CYP2E1介導(dǎo)酒精性心肌病的心臟纖維化作用及其機(jī)制

張榮懷,張珍俠,王凱燕,趙良玉,王藝金,4,王軍奎,劉富強(qiáng),于 凱#,郭海濤*

(1陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)一科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院蒲城醫(yī)院心血管內(nèi)科;3空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室;4西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:haitaoguo@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:99885357@qq.com)

酒精濫用一直是全球范圍內(nèi)重要的公共健康問題。飲酒不僅可引起酒精性肝病,也會(huì)導(dǎo)致酒精性心肌病[1]。有研究發(fā)現(xiàn),酒精可通過促進(jìn)心肌纖維化和心室重構(gòu)而抑制心臟功能[2]。因此,闡明飲酒導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制并提出有針對(duì)性的治療策略,對(duì)酒精性心肌病的診治具有重大意義。

體內(nèi)的酒精代謝途徑主要包括酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和微粒體酒精氧化系統(tǒng)(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)。細(xì)胞色素P450家族成員2E1(CYP2E1)是藥物代謝的MEOS系統(tǒng)的重要組成部分,主要分布在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上,存在于機(jī)體的大多數(shù)器官中,如肝臟、消化道、大腦和腎臟等。CYP2E1作為酒精代謝主要的代謝酶,與酒精依賴以及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。研究顯示,長(zhǎng)期過量飲酒將導(dǎo)致肝臟ADH活性降低,但CYP2E1的活性升高5～10倍,因此,MEOS成為了長(zhǎng)期過量飲酒機(jī)體內(nèi)酒精代謝的主要途徑[4]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),慢性酒精攝入將增加心臟CYP2E1的蛋白表達(dá)和活性,同時(shí)增加心肌纖維化,損傷心臟功能[5]。那么,酒精攝入后,CYP2E1是通過什么途徑導(dǎo)致心肌纖維化,進(jìn)而損傷心臟功能?目前還不是十分明確。

有研究顯示,在各種損傷導(dǎo)致的心臟組織重構(gòu)中,心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(cardiac fibroblast-myofibroblast transformation, CMT)起著重要的作用[6,7]。與心臟成纖維細(xì)胞相比,心臟肌成纖維細(xì)胞具有很強(qiáng)的合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的能力。新合成的ECM雖可填充心肌細(xì)胞死亡造成的空隙,保證心臟結(jié)構(gòu)的完整性[8],但也導(dǎo)致了心臟的廣泛纖維化,減弱心臟的收縮功能,導(dǎo)致心律失常。有研究表明,飲酒可引起CMT[7,9],但其機(jī)制并不完全明確。

目前的研究顯示,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)途徑在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制中起著重要的作用[10]。在酒精攝入后的心臟中,TGF-β表達(dá)水平顯著增高[11,12],而且TGF-β受體的表達(dá)也顯著增加[13]。

那么,酒精攝入是否通過增加TGF-β水平,進(jìn)而促進(jìn)CYP2E1的表達(dá),導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多從而引起心肌纖維化?因此,本研究將通過酒精或TGF-β1作用于心臟成纖維細(xì)胞,觀察心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及纖維化的效應(yīng),以明確CYP2E1在酒精攝入促進(jìn)CMT中的作用,并探討其可能的分子機(jī)制,為酒精性心肌病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出生1～3 d的SD乳鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。膠原酶Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,Hyclone胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GE生命科學(xué)公司,二烯丙基硫醚(diallyl sulfide, DAS)購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司。TGF-β1,Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)及CYP2E1抗體,Alexa Fluor594熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。α-SMA及GAPDH抗體,DAPI購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。羊抗兔/羊抗鼠IgG購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取出出生1～3 d的SD乳鼠心臟,剪碎心臟加入含0.1%膠原酶Ⅰ消化液,37 ℃水浴3～5 min,反復(fù)吹打,靜置,棄去上清液。剩余沉淀再加入消化液,37 ℃水浴攪拌約5 min,反復(fù)吹打后將上清移至完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)中。重復(fù)上述步驟,最后將收集的上清進(jìn)行離心,取沉淀重懸于完全培養(yǎng)基中,移至培養(yǎng)瓶后,進(jìn)行差速貼壁90～120 min,貼壁細(xì)胞主要為心臟成纖維細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸棄,更換為新鮮的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞傳至2～4代后,接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 為研究酒精促進(jìn)心肌纖維化的作用以及其作用是否通過CYP2E1來實(shí)現(xiàn),將培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組(control)、酒精組(ethanol, 100 mmol/L)、二烯丙基硫醚(diallyl sulfide, DAS, CYP2E1抑制劑,100 μmol/L)組及ethanol+DAS組。為探討酒精是否通過TGF-β促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,將培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組(control)、腫瘤壞死因子β1組(TGF-β1, 10 ng/ml)、DAS組(100 μmol/L)及TGF-β1+DAS組。藥物作用于心臟成纖維細(xì)胞24 h后,進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的水平 接種于共聚焦培養(yǎng)皿中的心臟成纖維細(xì)胞按照不同分組給予相應(yīng)的藥物。藥物作用結(jié)束后用4%多聚甲醛固定10 min,以0.5% Triton X-100通透細(xì)胞10 min,給予α-SMA抗體(1∶1 000)避光孵育60 min,加入熒光二抗,最后加入DAPI孵育5 min,在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照,并用ImageJ進(jìn)行定量分析。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)成纖維細(xì)胞CYP2E1、Collagen Ⅰ、TGF-β1蛋白水平 心臟成纖維細(xì)胞給予不同藥物作用24 h后用裂解液裂解貼壁培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,分別將1.2.2各組的細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將提取的等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后分別用CYP2E1、Collagen Ⅰ、TGF-β1和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜。在室溫環(huán)境下,用HPR標(biāo)記的IgG二抗孵育1 h。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯色后進(jìn)行信號(hào)采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 酒精對(duì)心臟成纖維細(xì)胞CYP2E1蛋白水平的作用

應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)酒精作用于心臟成纖維細(xì)胞后對(duì)CYP2E1蛋白水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,酒精組心臟成纖維細(xì)胞的CYP2E1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01);與酒精組比較,酒精+DAS組心臟成纖維細(xì)胞CYP2E1蛋白表達(dá)量的水平被顯著抑制(P<0.05,見圖1)。

2.2 CYP2E1介導(dǎo)酒精促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)酒精作用于心臟成纖維細(xì)胞后,酒精組心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)的α-SMA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。而與酒精組相比,給予酒精的同時(shí)加入CYP2E1特異性抑制劑DAS后,酒精+DAS組心臟成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,見圖2)。

紅色熒光為α-SMA染色;藍(lán)色熒光DAPI染色,顯示細(xì)胞核

2.3 CYP2E1介導(dǎo)酒精促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞間質(zhì)

應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,酒精組在酒精作用于心臟成纖維細(xì)胞后,心臟成纖維細(xì)胞的Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);而與酒精組相比,酒精+DAS組心臟成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ的蛋白水平顯著降低(P<0.05,見圖3)。

與control組比較,**P<0.01;與ethanol組比較,#P<0.05

2.4 酒精對(duì)心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1的作用

應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)酒精對(duì)心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,酒精組心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白水平顯著升高(P<0.01)。而同時(shí)給予CYP2E1的抑制劑DAS后,與酒精組相比,酒精+DAS組心臟成纖維細(xì)胞的TGF-β1蛋白水平未出現(xiàn)顯著改變(P>0.05,見圖4)。

與control組比較,**P<0.01

2.5 TGF-β1促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

心臟成纖維細(xì)胞給予TGF-β1(10 ng/ml)后,與對(duì)照組相比,TGF-β1組α-SMA水平顯著升高(P<0.01)。而應(yīng)用DAS抑制CYP2E1蛋白表達(dá)后,與TGF-β1組比較,TGF-β1+DAS組α-SMA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,見圖5)。

紅色熒光為α-SMA染色;藍(lán)色熒光為DAPI染色,顯示細(xì)胞核

3 討論

飲酒是世界首要的疾病負(fù)擔(dān)危險(xiǎn)因素[14],酒精攝入將導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,其中包括酒精性心肌病[15]。超過50%的酗酒者患有心臟疾病,而且其中大部分人將最終死于心臟疾病[16]。酒精性心肌病不僅由于心肌細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡導(dǎo)致收縮功能受損,而且由于發(fā)生心肌纖維化,心臟的順應(yīng)性下降。兩者共同作用將嚴(yán)重降低心臟功能,導(dǎo)致心臟疾病的發(fā)生。

CYP2E1是一種微粒體酒精氧化系統(tǒng)(MEOS)的重要組成部分,在酒精的代謝中起著至關(guān)重要的作用。長(zhǎng)期酒精攝入將導(dǎo)致酒精代謝途徑中乙醇脫氫酶蛋白水平和活性降低,卻促進(jìn)了CYP2E1的表達(dá)和活性的增高[4]。可見,CYP2E1在酒精代謝中起著至關(guān)重要的作用。本研究證明酒精可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞CYP2E1的表達(dá)。而在酒精作用的成纖維細(xì)胞中同時(shí)給予CYP2E1抑制劑DAS,將顯著降低CYP2E1蛋白水平,提示酒精導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的作用是通過CYP2E1來介導(dǎo)的。

在各種損傷導(dǎo)致的心臟組織重構(gòu)中,占心臟細(xì)胞總數(shù)60%～70%的心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化起著重要的作用[17]。α-SMA是心臟肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的一種特異性蛋白,可以作為心臟成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),在酒精的作用下,心臟成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)量顯著升高,說明成纖維細(xì)胞發(fā)生了向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。并且在應(yīng)用CYP2E1抑制劑DAS后,心臟成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)量與酒精作用下相比顯著減少。說明酒精通過CYP2E1途徑介導(dǎo)了心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

在病理損傷導(dǎo)致的組織重構(gòu)中,新合成的ECM可填充死亡心肌細(xì)胞造成的空隙,保證心臟結(jié)構(gòu)的完整性[8],但也導(dǎo)致了心臟的廣泛纖維化。當(dāng)心臟的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后,可以產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì),其中具有代表性的組成成分包括Collagen Ⅰ。持續(xù)激活的肌成纖維細(xì)胞將導(dǎo)致組織順應(yīng)性降低[18,19]、心肌細(xì)胞萎縮、心律失常以及心肌氧供降低等,進(jìn)一步損傷心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)給予酒精刺激心臟成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分Collagen Ⅰ的含量顯著升高,進(jìn)一步證明酒精可以導(dǎo)致心臟的廣泛纖維化。在應(yīng)用CYP2E1抑制劑DAS后,顯著抑制了酒精對(duì)肌成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ含量的升高作用。說明酒精導(dǎo)致的ECM大量合成可被CYP2E1抑制劑DAS所抑制,提示酒精促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞活化及纖維化是由CYP2E1所介導(dǎo)。

目前大量研究發(fā)現(xiàn),成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包括經(jīng)典的TGF-β途徑[10]。TGF-β是酒精攝入導(dǎo)致肝臟纖維化的重要細(xì)胞因子[20],有研究發(fā)現(xiàn),在酒精攝入的動(dòng)物心臟中TGF-β表達(dá)水平顯著增高[9]。TGF-β可增加酒精導(dǎo)致的肝臟纖維化和損傷[4]。在阻塞輸尿管導(dǎo)致的腎臟損傷中,TGF-β表達(dá)水平顯著增高,肌成纖維細(xì)胞增多,而應(yīng)用TGF-β的抗體或拮抗劑,可顯著抑制肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,直接給予TGF-β則可促進(jìn)培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[21]。本研究發(fā)現(xiàn),酒精導(dǎo)致成纖維細(xì)胞TGF-β的重要亞型TGF-β1顯著升高,而給予CYP2E1抑制劑DAS后并未影響酒精促進(jìn)TGF-β1蛋白水平升高的作用,證明酒精對(duì)心臟成纖維細(xì)胞CYP2E1的作用與TGF-β的升高有關(guān)。

為進(jìn)一步明確酒精的作用是否是通過升高心臟成纖維細(xì)胞的TGF-β導(dǎo)致的,直接應(yīng)用TGF-β1刺激心臟成纖維細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細(xì)胞的α-SMA水平顯著升高,說明心臟成纖維細(xì)胞被顯著活化,而此效應(yīng)可被DAS抑制。本研究證明TGF-β1刺激心臟成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)升高的作用是由CYP2E1介導(dǎo)的。

因此,酒精攝入可能是通過促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞生成TGF-β1,從而增加CYP2E1的蛋白水平,進(jìn)而介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,引起心肌纖維化。這可能是酒精攝入導(dǎo)致心臟功能損傷的重要機(jī)制,通過對(duì)該機(jī)制的干預(yù)將可能成為酒精性心肌病防治的重要途徑。