方法操作簡單，只需要自己設(shè)計一對特異性引物和配備一臺PCR 儀器，就能夠確診出HHS，同時又可以不同血清型設(shè)計出不同的特異性引物，可以檢測出不同血清型的HHS。肖躍強等建立的通用PCR 方法，能特異性的檢測FADV-Ⅰ的所有血清型 （包括4、8a、8b 和11）， 并證明該方法與病毒分離的符合率達到100%。 鄭鳴等（2018）設(shè)計禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒4 型(FAV-4)三種病毒的特異性探針，標(biāo)記于不同大小擬南芥TOC1 基因片段兩端，成功建立了能特異性診斷三種病毒的三重環(huán)介導(dǎo)PCR 檢測方法。

熒光定量PCR （q-PCR） 方法是在普通的PCR 技術(shù)上發(fā)展起來的一種核酸定量檢測技術(shù)，該方法與傳統(tǒng)PCR 相比，更快速、靈敏、特異， 因此更受青睞。 文艷玲等以六鄰體基因（hexon） 保守序列設(shè)計引物建立了SYBR GreenⅠ熒光PCR 方法，能成功檢測Ⅰ群禽腺病毒12個血清型。

2.4 核酸探針診斷方法

核酸探針方法相較于以上方法，要求技術(shù)、設(shè)備和成本都高，一般主要應(yīng)用于更深的科研研究，如疫苗研發(fā)、HSS 發(fā)病機制機理等，實驗室用該方法確診HSS 很少，因此，該方法不常用于臨床檢測。董婷婷等用地高辛標(biāo)記的包涵體肝炎病毒核酸探針，并進行了探針的特異性和靈敏度的評估試驗，結(jié)果顯示核酸探針特異性好，無交叉反應(yīng)，最低檢出量達到5 皮克。

3 綜合防控措施

目前， 預(yù)防該病最有效的手段還是疫苗免疫，但目前缺乏商品化疫苗。 因此加強養(yǎng)殖場綜合管理措施和疫病凈化是最佳方法。

3.1 優(yōu)化引種流程，改善養(yǎng)殖環(huán)境

目前，我國的養(yǎng)殖場種源來源一是由外地引進， 在引進的過程中其實存在諸多不確定因素，就以HHS 疾病來說，該疾病無商品化疫苗，不可能保證引進的雛雞中沒有帶毒病原，因此，在引進的過程中要做到：第一，在種源場地未發(fā)生過HHS 疾病，且其他疫苗均已經(jīng)免疫完成，并免疫率符合國家標(biāo)準(zhǔn)；第二，引進的工具一定要做好消毒措施，如車輛可以用苯扎溴銨等消毒水進行洗消，保證在運輸?shù)倪^程中無污染；第三，引進的雛雞一定要做好生物安全隔離，隔離場地要進行全面的消毒，做好保溫通風(fēng)措施，隔離時間一般在30 天左右。 二是自繁自養(yǎng)，因為HHS 疾病可通過種蛋垂直傳播， 育種過程中， 一旦有發(fā)生HHS 疾病的種雞、種蛋一定要淘汰處理，同時種場圈舍做好消毒工作，防止傳染擴大，造成更大的損失。

3.2 加強飼養(yǎng)管理，提升雞群免疫力

成年雞感染FAdV-4 不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，病毒會通過垂直傳播而延續(xù)，水平傳播形成大規(guī)模流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，因此做好種雞種蛋的病原凈化工作，是防止FAdV-4 在雞群中垂直傳播的重要措施。 有研究表明，黃曲霉菌混合感染也會引起心包積液和肝炎的典型癥狀，并加重單獨感染雞的組織損傷程度，因此加強飼養(yǎng)管理就顯得尤為重要，如避免使用霉變飼料的同時，使用含有微量元素和維生素（B、C、K 等）的飼料， 提高雞群免疫力是預(yù)防該病的重要手段。劉東等（2015）對我國雞群中FAdV-4 開展流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 雞傳染性貧血病病毒（CAA）、傳染性法氏囊病病毒 （IBDV） 和新城疫病毒（NDV） 等一些免疫抑制性病原會增強FAdV-4的致病性，對FAdV-4 的感染產(chǎn)生協(xié)同作用。 因此，做好雞舍的清潔消毒、減少協(xié)同發(fā)病病原菌的數(shù)量及做好全面綜合防控尤為重要。