lncRNA-SNHG12在重度子癇前期患者胎盤組織中的表達及其對滋養(yǎng)細胞增殖的影響

欒麗霞,張京婷,蘇 芮,唐陽芳,田 龍,王穩(wěn)瑩

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:563694923@qq.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)為妊娠20周或之后出現(xiàn)新發(fā)高血壓、蛋白尿為主要特征的妊娠期特有綜合征,是導致圍生期母嬰死亡的重要原因之一[1]。研究顯示,PE是一種多因素、多機制、多通路共同參與而引發(fā)的疾病[2,3],然而,PE的早期診斷仍缺乏有效的標志物。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)不僅在細胞增殖、侵襲以及腫瘤轉移中發(fā)揮作用[4],還可以調(diào)控同為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)屬性的miRNA,間接影響下游靶基因從而發(fā)揮相應的功能[5,6]。研究證實,部分lncRNA可通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的凋亡、侵襲功能而參與子癇前期的發(fā)生[7]。lncRNA-小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12, SNHG12)在腎透明細胞癌中可抑制細胞的增殖及遷移功能[8]。本研究主要分析lncRNA-SNHG12在重度子癇前期(severe preeclampsia,sPE)孕婦胎盤組織中的表達水平,及其通過調(diào)控miR-30a-3p及DNMT3a的表達影響人正常滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo的增殖功能;以期為尋找PE的初步發(fā)病機制提供理論依據(jù),為PE的臨床診斷提供新的研究思路及方向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2020年10月至2021年6月于西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的首次接受剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦的胎盤組織50例,其中sPE孕婦25例(sPE組),同期健康孕婦25例(正常組)。胎盤娩出后,選取胎盤母面剪取約1 cm3胎盤組織,無菌PBS沖洗組織后立即放入液氮中,-80 ℃保存待用。

sPE組的納入依據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學》中的診斷標準[9]。排除標準:兩組均需排除合并糖尿病、慢性高血壓、心臟病、慢性腎炎以及自身免疫性疾病、血栓性疾病、精神疾病、感染性疾病的患者。本研究經(jīng)西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(XYYFY2021LSKY-022),所有納入研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑

HTR8/SVneo細胞購自中科院細胞庫。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、SNHG12過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-SNHG12)及其siRNA(SNHG12抑制序列)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成;TRIzol試劑、miRNA反轉錄試劑盒購自美國invitrogen公司。PCR引物由廣州銳博生物技術有限公司合成;CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;lipofectamineTM2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司;SDS裂解液及蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;鼠抗人DNMT3a單克隆抗體、鼠抗人GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Abcam公司。PCR擴增儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);BD流式細胞儀(美國Becton公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

HTR8/SVneo復蘇后接種于含10% FBS、鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng);取對數(shù)生長期HTR8/SVneo細胞,將其分為:對照組、過表達組和抑制組。按照脂質(zhì)體2000試劑說明書分別轉空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、SNHG12(pcDNA3.1-SNHG12)過表達質(zhì)粒和siRNA(SNHG12抑制序列)。轉染后8 h換液1次,培養(yǎng)24 h進行后續(xù)實驗。

1.4 lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、DNMT3a mRNA表達

按TRIzol試劑盒提取sPE組及正常組凍存胎盤組織及各轉染組細胞中的總RNA,測定RNA質(zhì)量,反轉錄成cDNA -20 ℃留存。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設計合成lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、DNMT3a、內(nèi)參β-actin、U6的引物序列(見表1)。PCR總反應體系20 μl,包括10 μl SYBR Premix Ex Taq試劑、2 μl cDNA、上下游引物各1 μl、滅菌蒸餾水6 μl。PCR的熱循環(huán)條件如下:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,62 ℃ 30 s,40個循環(huán)。應用比較分析Ct值法,使用2-ΔΔCt法計算各組中目的基因mRNA的相對表達量。試驗設定3個復孔,重復3次。

表1 目的基因引物序列

1.5 CCK-8測定細胞增殖

按CCK-8試劑盒說明書,檢測轉染后細胞的增殖能力。收集對數(shù)生長期細胞,將其接種至96孔板(每組細胞6個重復)。調(diào)整細胞密度為2 000個/孔,分為過表達組、抑制組和對照組,按脂質(zhì)體2000轉染說明書進行轉染。經(jīng)4 h貼壁后為計時0點,于24,48,72 h分別加入CCK-8 10 μl/孔,繼續(xù)孵育1 h酶標儀測量波長450 nm的吸光度。每組實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測各組DNMT3a的表達

按細胞裂解液說明書提取各轉染組細胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度。取35 μg蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,半干法轉膜至PVDF上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入DNMT3a(1∶2 500)、GAPDH鼠抗人(1∶1 500)單克隆一抗,4 ℃過夜。TBST洗膜,加辣根酶標記二抗(1∶2 000)溫育1 h。化學發(fā)光系統(tǒng)檢測印跡條帶,目的蛋白的表達量以DNMT3a/內(nèi)參GAPDH比值表示。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組研究對象臨床資料

兩組研究對象的年齡、妊娠時間、體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表2)。

表2 兩組研究對象臨床資料比較

2.2 胎盤組織中l(wèi)ncRNA-SNHG12的表達水平

qRT-PCR結果顯示,與正常組相比,sPE組lncRNA-SNHG12相對表達量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖1)。

與正常組比較,***P<0.001

2.3 轉染后lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p mRNA在HTR8/SVneo細胞中表達水平

qRT-PCR結果顯示,與對照組相比,過表達組lncRNA-SNHG12 mRNA表達水平增高,抑制組表達水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖2)。與對照組相比,過表達組miR-30a-3p mRNA水平表達降低,抑制組miR-30a-3p表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖2)。

與對照組比較,***P<0.001

2.4 轉染后 HTR8/SVneo中 DNMT3a mRNA及 DNMT3a蛋白水平表達

與對照組相比,過表達組DNMT3a在mRNA及蛋白水平均升高,抑制組DNMT3a在mRNA及蛋白水平表達均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖3)。

與對照組比較,***P<0.001

2.5 轉染后HTR8/SVneo細胞增殖能力比較

CCK-8檢測結果顯示,與對照組相比,抑制組在轉染后24,48,72 h細胞增殖能力均降低,差異有統(tǒng)計學意義(24 h:P=0.009,48 h和72 h:P<0.001);過表達組在轉染后24 h細胞增殖能力增強,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.062),轉染后48 h和72 h細胞增殖能力增強,差異有統(tǒng)計學意義(48 h:P=0.006,72 h:P=0.002,見圖4)。

與對照組比較,***P<0.001

3 討論

PE嚴重威脅母胎健康,但其病因尚未明確。滋養(yǎng)細胞增殖障礙、凋亡功能異常導致子宮螺旋動脈重塑異常繼而引發(fā)病理性胎盤形成,是PE發(fā)生的主要機制學說之一[10-13]。因此,研究影響滋養(yǎng)細胞功能的相關因素,對于進一步揭示PE發(fā)病機制有一定的意義。研究表明,PE胎盤組織中存在多種差異性表達的ncRNA(包含lncRNA、mi-RNA),這些ncRNA可能通過介導滋養(yǎng)細胞功能,最終參與PE發(fā)病過程[14,15]。本次研究結果表明,與正常組織比較,lncRNA-SNHG12在sPE胎盤組織中的表達降低,可能與PE發(fā)病和進展相關。

人類基因組約98%的區(qū)域轉錄為非編碼RNA,而lncRNA與microRNAs(miRNAs)兩者作為調(diào)節(jié)性非編碼RNA,不僅在細胞生長發(fā)育、表觀遺傳學、基因表達調(diào)控以及多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到極為重要的作用,兩者間還能夠通過“海綿效應”、競爭性結合等方式互相影響。已有多項研究證實,lncRNA-SNHG12可對多種miRNA發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)作用,并調(diào)節(jié)其下游靶基因水平進而影響細胞功能[8,16-18]。例如,在胃癌中l(wèi)ncRNA-SNHG12可通過miR-199a-5p發(fā)揮ceRNA作用,上調(diào)Argo2的表達[16]。通過生物信息位點分析SNHG12與miRNA-30a-3p存在生物學結合位點,在腎癌體外細胞試驗證實,lncRNA-SNHG12與miRNA-30a-3p之間存在負向調(diào)控關系[8]。為進一步探索SNHG12對于滋養(yǎng)細胞功能影響,本研究向人絨毛膜滋養(yǎng)細胞(HTR8/SVneo)中分別轉染SNHG12過表達及抑制序列,并檢測其對miRNA-30a-3p表達的影響。結果顯示,HTR8/SVneo細胞中l(wèi)ncRNA-SNHG12的過表達與抑制效果顯著(P<0.001);且與對照組比較,過表達組細胞中miRNA-30a-3p的表達水平降低,而抑制組中miRNA-30a-3p的表達水平則升高(P<0.001)。說明更換細胞平臺為HTR8/SVneo,lncRNA-SNHG12仍可負性調(diào)控miRNA-30a-3p的表達,這與Yu等[8]在腎透明細胞癌中的研究結果具有相似性。

miR-30a-3p在PE患者胎盤組織中特異性高表達[19],DNMT3a在PE胎盤組織中低表達,且抑制其表達可影響滋養(yǎng)細胞遷移功能[20]。生物學信息分析miR-30a-3p與DNMT3a存在靶向關系,且Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn),肝癌中miR-30a-3p可靶向調(diào)控DNMT3a從而抑制肝癌細胞的增殖功能。本研究提示,在人滋養(yǎng)細胞系HTR8/SVneo中l(wèi)ncRNA-SNHG12可負向調(diào)控miR-30a-3p的表達;而進一步的研究結果顯示,過表達SNHG12可提高HTR8/SVneo增殖能力(P<0.001);反之,滋養(yǎng)細胞增殖能力減弱(P<0.001)。盡管lncRNA-SNHG12低表達可引起滋養(yǎng)細胞增殖能力降低,但在滋養(yǎng)細胞系中改變SNHG12的表達是否能夠影響DNMT3a的表達?故課題組對miR-30a-3p的靶基因DNMT3a進行進一步研究,結果提示:抑制lncRNA-SNHG12的表達后,HTR8/SVneo細胞中的DNMT3a mRNA及蛋白水平均下降(P<0.001)。這與Chen等[21]的研究具有一致性。因此,本研究認為lncRNA-SNHG12可通過負向調(diào)控miR-30a-3p進而影響DNMT3a的表達,這可能是引起滋養(yǎng)細胞增殖功能改變的機制。

DNMT3a具有DNA甲基轉移酶活性,Branco等[22]發(fā)現(xiàn),母體缺失DNMT3a可導致胚胎第9.5天滋養(yǎng)層發(fā)育缺陷。DNMT3a與miRNA-30a-3p在3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)內(nèi)的種子序列可互補結合,兩者之間具有負性調(diào)控關系。結合本研究結果推測,在sPE患者胎盤組織中低表達的lncRNA-SNHG12對miRNA-30a-3p“分子海綿”樣作用減弱,導致sPE患者胎盤組織中miR-30a-3p表達異常升高,靶蛋白DNMT3a減低,引起滋養(yǎng)細胞的增殖功能減弱,進而參與到子宮螺旋動脈重塑異常這一過程,而胎盤發(fā)育缺陷最終誘發(fā)PE的發(fā)病。

綜上所述,本次研究證實lncRNA-SNHG12在sPE患者胎盤組織中表達下調(diào),參與了PE的發(fā)病,并可能通過miR-30a-3p/DNMT3a途徑影響滋養(yǎng)細胞的增殖功能。但該通路具體結合位點及機制仍未進行詳細闡述,后續(xù)我們將對其具體結合位點的機制進行研究。